CC BY
10УДК 634.11:632.25
К. Ю. Песоцкая1, А. Л. Лагоненко2, А. Н. Евтушенков1
ВЛИЯНИЕ ДЕЛЕЦИИ ГЕНА OHRR НА ПРОДУКЦИЮ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ ФИТОПАТОГЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ
ER WINIA AMYLOVORA
белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр-т Независимости, 4
2ООО «Альгимед Техно» Республика Беларусь, 220090, г. Минск, Логойский тракт, 22/1 e-mail: lagonenkoal@mail.ru
Белки семейства MarR (Multiple Antibiotic Resistance) составляют группу транскрипционных регуляторов, изменяющих экспрессию генов, отвечающих за вирулентность, стрессовые реакции, формирование биопленок и выведение из бактериальных клеток широкого спектра токсичных веществ: антибиотиков, фенольных соединений, активных форм кислорода. В данном исследовании был сконструирован делеционный мутант Erwinia amylovora по гену транскрипционного регулятора OhrR и осуществлены его фенотипическая и фитопатологи-ческая характеристики. Бактерии E. amylovoraAohrR обладали сниженной вирулентностью по отношению к ве-гетирующим растениям груши, сниженной продукцией экзополисахарида левана и сниженной выживаемостью при обработке клеток перекисью водорода. Кроме того, клетки мутанта синтезировали большее количество экзополисахарида амиловорана по сравнению с клетками бактерий дикого типа. В совокупности полученные результаты идентифицируют OhrR как новый регулятор вирулентности Erwinia amylovora.
Ключевые слова: Erwinia amylovora, транскрипционный регулятор OhrR, факторы вирулентности, экзопо-лисахариды, окислительный стресс, перекись водорода.
Введение
В естественной среде обитания растения подвергаются воздействию стрессоров биотической (фитопатогенные инфекции и др.) и абиотической (засуха, засоление почвы, экстремальные температуры) природы. Устойчивость растений к воздействию патогена обуславливается интенсификацией процессов генерации активных форм кислорода (АФК). Обычно в клетках растений АФК образуются в качестве побочных продуктов реакций в процессе метаболизма (например, при фотосинтезе) [1]. При инфицировании патогеном устойчивых к нему растений наблюдается резкое увеличение образования АФК, а также оксида азота и салициловой кислоты, что приводит к развитию реакции сверхчувствительности. В некоторых случаях образование АФК в растительных клетках необходимо для успешного установления и развития заболевания (например, бактериального ожога плодовых культур, вызываемого бактерией Еш1та ату^ога) [2].
Способность поддерживать внутриклеточные концентрации токсичных АФК на оптимальном уровне необходима для всех аэробных форм жизни. У бактерий, как и у других организмов, АФК продуцируются в ходе процесса аэробного метаболизма, что требует наличия мощной антиоксидантной системы, обезвреживающей как собственные, так и внешние АФК. Клетки бактерий могут подвергаться кратковременному воздействию высоких концентраций АФК, что обусловлено защитным ответом растений при их инфицировании патогенным микроорганизмом. Именно поэтому в бактериальных клетках функционируют белки-регуляторы транскрипции, способные детектировать АФК в окружающей среде и запускать ответную реакцию на окислительный стресс. Одними из наиболее изученных среди таких регуляторов являются белок OhrR, относящийся к семейству транскрипционных регуляторов MarR; белок OxyR, принадлежащий к семейству транскрипционных регуляторов LysR; белок PerR, принадлежащий к семей-
ству транскрипционных факторов Fur. Домены белков OxyR и PerR способны к селективному распознаванию малых количеств H2O2, в то время как домены регулятора OhrR распознают наличие органических гидропероксидов (ROOH) и гипохлорита натрия (NaOCl) путем обратимого окисления определенных остатков цистеина. Наряду с этим, данные транскрипционные регуляторы принимают участие в преодолении патогеном иммунитета растений-хозяев, а также в процессах формирования биопленок и механизмах резистентности клеток к различным антибиотикам [3]. Роль транскрипционного регулятора OhrR в той или иной степени была выяснена у Dickeya zeae, Xanthomonas campestris pv. phaseoli, Chromobacterium violaceum, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens [4, 5, 6, 7, 8].
