CC BY
75AGRICULTURE
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ОЖОГ ПЛОДОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ В
УЗБЕКИСТАНЕ
Ходжаева С. М.
Гузалова А. Г.
Хасанов Б. А.
Ташкентский государственный аграрный университет Институт генетики и экспериментальной биологии растений АНРУз
Abstract. Fire blight caused by Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al., a disastrous disease of fruit trees, infects apple, pear, quince, sweet cherry and many other fruit, forest and decorative trees in Uzbekistan. Using special microbiological media and methods authors have isolated this pathogenic bacterium from samples of infected apple and sweet cherry trees. It has been found that except fire blight, fruit trees can be infected with another bacterial disease caused by Pseudomonas syringae. Criteria for isolating and differentiating these two species ofplant pathogenic bacteria have been identified.
Бактериальный ожог плодовых деревьев, вызываемый бактерией Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. относится к числу самых опасных болезней. Бактерия поражает более 200 видов культурных и дикорастущих растений, большинство из которых относится к семейству розоцветных. Поражаются ожогом все части деревьев: цветы, листья, побеги, ветви, штамбы, корни и плоды [1].
Родиной Erwinia amylovora является Северная Америка. В настоящее время бактерия зарегистрирована в Европе, Азии, Африке, Северной, Центральной и Южной Америке и т.д.
Относительно недавно ожог плодовых деревьев отсутствовал на территории СНГ (за исключением Армении), однако ареал его распространения расширяется с каждым годом; в течение последних 5-10 лет заболевание зарегистрировано в России, Казахстане, Белоруссии, Киргизии, Украине и велика вероятность нахождения этого заболевания и в других сопредельных государствах. С 2009 года заболеванию придан статус ограниченно распространенного на территории России. В Казахстане с 2013 г. заболеванию придан статус карантинного заболевания, распространенного на территории этой страны [2].
В Узбекистане бактериальный ожог появился относительно недавно, и изучение распространения данного вредоносного заболевания является актуальной задачей.
Материалы и методы. Образцы зараженного материала для бактериологического исследования собирали в стерильную бумагу и посуду. Для проведения диагностики Erwinia amylovora, каждый отобранный образец снабжали номером с тщательным описанием морфологических признаков заболевания.
Стерилизацию поверхности образцов пораженных тканей растений проводили 2% раствором хлорного отбеливателя «Белизна» с последующим многократным промыванием водопроводной, а затем стерильной водой. Простерилизованные образцы раскладывали в чашках Петри с одной из следующих питательных сред: 1. Картофельный агар (КА): 500 г очищенных и мелко нарезанных клубней картофеля заливали 500 мл водопроводной воды и кипятили 30 мин. Отвар фильтровали через ватный фильтр и доводили его объем водой до 1000 мл. Затем рН среды доводили до 7,2 и добавляли 15 г агар-агара. Стерилизовали при 1,5 атм. 30 мин. 2. Среда Кинг В ( на 1 л дистиллированной воды): пептон ферментативный (Difco) - 20,0 г; глицерин - 15,0 мл; K2HPO4 (безв.) - 1,5 г; MgSO47H2O - 1,5 г; агар-агар - 15,0 г; рН доводили до 7.2, стерилизовали при 1,5 атм. в течение 30 мин. 3. Среда Sx (для выделения Xanthomonas spp.) (на 1 л дистиллированной воды): крахмал растворимый - 10,0 г; мясной экстракт - 1,0 г; NH4Cl - 5,0 г; K2HPO4 - 2,0 г; метиловый фиолетовый 2В (1% в 20% этаноле) - 0,4 мл; метиловый зеленый (1% водный раствор) - 2,0 мл; агар-агар - 15 г. После стерилизации при 0,5
атм. в течение 20 мин и охлаждения до 50оС к среде добавляли 2 мл циклогексимида (100 мг/мл в 75% этаноле) [3,4,5].
