CC BY
9DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-30-31-38 УДК 634.11:632.25
К. Ю. Песоцкая, А. Л. Лагоненко, А. Н. Евтушенков
ПЛЕЙОТРОПНЫЙ ЭФФЕКТ МУТАЦИИ В ГЕНАХ БИОСИНТЕЗА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
ER WINIA AMYLOVORA
Белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр-т Независимости, 4 e-mail: lagonenkoal@mail.ru
В данной работе нами был получен делеционный мутант Erwinia amylovora по генам waaC, waaD, waaF, waaL, wabK и wabM, кодирующим ферменты, участвующие в синтезе липополисахаридов наружной мембраны бактерий, а также изучено фенотипическое проявление полученной мутации. Показано, что полученный мутант обладает повышенной способностью к автоагрегации и формированию биопленок, однако характеризуется сниженной подвижностью и продукцией экзополисахарида левана. Кроме того, делеция генов биосинтеза липополисахаридов привела к утрате вирулентности мутантного штамма. Полученные нами данные указывают на важнейшую роль липополисахаридного слоя в вирулентности бактерий E. amylovora.
Ключевые слова: Erwinia amylovora, бактериальный ожог, биопленка, липополисахариды, делеционный мутант.
Введение
Известно, что микроорганизмы в естественной среде обитания существуют главным образом в сложно организованных микробных сообществах, получивших название «биопленки». Бактериальная биопленка представляет собой ассоциацию микроорганизмов, клетки которых прикреплены к поверхности и к друг другу и окружены полимерным матриксом. Обычно внеклеточный матрикс состоит из белков, экзопо-лисахаридов, липидов и внеклеточной ДНК и синтезируется клетками бактерий в биопленке. Образование биопленки предоставляет одиночным клеткам ряд преимуществ: бактерии становятся более устойчивыми к защитным системам растений, действию антибиотиков и изменениям условий окружающей среды [1, 2].
Формирование биопленок считается одним из основных условий для успешного развития бактериозов [3]. Бактериальный ожог — одно из самых опасных заболеваний растений семейства Rosaceae, вызываемое грамотрицательной бактерией Erwinia amylovora. Для Республики Беларусь и стран, входящих в Европейскую Организацию За-
щиты Растений, данный фитопатоген является карантинным объектом [4]. Несмотря на значительные усилия по борьбе с бактериальным ожогом во всем мире, болезнь по-прежнему вызывает большие потери урожая и гибель деревьев. Понимание молекулярных механизмов формирования биопленок бактериями E. amylovora позволит разработать эффективные подходы к контролю бактериального ожога.
У грамотрицательных бактерий липопо-лисахариды являются одним из важнейших компонентов внешней мембраны, обеспечивающих ее структурную целостность. Липо-полисахариды также обеспечивают адгезию клеток на различных поверхностях биотической и абиотической природы благодаря ориентации и расположению молекул ЛПС в клеточной стенке [5]. Кроме того, у Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Xanthomonas axonopodis pv. citri и представителей рода Shigella липополисахариды являются важнейшими факторами вирулентности [6-9]. В данной работе сделан акцент на изучении роли генов биосинтеза липополисахаридов в процессе формирования биопленок бактериями E. amylovora.
Материалы и методы
Использованные в работе штаммы бактерий и плазмиды представлены в таблице 1, использованные в работе праймеры представлены в таблице 2. Получение делеционного мутанта E. amylovora по генам, участвующим в образовании биопленок, проводилось методом «PCR-based one-step inactivation of chromosomal genes» [10].
Проверка вирулентности полученного де-леционного мутанта проводится на незрелых плодах груши по стандартной методике [11]. Способность клеток E. amylovora вызывать развитие реакции гиперчувствительности оценивается путем инфильтрации в листья табака.
Продукция левана клетками E. amylovora стандартно оценивается по измерению активности левансукразы—фермента, отвечающего за синтез полисахарида. После осаждения бак-
Примечание. KmR, ApR
териальных клеток к надосадочной жидкости добавляется LS-буфер (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,0; 2 М сахароза; 0,05% NN3) в соотношении 1:1. После инкубации при 28 оС в течение 24 часов измеряется оптическая плотность раствора при 600 нм [12].