Целью данного исследования явилась фи-зиолого-биохимическая, молекулярно-био-логическая, а также фитопатологическая характеристика штамма Етша ату^ога, мутантного по гену транскрипционного регулятора OhrR.
Материалы и методы
Использованные в исследовании штаммы бактерий, плазмиды и праймеры приведены в таблицах 1 и 2. Бактерии выращивались при 28 °С в полноценной питательной среде LB и синтетической минимальной среде М9 с добавлением глицерина (2 мл/л) в качестве источника углерода. Состав среды LB (г/л): пептон — 10; дрожжевой экстракт—5; ШС1 — 8,5. Состав среды М9 (г/л): Ш2НР04 х 7Н20 — 12,8; КН2Р04 — 3; КН4С1 — 1,0; ШС1 — 0,5; MgSO4 х 7Н20 — 0,246; СаС12 — 0,011 [9].
Таблица 1
Использованные в работе штаммы бактерий и плазмиды
Штаммы, плазмиды Характеристика Источник или ссылка
Штаммы Erwinia amylovora
E. amylovora E2 Штамм дикого типа, выделен из Malus sp. в Беларуси в 2007 г. Коллекция кафедры молекулярной биологии
E. amylovora AohrR AohrR мутант, KmR Это исследование
Плазмиды
pKD46 ApR, PBAD gam bet exo pSC101 oriTS [10]
pKD13 KmR, FRT cat FRT PS1 PS2 oriR6K rgbN [10]
Примечание. Ктк, Арк — устойчивость к канамицину и ампициллину соответственно
Таблица 2
Использованные в работе праймеры
Название праймера Последовательность (5'-3') Назначение/ссылка
OhrRF TTAACCATTAAGGTTATCACGTAGCATTTCAAGCTC-GCTTTTCAGCGATTGCGATTGTGTAGGCTGGAGCT Внесение делеции в ген ohrR
OhrRR ATAGTGCACTATCTATCATCTTAGCATGATGACC-GATAAAAACGATAAGAATTCCGGGGATCCGTCGACC Внесение делеции в ген ohrR
OhrPRF CCGCTCGAGTCCGGCTTCAGCATGAGCTTTTCTG Детекция делеции гена ohrR
Km1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT Детекция делеции гена ohrR [10]
Поиск генов, кодирующих транскрипционные регуляторы MarR-семейства в геноме E. amylovora Е2 (код доступа в GenBank NZ_ CP024970.1) осуществлялся с использованием программы SigmoID [11]. Поиск гомологичных последовательностей в базах данных осуществлялся с помощью пакета программ BLAST [12].
Для получения делеционного мутанта E. amylovora по гену ohrR была использована техника «PCR-based one-step inactivation of chromosomal genes» (Datsenko and Wanner, 2000).
Для искусственного заражения бактериями Erwinia amylovora использовались однолетние растения груши, выращенные ex vivo на базе отдела биотехнологии РУП «Институт плодоводства НАН Беларуси». У каждого растения самый молодой лист разрезался поперек (затрагивая центральную жилку) ножницами, предварительно погруженными в суспензию клеток E. amylovora (OD600 = 0,1) [13]. Ино-кулированные растения инкубировались при 25 °С, относительной влажности 70%, 16-и часовом световом фотопериоде. Учет результатов проводился на 6-ые, 9-ые и 12-ые сутки с момента заражения. Интенсивность развития заболевания выражалась в процентном отношении пораженной некрозом части побега от его общей длины.
Уровень синтеза экзополисахарида амило-ворана определялся путем измерения мутности опытного раствора при взаимодействии хлорид-ионов цетилпиридиума (CPC) с карбоксильной группой глюкуроновых кислот в структуре амиловорана, что вызывает преципитацию молекул экзополисахарида. Для этого суспензия бактериальных клеток осаждалась центрифугированием при 10 000 g, после чего к супенатанту добавлялся раствор хлорид цетилпиридиниума в концентрации 50 мг/мл. Оптическая плотность раствора измерялась при длине волны 600 нм. Полученные значения пересчитывались на значения оптической плотности бактериальной культуры для каждой пробы соответственно [13].
Продукция экзополисахарида левана клетками E. amylovora оценивалась по активности фермента левансукразы, отвечающего за синтез полисахарида. После осаждения бактериальных клеток к надосадочной жидкости добавлялся LS-буфер (50 мМ K-фосфатный
буфер, pH 7,0; 2М сахароза; 0,05% №N3) в соотношении 1 : 1. После инкубации проб при 28 °С в течениие 24 ч измерялась оптическая плотность раствора при 600 нм. Полученные значения пересчитывались на значения оптической плотности бактериальной культуры для каждой пробы соответственно [14].