Для определения способности фитопатогенных бактерий вызывать некроз растительной ткани (реакция гиперчувствительности или патогенности) использовали растения комнатной герани (Pelargonium zonale (L.) L'Her. ex Aiton). Для этого исследуемые бактериальные штаммы инкубировали на скошенном агаре в течение 24 ч. Клетки смывали с помощью 3 -4 мл физиологического раствора и 15-20 мкл вводили в мякоть листа стерильным шприцем (шприц стерилизовали промыванием 70%-ным, а затем 96%-ным этанолом, затем - физиологическим раствором). В качестве контроля использовали введение такого же объема стерильного физиологического раствора [6]. Подвижность бактерий определяли на среде следующего состава: 2% водный агар - 9 мл; солевой концентрат - 4-5 мл; 20% водный раствор глюкозы -0,2 мл; вода дистиллированная - 46 мл. Пигменты бактерий выявляли на селективных питательных средах, образование пиоцианина - на среде Кинг А следующего состава: бактопептон - 2,0%; глицерин - 1,0%; K2SO4 (безв.) - 1,0%; MgCh - 0,14%; агар-агар - 1,5%; вода дистиллированная - до 1 л, рН 7,2. Стерилизовали при 0,5 атм. 20 мин. Среда для флюоресцирующих пигментов псевдомонад: полноценный питательный агар с 2-7% глицерина, который вносили до стерилизации. Для определения грампринадлежности бактерий использовали 3% раствора КОН [7,8].
Результаты и их обсуждение. Из-за способности возбудителя болезни быстро распространяться вредоносность ожога плодовых весьма велика. В сильно заражённых садах ожог плодовых деревьев может поражать 20-50% насаждений, из которых 10-20% полностью погибают; сильно поражённые деревья могут погибнуть в течение одного сезона (рис. 1, 2). В некоторых садах ожогом заражается до 90% плодовых деревьев. В таких случаях при благоприятных погодных условиях в период цветения садов урожай значительно снижается и часто теряется полностью [6].
Рис. 1. Симптомы бактериального ожога на побеге груши, характерный признак «пастуший посох» (а); бактериальный экссудат на молодом побеге яблони (б).
Присутствие бактериального ожога плодовых может быть губительным как для грушевых, черешневых и яблоневых садов, так и для питомников. Многие декоративные растения являются резерваторами инфекции. Вследствие сильного распространения ожога в зарубежных странах бывали случаи значительного сокращения площадей под насаждениями плодовых культур, например, в штатах Среднего Запада (Midwest) США из-за этой болезни перестали выращивать грушу [9].
Из образцов пораженной яблони (рис. 2) на средах МПА (мясо-пептонный агар) и Кинг Б мы выделили возбудителя бактериального ожога бактерию E. amylovora. Микробиологический анализ культуры показал, что это подвижные перитрихиальные палочки, размером 0,9-1,5х0,1-0,7 мкм, спор и капсул не образуют; расположены одиночно, парами и короткими цепочками, грамотрицательные, некислотоустойчивые аэробы или факультативные
а
б
анаэробы. На МПА колонии круглые, маленькие, с ровными краями, иногда опалесцирующие, белые, блестящие, маслянистой консистенции (рис. 3). На мясо-пептонном бульоне (МПБ) образуют небольшую зернистую пленку, при этом бульон мутнеет. По литературным данным оптимальная температура для развития бактерии 30°С, погибают при 43,7-50°С. В чистых культурах бактерии могут иметь S- и R-формы, из которых S - гладкая авирулентная, а R -складчатая вирулентная форма [9].
Рис. 2. Симптомы поражения яблони бактериальным ожогом. Интенсивные сады. Ташкентская область, вблизи г. Газалкент (фото Гузаловой А. Г., Ходжаевой С. М., 2014 г.)
а б
Рис. 3. Морфология колоний бактерии Егм>та ату!оуога, выделенных из яблони: (а) на среде Кинг Б; (б) - на МПА (фото Гузаловой А. Г., Ходжаевой С. М., 2014 г.)