Количественная оценка интенсивности формирования биопленок проводится методом, описанным в работе [13], с некоторыми модификациями. Ночная культура Е. ату^ога разводится средой инкубации до оптической плотности 0,05. Полученные суспензии вносятся в лунки стерильного 96-лу-ночного планшета и инкубируются при 28 °С в течение 48 и 72 часов. После окрашивания клеток биопленки 1%-ным раствором генци-анового фиолетового измеряется оптическая плотность при длине волны 595 нм. Значения пересчитываются на значения оптической
Таблица 1
Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм или плазмида Характеристика Источник
Штаммы Erwinia amylovora
Erwinia amylovora E2 Штамм дикого типа, выделен из побегов яблони в Мядельском районе в 2007 году Коллекция кафедры молекулярной биологии
E. amylovora E2 AwaaCDL-wabKM Ктк; Е2 AwaaCDFL-wabKM Это исследование
Плазмиды
pKD13 KmR, FRT cat FRT PS1 PS2 oriR6K rgbN [10]
pKD46 ApR, PBAD gam bet exo pSC101 oriTS [10]
— устойчивость к канамицину и ампициллину соответственно
Таблица 2
Использованные в работе праймеры
Праймер Последовательность (5'-3') Источник
Праймеры, использованные для мутагенеза целевых генов у E. amylovora
WaaF GCAAAACAGACGGATTTTGGACAAGAACATATCCACCTGAG-GATGGCGCAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCT Это исследование
WaaR ATGATTATCGTTACCGGCGGTGCTGGATTAATTGGTAGTAACAT-TATTAAATTCCGGGGATCCGTCGACC
Праймеры, использованные для подтверждения делеции целевых генов
WaaPF CCGCTCGAGACCGGGGCTGTGTTCACGTGTATCC Это исследование
Km1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT [10]
плотности культуры для каждой из лунок соответственно.
Способность клеток E. amylovora к автоагрегации определяется согласно методике, описанной у Kharadi et al. Клетки исследуемых штаммов выращиваются с аэрацией в течение 18 часов, после чего выдерживаются в условиях отсутствия аэрации в течение часа при 28 оС. Затем содержимое пробирок взбалтывается на лабораторном вортексе в течение 15 с. Фактор автоагрегации для клеток E. amylovora рассчитывается формуле:
Aa = ODj / OD0,
где OD0 — значение оптической плотности суспензии клеток до взбалтывания; OD1 — значение оптической плотности суспензии клеток после 15-секундного взбалтывания [14].
Для проведения тестов на подвижность клеток бактерий используется полноценная и минимальная полужидкие агаризованные среды. Ночная культура штаммов E. amylovora, предварительно ресуспендированная в Na-фосфатном буфере (pH 7,4), наносится на поверхность необходимой агаризованной среды. Диаметр макроколонии бактерий учитывается через 24, 48 и 72 часа инкубации при 28 оС [12].
Статистическая обработка результатов проводится в программе GraphPad Prism 8. Для оценки достоверности различий применяется t-критерий Стьюдента для независимых выборок в модификации Уэлча (сравнение средних без какого-либо предположения о равенстве дисперсий). Различия считались значимыми при уровне р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Обзор литературных данных, а также биоинформационный анализ вовлеченных в формирование биопленок генов у бактерий, принадлежащих к порядку Enterobacterales, позволил выявить в геноме E. amylovora Е2 гены, потенциально вовлеченные в образование биопленки. Гены waaC, waaD, waaF, waaL, wabK, wabM кодируют ферменты, участвующие в синтезе липополисахаридов — основных компонентов внешней мембраны грамотрицательных бактерий [15, 16]. В геноме возбудителя бактериального ожога эти гены локализованы на участке хромосоме с 114401 по 120761 н. (рис. 1).