Изучение продукции целлюлозы клетками дикого типа и мутантных штаммов Е. ату^ога осуществлялось с использованием красителей Конго красный и Кумасси бриллиантовый синий G-250. Ночные культуры исследуемых штаммов наносились на поверхность агаризованной среды (1,5%-ный LB-агар без добавления №аС1), содержащей красители в соответствующей концентрации. Учет результатов проводился визуально после инкубации в течение 24 ч при 28 °С [15].
Количественная оценка интенсивности формирования биопленок проводилась методом, описанным в работе [15], с некоторыми модификациями. Ночная культура Е. ату^ога разводилась средой инкубации (полноценной средой LB) до оптической плотности 0,05. Полученные суспензии вносились в лунки стерильного 96-луночного планшета и инкубировались при 28 °С в течение 48 и 72 ч. Для окрашивания клеток биопленки использовался 1%-ный раствор красителя генцианового фиолетового. Для экстракции связавшегося красителя лунки планшета заполнялись 96% этанолом, после чего измерялась оптическая плотность при длине волны 595 нм. Полученные значения пересчитывались на значения оптической плотности культуры для каждой из лунок соответственно.
Подвижность клеток Е. ату^ога изучалась с использованием полноценной полужидкой агаризованной среды LB. Суспензия бактериальных клеток в объеме 10 мкл наносилась на поверхность необходимой агаризованной среды. Диаметр макроколонии бактерий учитывался через 24, 48 и 72 ч инкубации при 28 °С [16].
Влияние перекиси водорода на выживаемость клеток исследуемых штаммов Е. ату1о-voгa оценивалось по количеству колоний микроорганизмов, выросших после обработки клеток перекисью водорода в соответствующей концентрации, по сравнению с контролем (без обработки Н2О2). Количество коло-
ниеобразующих единиц определяли методом серийных разведений после 48 ч роста на ага-ризованной полноценной среде при 28 °С [17].
Определение чувствительности штаммов E. amylovora к различным концентрациям CdCl2 проводилось диско-диффузионным методом. Для этого 300 мкл суспензии бактериальных клеток, находящихся в экспоненциальной фазе роста (OD600 ~ 0,3-0,4), вносили в пробирки, содержащие 3 мл расплавленного и охлажденного до 50 °С 0,7% LB-агара. Затем содержимое пробирок равномерно распределялось по поверхности чашки Петри, содержащей 1,5% LB-агар. После высушивания при комнатной температуре в течение 15 мин на поверхность 0,7% агара помещались бумажные диски, пропитанные растворами различной концентрации CdCl2 (10 мкМ - 0,5 М). Зону ингибирования, образовавшуюся после инкубации в течение 24 ч при 28 °С, измеряли в миллиметрах [17, 18].
Исследования влияния ионов кадмия на устойчивость клеток E. amylovora к перекиси водорода проводилось по методике, описанной в работе [18] с некоторыми модификациями. К суспензиям клеток, находящихся в экспоненциальной фазе роста, вносился раствор CdCl2 в концентрации 75 мкМ, после чего клетки инкубировались при 28 °С 2 ч. Затем к клеткам E. amylovora добавлялся раствор H2O2 в соответствующей концентрации. Выживаемость клеток исследуемых штаммов оценивалось по количеству колоний микроорганизмов, выросших после обработки клеток перекисью водорода, по сравнению с контролем (без обработки Н2О2).
Принцип количественного определения активности каталазы основан на захвате неионо-генным ПАВ Triton X-100 (ТХ) образующихся в процессе разложения перекиси водорода молекул молекулярного кислорода, выделяющихся в виде пузырьков, которые визуализируются ТХ в виде пены. В каждую пробирку вносился 30% раствор перекиси водорода, 1% раствор ТХ и суспензия клеток E. amylovora, предварительно ресуспендированных в 0,5* Na-фосфатном буфере (pH 7,4) в соотношении 1 : 1 : 1. Высота пены, образованной в пробирках, измерялась в миллиметрах. Активность каталазы рассчитывалась с помощью калибровочного графика с использованием коммерче-
ской каталазы (Sigma-Aldrich) и выражалась в единицах активности (U) (единица каталаз-ной активности соответствует деструкции 1 мкмоль H2O2 в минуту при 25 °С, pH 7,0) [19].
Статистическая обработка результатов проводилась в программе GraphPad Prism 8. Для проверки отклонения распределения от нормального применяли обладающий наибольшей мощностью тест Шапиро-Уилка. При выявлении нормального распределения для оценки достоверности различий был применен t-критерий Стьюдента для независимых выборок в модификации Уэлча (сравнение средних без какого-либо предположения о равенстве дисперсий). При выявлении распределения, отличного от нормального, для оценки достоверности различий был применен U-критерий Манна-Уитни. Различия считались значимыми при уровне р <0,05.
Результаты и обсуждение
Как известно, транскрипционные регуляторы, принадлежащие к MarR-семейству (Multiple Antibiotic Resistance Regulator), широко распространены у бактерий и архей. Предыдущие исследования показали, что представители семейства регулируют вирулентность многих патогенных бактерий животных и растений (например, SlyA Salmonella enterica и Dickeya zeae, MarR и MexR Escherichia coli, PecS Dickeya dadantii, SarZ и MepR Staphylococcus aureus, MarR Streptococcus pneumoniae и др.) [20, 21, 22]. Геном Erwinia amylovora кодирует несколько транскрипционных факторов семейства MarR.
Обзор литературных данных, а также биоинформационный анализ генома Erwinia amylovora E2 позволил выявить четыре гена, кодирующие регуляторы MarR-семейства: marR (координаты в геноме 1,533,551..1,533,982 п. н.), mprA (2,834,616..2,835,146 п. н.), slyA (1,802,653..1,803,090 п. н.) и ohrR. Ген ohrR кодирует белок, состоящий из 155 а. о., массой 17,6 кДа. В геноме возбудителя бактериального ожога этот ген локализован на участке хромосоме с 3 717 873 по 3 718 340 п. н. (рис. 1). Как правило, OhrR представляет собой белок-репрессор транскрипции. В нормальных условиях он подавляет экспрессию гена ohr, кодирующего тиоловую пероксида-зу — фермент, катализирующий реакцию вос-
Рис. 1. Структура участка хромосомы E. amylovora E2, содержащего ген ohrR (выделен красным цветом). В результате мутагенеза с использованием метода «PCR-based one-step inactivation of chromosomal genes» ген ohrR был замещен на ген устойчивости к канамицину neoR (выделен голубым цветом)
становления органических гидропероксидов до менее токсичных для клетки спиртов. При попадании в бактериальные клетки токсичных веществ (ЯООН или №ОС1) происходит инактивация OhrR посредством окисления консервативных для МагЯ-семейства остатков цистеина в ^концевом домене белка, что препятствует связыванию OhrR с ДНК и приводит к дерепрессии генов-мишеней [3, 5]. Описанный механизм работы свойственен большинству видов бактерий, для которых было выявлено наличие белка OhrR (за исключением Streptomyces соеИсо1ог) [3], однако у фитопатогенной бактерии Е^1та ату^ога роль данного регулятора по-прежнему остается неясной.
Для инактивации гена ohrR были сконструированы праймеры О^ЯГ и О^ЯЕ. для ам-
плификации гена устойчивости к канамицину в составе плазмиды pKD13, несущие на 5'-кон-це последовательности (50 н.) соответствующие началу или концу делетируемой области генома Етта ату^ога (табл. 2). Полученные с помощью таких праймеров ПЦР-продук-ты были трансформированы в клетки Еш1та ату^ога Е2, несущие хелперную плазмиду pKD46 и выращенные в условиях индукции рекомбиназы. В результате проделанной работы был отобран штамм устойчивый к ка-намицину. Наличие делеции гена ohrR было подтверждено ПЦР с праймером О^РЯГ к области, фланкирующей делецию, а также с внутренним праймером к гену устойчивости к канамицину Кт1 (табл. 2, рис. 2).
Как видно из приведенных данных, в реакции был получен ПЦР-продукт размером око-
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации с использованием праймеров OhrPRF и Km1
М1-маркер молекулярного веса GeneRuler DNA Ladder Mix (100-10 000 п. о., Thermo Scientific), М2 — маркер
молекулярного веса DNA Molecular Weight Marker VI (154-2 176 п. о., Roche), 1 — ДНК штамма E. amylovora E2 дикого типа, 2 — ДНК штамма E. amylovora AohrR, 3 — контроль без матрицы
ло 650 п. н., что соответствует ожидаемому.