Удобным методом получения делеций интересующих генов является «PCR-based one-step inactivation of chromosomal genes», предложенный Даценко и Воннером для бактерий E. coli. Для инактивации генов waaCDFL-wabKM на первом этапе работы были сконструированы праймеры для амплификации гена устойчивости к канамицину в составе плазмиды pKD13, несущие на 5'-конце последовательности (50 н.), соответствующие началу или концу делетируемой области генома E. amylovora. Полученные с помощью таких праймеров ПЦР-продукты были трансформированы в клетки E. amylovora E2, несущие хелперную плазмиду pKD46 и выращенные в условиях индукции рекомбиназы. В результате проделанной работы был отобран устойчивый к канамицину штамм. Наличие делеции генов биосинтеза липополисахаридов было подтверждено методом ПЦР с праймерами к областям, фланкирующим делецию, а также с внутренним праймером к гену устойчивости к канамицину (Km1).
wabM ш -я ^ wabK waaD
g ly cosy 11 ransFe rase O-antigen ligase Family protein g ly cosy 11 ra n sfe ra se lipopolysaccharide heptosyl ADP-heptose-LPS heptosyl tra ADP-glyceromanno-heptos
пзеее 114бве 4 115866 псвев 117б9в наввб
Glycoside deacetylase glycosyltransferase family 9 pro
aminoglycoside 3' О о
divergent polysaccharide d muiein hydrolase activator EnvC rhodanes
Рис. 1. Структура участка хромосомы E. amylovora E2, содержащего гены биосинтеза ядра ЛПС. В результате мутагенеза с использованием метода «PCR-based one-step inactivation of chromosomal genes» гены waaCDFL-wabKM были замещены на ген устойчивости к канамицину
Ранее, в работе C. Berry et al., был получен штамм E. amylovora, мутантный по гену waaL. Данный ген ответственен за синтез О-антиген-лигазы, единственного из кодируемых waa ло-кусом ферментов, отвечающего за присоединение О-антигена к внешнему ядру липида А молекулы липополисахарида. Было показано, что клетки E. amylovora AwaaL обладают сниженной вирулентностью [17]. Для изучения эффекта делеции всего оперона waaCDFL-wabKM на вирулентность Erwinia amylovora, суспензии клеток штаммов E2 и AwaaCDFL-wabKM были инокулированы в ткани незрелых плодов груши. Как видно из рисунка 2, клетки делеционного мутанта полностью авирулент-ны (не способны вызывать симптомы бактериального ожога).
В реализации процесса адгезии и образования биопленок важную роль играет строение клеточной стенки бактерий, наличие пилей и фимбрий и продукция клетками микроорганизмов экзополисахаридов. Начальный этап формирования биопленок представляет собой обратимую адгезию клеток на поверхности биотической или абиотической природы, опосредованную наличием во внешней мембране липополиса-харидов, а также пилей. Экзополисахариды,
Рис. 2. Симптомы бактериального ожога на плодах и цветках груши при искусственном заражении клетками Б. amylovora Е2 и AwaaCDFL-wabKM
в свою очередь, обеспечивают стабилизацию трехмерной структуры уже зрелой биопленки, а также защищают бактериальные клетки от осмотического стресса, изменений pH окружающей среды и воздействия УФ-излучения [18]. Клетки E. amylovora продуцируют два типа экзополисахаридов, амиловоран и леван. По имеющимся в литературе данным штамм E. amylovora Alse, не способный синтезировать леван, обладал сниженной вирулентностью, низкой автоа-грегационной активностью и не образовывал биопленки. Также было показано, что клетки данного штамма располагались в мезофилле листьев растений-хозяев, в отличие от штаммов дикого типа, локализующихся в сосудах ксилемы. Данный факт может свидетельствовать о том, что правильная локализация клеток ведет к надлежащему развитию симптомов бактериального ожога, что не было продемонстрировано для клеток E. amylovora Alse [19].
Эксперименты по оценке количества левана показали, что уровень продукции этого экзо-полисахарида клетками AwaaCDFL-wabKM снижен более чем в два раза по сравнению с E2 (рис. 3).
На следующем этапе работы нами была изучена подвижность клеток бактерий AwaaCDFL-wabKM и E2 на питательных средах различного состава (рис. 4).