На следующем этапе работы мы исследовали роль белка OhrR в вирулентности клеток Е. ату1о\от. Как видно из рисунка 3, при заражении растений груши мутантным штаммом Е. ату1оуот /\ohrR развитие симптомов бактериального ожога было значительно замедле-
но к девятым и двенадцатым суткам. Сходные данные были получены в работе [4]. Делеция гена ohrR у Dickeya zeae привела к снижению вирулентности клеток при искусственном заражении ими семян риса, клубней картофеля и корней редьки.
Как известно, биопленки представляют
Рис. 3. Интенсивность развития бактериального ожога на молодых растениях груши (Рггш' sp.) при заражении клетками Е. ату1оуога Е2 и Е. ату1оуога /\ohrR. (и-критерий Манна-Уитни). № — нет достоверных различий (Р >0,05); *Р <0,05; "Р <0,01
собой сообщества разного рода микроорганизмов, клетки которых прикреплены к различной биотической и абиотической поверхности и погружены в биополимерный матрикс [23]. Процесс их образования традиционно включает в себя несколько стадий: начальное и обратимое прикрепление клеток к субстрату (адгезия); необратимое прикрепление клеток к субстрату; созревание и рост зрелой биопленки и формирование ее трехмерной структуры; дисперсия одиночных планктонных клеток, способных образовать новую колонию. Адгезия считается ключевым этапом в процессе образования биопленки. Однако первичный контакт с субстратом не предполагает окончательного закрепления на нем микроорганизмов и опосредуется, как правило, обратимыми электростатическими, гидрофобными и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями между клетками и поверхностью [23, 24]. Исходя из этих данных, нами была изучена способность клеток мутантного штамма образовывать биопленки. Как видно из рисунка 4, на полноценной среде LB при инкубации кле-
ток исследуемого штамма Е. ату1оуот AohrR в течение 72 ч способность формировать биопленки была значительно выше, чем у клеток штамма дикого типа.
В формировании биопленок одну из ведущих ролей играют экзополисахариды, липопо-лисахариды, а также поверхностные структуры бактериальных клеток: жгутики, фибрии, пили, обеспечивающие подвижность, необходимую для биопленкообразования. Они отвечают за необратимое прикрепление бактериальных клеток к различным субстратам [24]. Экзополисахариды, в свою очередь, обеспечивают стабилизацию трехмерной структуры уже зрелой биопленки, а также защищают бактериальные клетки от осмотического стресса, изменений рН окружающей среды и воздействия УФ-излучения [25]. Клетки Е. ату1оуот продуцируют несколько экзополисахаридов: амиловоран, леван и целлюлозу. Эксперименты по оценке количества амиловорана показали, что уровень продукции этого экзо-полисахарида клетками Е. ату1оуот AohrR повышен в два раза по сравнению с Е2. Так-
Рис. 4. Интенсивность формирования биопленок клетками AohrR и штамма дикого типа (^критерий Стьюдента в модификации Уэлча). № — нет достоверных различий (Р >0,05); "Р <0,01
же у мутантного штамма нами было выявлено некоторое снижение синтеза левана. Количество целлюлозы, продуцируемое клетками Е. ату^вга АвИ^, не отличалось от такового у клеток Е. ату^вга Е2 (рис. 5А-В). Полученные результаты указывают на роль белка OhrR в качестве положительного (в случае с леваном) и негативного регулятора (в случае с амиловораном) в процессах выработки двух важнейших для Е. ату^вга экзополиса-
харидов. На сегодняшний день известно, что белок OhrR принимает участие в регуляции продукции факторов вирулентности у другого фитопатогенного микроорганизма — Dickeya zeae — возбудителя гнили риса, картофеля. Делеция данного транскрипционного регулятора уменьшает выработку клетками фи-тотоксина зеамина, продукцию внеклеточной целлюлазы [4].