Как видно из рисунка 4, при выращивании E. amylovora как на минимальной среде М9, так и на полноценной среде LB, подвижность клеток мутанта была значительно снижена по сравнению с бактериями дикого типа. Сходные данные были получены при изучении эффекта мутаций по генам биосинтеза ЛПС у других бактерий. Известно, что штаммы Salmonella enterica serovar Typhimurium, не способные синтезировать молекулы липополисахаридов, обладают сниженной подвижностью клеток, однако продуцируют большое количество слизи. [20]. Бактерии Acinetobacter baumannii, Burkholderia сenocepacia, Pectobacterium atrosepticum и Pseudomonas aeruginosa с нарушенной структурой ЛПС также обладают сниженной подвижностью [21-23].
Учитывая тот факт, что инактивация генов биосинтеза липополисахаридов приво-
AwaaCDL-wabKM
Рис. 3. Продукция полисахарида левана клетками E. amylovora Е2 и AwaaCDFL-wabKM. Уровень значимости P был рассчитан с использованием теста Уэлча (****P < 0,0001)
дит к снижению подвижности клеток, было интересно изучить эффект такой мутации на способность образовывать биопленки. Исходя из данных, представленных на рисунке 5, через 72 часа инкубации образование биопленок у делеционного мутанта достоверно увеличено по сравнению с клетками исходного штамма.
В настоящее время известно, что образование биопленок бактериальными клетками — многоступенчатый процесс, включающий в себя обратимое и необратимое прикрепление планктонных клеток к субстрату, созревание и рост уже зрелой биопленки [2, 3]. Поэтому на следующем этапе работы мы исследовали
способность клеток мутантного штамма к автоагрегации как первому этапу в формировании бактериальной биопленки. Как видно из представленных данных, клетки мутанта AwaaCDFL-wabKM агрегировали ожидаемо эффективнее, чем контроль (рис. 6).
Важная роль ЛПС в процессе формирования бактериальных биопленок была показана во многих исследованиях. Например, при инактивации генов waaF, waaG, waaP, waaC, waaO, waaR, waaQ, waaY у бактерий Escherichia coli была выявлена сниженная способность к образованию биопленок, а также повышенная способность к автоагрегации [24]. В другом исследовании было выяснено, что по меньшей мере восемь генов, отвечающих за синтез липополиса-харидов наружной мембраны E. coli, принимают участие в процессе образования биопленок клетками бактерий [25]. Противоположный эффект делеции гена waaC на образование биопленок был описан у Shigella flexneri. В результате проделанной работы авторами было показано, что клетки мутанта AwaaC обладали высокой адгезией клеток и формированием биопленок на различных абиотических поверхностях. Также мутантный штамм характеризовался повышенной вирулентностью in vitro, в то время как in vivo клетки оказались не способны вызвать симптомы заболевания [26]. Необходимо также упомянуть о роли ЛПС в формировании биопленок у Pseudomonas aeruginosa [27].
Рис. 4. Подвижность бактерий на полноценной среде (А) и минимальной среде М9 (Б). Уровень значимости Р был рассчитан с использованием теста Уэлча (****р < 0,0001)
U) с
Ё
'га
(Л _
, . ю Ф ю
О Û
> о
га
(Л fr
О
8п
6-
4-
2-
NS
i
48h
72h
□ wt
□ AwaaCDL-wabKM
Рис. 5. Интенсивность формирования биопленок клетками штамма E. amylovora AwaaCDFL-wabKM и штаммом дикого типа (E2). Уровень значимости P был рассчитан с использованием теста Уэлча (NS — нет достоверных различий; ****P < 0,0001)
2.On
s з-
ГС с i
¡5 1-5Н
о.