В работе [4] также была упомянута роль
Е2 ЫггК
Рис. 5. Продукция экзополисахаридов клетками штаммов Е. ату1вувга Е2 и АвИ(А) Продукция ами-ловорана (^критерий Стьюдента в модификации Уэлча). (Б) Активность левансукразы (^критерий Стьюдента в модификации Уэлча). **Р <0,01; ***Р <0,001. (В) Качественное определение продукции целлюлозы
OhrR как негативного регулятора подвижности клеток D. zeae. Как видно из рисунка 6, клетки Е. ату^ога /\ohrR на полноценной среде культивирования образовывали макроколонии
меньшего диаметра по сравнению со значениями, полученными для E2.
Хорошо известно, что различные виды микроорганизмов имеют разную чувстви-
Рис. 6. Подвижность клеток бактерий Erwinia ату1оуога Е2 и Erwinia ату1оуога АоН^ (А) (^критерий Стьюдента в модификации Уэлча). № — нет достоверных различий (Р >0,05); ***Р <0,001. (Б) Фотография бактериальных макроколоний спустя 48 ч инкубации при 28 °С на полноценной среде LB
тельность к тем или иным окислителям. Для исследования влияния перекиси водорода на выживаемость штаммов Е. ату^ога Е2 и Е. ату^ога AohrR мы использовали концентрации Н202 0,75 моль/л, 1 моль/л и 1,2 моль/л. Как видно из рисунка 7А, с увеличением концентрации перекиси водорода количество жизнеспособных клеток штамма Е. ату^ога AohrR уменьшалось. Так, при действии 0,75 М Н202 чувствительность клеток мутантного штамма снизилась в 2 раза по сравнению с контролем. Инкубация клеток с 1 М и 1,2 М Н202 привела к полному прекращению роста клеток
делеционного мутанта, в то время как выживаемость штамма Е. ату^ога Е2 оставалась на прежнем уровне. Это может свидетельствовать о том, что регулятор OhrR принимает непосредственное участие в резистентности клеток Е. ату^ога к повреждающим воздействиям перекиси водорода.
Следует отметить, что присутствие в среде культивирования хлорида кадмия (CdCl2) в концентрации 75 мкМ повышало выживаемость как клеток штамма Е. amylovora AohrR, так и Е. ату^ога Е2 (рис. 7Б). Так, выживаемость штамма, дефектного по гену
Рис. 7. Эффект ионов кадмия (Cd2+) на выживаемость клеток Егл>1та атуЬувга в присутствии окислителя. (А) Выживаемость клеток Егл>1та атуЬувга Е2 и Егл>1та ату1вувга АвИ^ при их обработке только перекисью водорода в течение 180 мин (^критерий Стьюдента в модификации Уэлча). (Б) Выживаемость клеток Егл>1та ату1вувга Е2 и Егл>Ша ату1вувга АвИ^ при их обработке перекисью водорода в течение 180 мин и предварительной обработке хлоридом кадмия в течение 180 мин (^критерий Стьюдента в модификации Уэлча). № — нет достоверных различий (Р >0,05); *Р <0,05; **Р <0,01
вИпрактически не отличалась от таковой для штамма Е2 в присутствии 0,75 М Н202. Достоверное отличие между выживаемостью исследуемых штаммов отмечалось при концентрации перекиси водорода 1 М и 1,2 М как при наличии в среде ионов кадмия (Сё2+), так и в их отсутствие. Сходные результаты были получены для клеток Xanthomonas campestris pv. phaseoli. Присутствие в среде культивирования хлорида кадмия в концентрации 75 мкМ повышало выживаемость клеток фитопатогена при последующей их обработке перекисью водорода, третбутилгидропероксидом (1ВООН) и менадионом [18].
В связи с последними полученными результатами представляло интерес изучить каталазную активность мутантного штамма Е. ату1вувга, так как каталаза является одним из ключевых ферментов антиоксидантной защиты. В результате для штамма Е. ату1вувга АвИ^ была установлена более низкая ката-лазная активность (73,76 ± 2,5 и) по сравнению со штаммом дикого типа Е. ату1вувга Е2 (156 ± 3,9 и) (рис. 8). Данные относительно поведения мутанта Е. ату1вувга АвИ^ согласуются с описанной функцией белка OhrR в регуляции работы системы антиоксидантной защиты бактериальных клеток.
Рис. 8. Активность каталазы (и) штаммов Е^Ма ату1вувга Е2 и Егшта ату1оуога ДоЬгЯ (^критерий Стьюдента
в модификации Уэлча). ***Р <0,001
Заключение
В настоящем исследовании мы сконструировали делеционный мутант E. amylovora по гену транскрипционного регулятора OhrR и изучили его фенотип. Согласно нашим результатам, OhrR прямо или косвенно контролирует продукцию экзополисахаридов амиловорана и левана. Нарушение синтеза экзополисахаридов клетками AohrR, а также высокая чувствительность клеток к перекиси водорода может быть причиной снижения их вирулентности по отношению к растениям груши. В совокупности наши результаты идентифицируют OhrR как регулятор вирулентности Erwinia amylovora и представляют новое понимание работы сложных генных регуляторных сетей, которые контролируют физиологию и уровень вирулентности E. amylovora.
Список использованных источников
1. Das, K. Reactive oxygen species (ROS) and response of antioxidants as ROS-scaven-gers during environmental stress in plants / K. Das, A. Roychoudhury. - Frontiers in Environmental Science. - 2014. - Vol. 2, № 53. - P. 1-13.
2. Pathogenicity and infection strategies of the fire blight pathogen Erwinia amylovora in Rosaceae: State of the art / K. Vrancken [et. al]. - Microbiology. - 2013. - Vol. 159, № 5. -P. 823-832.
3. Dubbs, J. M. Peroxide Sensing Transcriptional Regulators in Bacteria / J. M. Dubbs, S. Mongkolsuk. - Journal of Bacteriology. -2012. - Vol. 194, № 20. - P. 5 495-5 503.
4. OhrR is a central transcriptional regulator of virulence in Dickeya zeae / M. Lv [et. al]. - Microbiology. - 2022. - Vol. 23, № 1. - P. 45-59.
5. Structural Mechanism of Organic Hydroperoxide Induction of the Transcription Regulator OhrR / K. J. Newberry [et. al]. - Molecular Cell. - 2007. - Vol. 28, № 4. - P. 652-664.
6. The global transcriptional response to organic hydroperoxide and the role of OhrR in the control of virulence traits in Chromobacterium violaceum / M. Previato-Mello [et. al]. - Infection and Immunity. - 2017. - Vol. 85, № 5. - P. 1-18.
7. Analyses of the Regulatory Mechanism and Physiological Roles of Pseudomonas aeruginosa OhrR, a Transcription Regulator and a Sensor of Organic Hydroperoxides / S. Atichartpongkul [et. al]. - Journal of Bacteriology. - 2010. - Vol. 192,
№ 8. - P. 2 093-2 101.
8. OhrR and ohr are the primary sensor/regulator and protective genes against organic hydroperoxide stress in Agrobacterium tumefaciens / W. Panmanee [et al.]. - Journal of bacteriology.
- 2006. - Vol. 188, № 4. - P. 1 389-1 395.
9. Molecular Cloning: A Laboratory Manual : in 3 vol. / ed.: J. Sambrook, D. W. Russel. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
- Vol. 3. - 1 875 p.
10. Datsenko, K. A. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products / K. A. Datsenko, B. L. Wanner. -PNAS. - 2000. - Vol. 97, № 12. - P. 6 640-6 645.
11. Nikolaichik, Y. SigmolD: a user-friendly tool for improving bacterial genome annota-tion through analysis of transcription control signals / Y. Nikolaichik, A. U. Damienikan. - PeerJ. -2016. - e2056. doi:10.7717/peerj.2056.
12. NCBI BLAST: a better web interface / M Johnson [et al.]. - Nucleic Acids Research. -2008. - Vol. 36, № 2, 1. - P. W5-W9. doi:10.1093/ nar/gkn201.
13. AmyR Is a Novel Negative Regulator of Amylovoran Production in Erwinia amylovora / D. Wang [et al.]. - PLOS ONE. - 2012. - Vol. 7, № 7. - P. 1-11.
14. Geier, G. Characterization and influence on virulence of the levansucrase gene from the fire-blight pathogen Erwinia amylovora / G. Geier, K. Geider. - Physiological and Molecular Plant Pathology. - 1993. - Vol. 42, № 6. - P. 387-404.
15. Castiblanco, L. F. Cellulose production, activated by cyclic di-GMP through BcsA and BcsZ, is a virulence factor and an essential determinant of the three-dimensional architecture of biofilms formed by Erwinia amylovora Ea1189 / L. F. Castiblanco, G. W. Sundin. - Molecular Plant Pathology. - 2018. - Vol. 19, № 1. - P. 90-103.