го о
I-
0Q ГО
а о ь
ГО в
1.0-
0.5-
0.0
I
wt
AwaaCDL-wabKM
Рис. 6. Интенсивность автоагрегации клеток исследуемого штамма E. amylovora AwaaCDFL-wabKM. Уровень значимости P был рассчитан с использованием теста Уэлча (****P < 0,0001)
Заключение
В ходе анализа геномной последовательности бактерии Erwinia amylovora Е2 были выявлены и аннотированы гены биосинтеза ли-пополисахаридов (waaC, waaD, waaL, waaF, wabK, wabM), потенциально связанные с пато-генностью. Делеция генов waaCDFL-wabKM привела к заметным изменениям в фенотипе бактерий E. amylovora. Клетки AwaaCDFL-wabKM обладали не только сниженной под-
вижностью и продукцией левана, но оказались авирулентными при искусственном заражении плодов груши. Изменение внешней мембраны также привело повышению способности E. amylovora к формированию биопленок и автоагрегации. Липополисахариды фитопато-генных бактерий могут играть важную роль в супрессии защитного ответа растения на инфекцию, обеспечивать защиту клеток от антимикробных веществ и активных форм кислорода. Полученные нами данные указывают на важнейшую роль липополисахаридного слоя в вирулентности бактерий E. amylovora.
Список использованных источников
1. Castiblanco, L. F., Sundin, G. W. New insights on molecular regulation of biofilm formation in plant-associated bacteria // Journal of Integrative Plant Biology. - 2016. - Vol. 58, № 4. - P. 362-372.
2. Dufour, D. Bacterial biofilm: structure, function, and antimicrobial resistance / D. Dufour, V. Leung, C.M. Lévesque // Endodontic Topics. - 2010. - Vol. 22, № 1. - Р. 2-16.
3. Kharadi, R. R., Sundin, G.W. Dissecting the process of xylem colonization through biofilm formation in Erwinia amylovora // Journal of Plant Pathology. - 2020. - P. 1-9.
4. Садовская, О. В. Характеристика нового т-подобного бактериофага Erwinia amylovora / О. В. Садовская [и др.] // Доклады НАН Беларуси. - 2012. - Т. 56, № 3. - С. 83-87.
5. Enhanced Biofilm Formation by Escherichia coli LPS Mutants Defective in Hep Biosynthesis / R. Nakao [et al.] // PLOS ONE. - 2012. -Vol. 7, № 12. - P. 1-13.
6. Skurnik, M. Yersinia enterocolitica lipopolysaccharide: genetics and virulence / M. Skurnik, P. Toivanen // Trends in Microbiology. - 1993. - Vol. 1, № 4. - P. 148-152.
7. Modifications of Xanthomonas axonopodis pv. citri Lipopolysaccharide Affect the Basal Response and the Virulence Process during Citrus Canker / S. Petrocelli [et al.] // PLOS ONE. -2012. - Vol. 7, № 7. - P. 1-15.
8. Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity / G.B. Pier // International Journal of Medical Microbiology. - 2007. - Vol. 297, № 5. - P. 277-295.
9. Marteyn, B. S. Shigella: a model of virulence regulation in vivo / B. S. Marteyn, A. D. Gazi, P. J. Sansonetti // Gut Microbes. - 2012. - Vol. 3, № 2. - P. 104-120.
10. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products // PNAS. -2000. - Vol. 97, № 12. - P. 6640-6645.
11. Zhao, Y. Construction and analysis of pathogenicity island deletion mutants of Erwinia amylovora / Y. Zhao, G. W. Sundin, D. Wang // Can. J. Microbiol. - 2009. - Vol. 55, № 4. - P. 457-464.
12. Wang, D. AmyR Is a Novel Negative Regulator of Amylovoran Production in Erwinia amylovora / D. Wang [et al.] // PLOS ONE. -2012. - Vol. 7, № 7. - P. 1-11.
13. Castiblanco, L. F., Sundin, G.W. Cellulose production, activated by cyclic di-GMP through BcsA and BcsZ, is a virulence factor and an essential determinant of the three-dimensional architecture of biofilms formed by Erwinia amylovora Ea1189 / Molecular Plant Pathology. -2018. - Vol. 19, № 1. - P. 90-103.
14. Kharadi, R. R., Sundin, G. W. Physiological and Microscopic Characterization of Cyclic-di-GMP-Mediated Autoaggregation in Erwinia amylovora // Frontiers in Microbiology. - 2019.
15. Molecular and structural basis of inner core lipopolysaccharide alterations in Esche-richia coli: incorporation of glucuronic acid and phosphoethanolamine in the heptose region / G. Klein [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 2013. - Vol. 288, № 12. - P. 8111-8127.
16. Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa / J. D. King [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 2009. - Vol. 15, № 5. - P. 261-312.
17. Effect of a waaL mutation on lipopolysaccharide composition, oxidative stress survival, and virulence in Erwinia amylovora / M. C. Berry [et al.] // FEMS Microbiology Letters. -2009. - Vol. 291, № 1. - P. 80-87.
18. The Role of Bacterial Biofilms and Surface Components in Plant-Bacterial Associations / P. C. Bogino [et al.] // International Journal of
Molecular Sciences. - 2013. - Vol. 14, № 8. -P. 15838-15859.
19. Contribution of Erwinia amylovora Exo-polysaccharides Amylovoran and Levan to Biofilm Formation: Implications in Pathogenicity / J. M. Koczan [et al.] // Phytopathology. - 2009. -Vol. 99, № 11. - P. 1237-1244.
20. Genetics of Swarming Motility in Salmonella enterica Serovar Typhimurium: Critical Role for Lipopolysaccharide / A. Toguchi [et al] // JOURNAL OF BACTERIOLOGY. -2000. - Vol. 182, № 22. - P. 6308-6321.
21. Maldonado, R. F. Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection/ R. F. Maldonado, I. Sa-Cor-reia, M. A. Valvano // FEMS Microbiology Letters. - 2016. - Vol. 40, № 4. - P. 480-493.
22. Truncation in the core oligosaccharide of lipopolysaccharide affects flagella-mediated motility in Pseudomonas aeruginosa PAO1 via modulation of cell surface attachment / T. Lind-hout [et al.] // Microbiology. - 2009. - Vol. 155, № 10. - P. 3449-3460.
23. Extracellular Stress and Lipopolysaccharide Modulate Acinetobacter baumannii Surface-Associated Motility / C. N. McQueary [et al.] // The Journal of Microbiology. - 2012. -Vol. 50, № 3. - P. 434-443.
24. Influence of Core Oligosaccharide of Li-popolysaccharide to Outer Membrane Behavior of Escherichia coli / Z. Wang [et al.] // Marine Drugs. - 2015. - Vol. 13, № 6. - P. 3325-3339.
25. A Genome-wide Approach to Identify the Genes Involved in Biofilm Formation in E. coli / E. T. E. Niba [et al.] // DNA Research. - 2007. -Vol. 14, № 6. - P. 237-246.
26. Characterization of a biofilm-forming Shi-gellaflexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis / D. Xu [et al.] // PeerJ. - 2016. -Vol. 14, № 4. - P. 1-19.
27. Expression of the lipopolysaccharide biosynthesis gene lpxD affects biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa / D. Xu [et al.] // Archives of Microbiology. - 2015. - Vol. 197, № 2. - P. 135-145.
K. Yu. Pesotskaya, A. L. Lagonenko, A. N. Evtushenkov
PLEIOTROPIC EFFECT OF MUTATION IN THE GENES INVOLVED IN THE BIOSYNTHESIS OF LIPOPOLYSACCHARIDES OF ERWINIA AMYLOVORA PHYTOPATHOGENIC BACTERIA
Belarusian State University 4 Nezavisimosty Ave., 220030 Minsk, Republic of Belarus e-mail: lagonenkoal@mail.ru
In this study, we constructed Erwinia amylovora deletion mutant by waaC, waaD, waaF, waaL, wabK and wabM genes, coding enzymes involved in the synthesis of lipopolysaccharides of the bacteria outer membrane, and investigated the phenotypic manifestation of the resulting mutation. It was demonstrated that the resulting mutant has an increased ability to autoaggregation and biofilms formation, but is characterized by the reduced mobility and levan exopolysaccharide production. In addition, the deletion of genes of lipopolysaccharides biosynthesis led to the loss of the mutant strain virulence. The data obtained indicate the most important role the lipopolysaccharide layer plays in the virulence of E. amylovora bacteria.
Keywords: Erwinia amylovora, fire blight, biofilms, lipopolysaccharides, deletion mutant.
Дата поступления статьи: 23 февраля 2021 г.