16. Lee, J. H. Integration Host Factor Is Required for RpoN-Dependent hrpL Gene Expres--sion and Controls Motility by Positively Regulating rsmB sRNA in Erwinia amylovora / J. H. Lee, Y. Zhao. - Phytopathology. - 2016. - Vol. 106, № 1. - P. 29-36.
17. Лысак, В. В. Микробиология. Практикум : пособие / В. В. Лысак, Р. А. Желдакова, О. В. Фомина. - Минск : БГУ, 2015. - 115 с.
18. Banjerdkij, P. Exposure to Cadmium Elevates Expression of Genes in the OxyR and OhrR Regulons and Induces Cross-Resistance to Perox-
ide Killing Treatment in Xanthomonas campestris / P. Banjerdkij, P. Vattanaviboon, S. Mongkolsuk.
- Applied and Environmental Microbiology. -2005. - Vol. 71, № 4. - P. 1 843-1 849.
19. Chromosomally Encoded hok-sok Tox-in-Antitoxin System in the Fire Blight Pathogen Erwinia amylovora: Identification and Functional Characterization / J. Peng, [et. al]. - Applied and Environmental Microbiology. - 2019. - Vol. 85, № 15. - P. 1-16.
20. SlyA regulates phytotoxin production and virulence in Dickeya zeae EC1 / J. N. Zhou [et al.]. - Molecular Plant Pathology. - 2016. - Vol. 17, № 9. - P. 1 398-1 408.
21. MarR Family Transcription Factors from Burkholderia Species: Hidden Clues to Control of Virulence-Associated Genes / A. Gupta [et al.].
- Microbiology and Molecular Biology Reviews.
- 2018. - Vol. 83, № 1. - P. 1-19.
22. Deochand, D. K. MarR family transcription factors: dynamic variations on a common scaffold / D. K. Deochand, A. Grove. - Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. - 2017.
- Vol. 52, № 6. - P. 595-613.
23. Castiblanco, L. F. New insights on molecular regulation of biofilm formation in plant-associated bacteria / L. F. Castiblanco, G. W. Sundin.
- Journal of Integrative Plant Biology. - 2016. -Vol. 58, № 4. - P. 362-372.
24. Dufour, D. Bacterial biofilm: structure, function, and antimicrobial resistance / D. Dufour, V. Leung, C. M. Levesque. - Endodontic Topics.
- 2010. - Vol. 22, № 1. - P. 2-16.
25. The Role of Bacterial Biofilms and Surface Components in Plant-Bacterial Associations / P. C. Bogino [et al.]. - International Journal of Molecular Sciences. - 2013. - Vol. 14, № 8. -P. 15 838-15 859.
K. Yu. Pesotskaya1, A. L. Lagonenko2, A. N. Evtushenkov1
INFLUENCE OF THE OHRR GENE DELETION ON THE PRODUCTION OF VIRULENCE FACTORS BY THE PHYTOPATHOGENIC BACTERIA
ER WINIA AMYLOVORA
1Belarussian State University 4 Nezavisimosty Ave., 220030 Minsk, Republic of Belarus 2Algimed Techno LLC 22/1, Logoisky trakt, 220090, Minsk, the Republic of Belarus e-mail: lagonenkoal@mail.ru
The MarR family (Multiple Antibiotic Resistance) of transcription factors regulates diverse genes involved in synthesis of virulence determinants, biofilm formation, multiple antibiotic resistance, resistance against many cellular toxins, including detergents, oxidative reagents and phenolic compounds. Using a one-step method for inactivation of chromosomal genes we constructed and characterized mutant carrying deletion of the ohrR gene. Inactivation of ohrR results in decreased cell viability after treatment with hydrogen peroxide, levan production and increased amylovoran production. It is also shown that on pear shoots the ohrR deficient strain had reduced virulence compared to the wild type. In summary, the results of this study demonstrate that OhrR is a key regulator of the virulence of Erwinia amylovora and add new insights into the complex regulatory network that modulates the physiology and virulence of Erwinia amylovora.
Keywords: Erwinia amylovora, transcriptional regulator OhrR, virulence factors, exopolysaccharides, oxidative stress, hydrogen peroxide.
Дата поступления в редакцию: 06 января 2023 г.