Отличительным признаком возбудителя ожога плодовых дерев является выделение им молочно-белого экссудата (рис.4 б), однако это происходит только в условиях высокой влажности воздуха, а в более сухих условиях экссудат может отсутствовать, что может усложнить идентификацию патогена или привести к неправильному определению болезни. Тогда симптомы ожога могут напоминать зимние абиотические повреждения, грибные болезни коры и древесины, повреждения некоторыми насекомыми и т.п.
Для проверки патогенности выделенных из заболевших деревьев яблони и черешни штаммов бактерий проводили тест на молодых незрелых плодах груши по методу Уайта [6]. Этот тест является одним из основных при определении возбудителя ожога. Суспензию бактерий (титр 108 клеток/мл) наносили на плод груши и затем в этом месте три раза накалывали стерильной энтомологической булавкой под кожицу, на разную глубину. Операцию повторяли несколько раз, и образцы помещали во влажную камеру. В качестве контроля использовали уколы со стерильной водой. Через 2 суток в местах уколов появились
некротические пятна и молочно-белый экссудат, что выделенных бактерий к виду Егмт1а ату!оуога (рис. 4а).
свидетельствует о принадлежности
б
а
в
Рис.4. Тест Уайта на незрелых грушах по идентификации Erwinia amylovora: штамм № 4 E. amylovora, выделенный из черешни: выделение бактериального молочно-белого экссудата на плоде груши (а); штамм № 3 Pseudomonas syringae - экссудат отсутствует (в); контроль (б) (фото Гузаловой А. Г., Ходжаевой С. М. 2014 г.).
Флюоресцирующие бактерии - Pseudomonas syringae - вызывают некроз ткани груши без выделения экссудата (рис. 4в). Бактерии из группы флюоресцирующих - P. syringae, P. cerasus - вызывают похожие заболевания плодовых, но при этом никогда не наблюдается выделение молочно-белого экссудата, характерного только для Erwinia amylovora (рис. 4 а).
Для постановки опыта по определению реакции сверхчувствительности по Клементу отбирали нефлюоресцирующие грамотрицательные штаммы, 48-часовую культуру которых смывали 10 мл стерильной воды и готовили суспензию с титром 106 клеток/мл. С помощью шприца суспензию вводили в межклеточное пространство листа комнатной герани. Контролем служили растения герани, инъецированные стерильной водой.
В том случае, если суспензия содержит фитопатогенные бактерии и через 12-24 часа на месте инфильтрата образуется некроз тканей, тогда бактерии относятся к виду P. syringae. Сапротрофные бактерии не вызывают отмирания ткани и лист остается без внешних изменений. Как видно из рис. 5, после заражения листьев герани суспензией фитопатогенной бактерии, выделенной из черешни, на 2-3-и сутки наблюдается выраженный хлороз, что подтверждает принадлежность данной бактерии к виду Erwinia amylovora.
К
б
Рис.5. Определение реакции сверхчувствительности по Клементу на листьях тестового растения герани. а - контроль: листья герани до инокуляции суспензией Erwinia ату^ога; б-опыт, хлороз тканей листьев после заражения Ет>т1а ату^ога (фото Гузаловой А. Г., Ходжаевой С. М., 2015 г.)
В связи с тем, что бактериальный ожог плодовых очень устойчив к условиям внешней среды, благоприятные климатические условия для развития болезни создают серьезную опасность для плодовых насаждений. Величина ущерба, который болезнь может нанести в экосистемах региона может быть огромной.
Рис. 6. Рост Erwinia amylovora и Pseudomonas syringae на селективных
средах MMICu и MM2Cu
Расположение изучаемых штаммов фитопатогенных бактерий на чашках Петри с селективными средами: 5 - Erwinia amylovora; 1, 12, 14 и 16 - P. syringae (фото Гузаловой А. Г., Ходжаевой С. М., 2015 г.).
В защите плодовых культур от бактериального ожога большое значение имеют своевременное выявление, прогнозирование появления и развития инфекции в садовых участках. Для идентификации фитопатогенных грамотрицательных бактерий, применяются различные микробиологические селективные среды, серологические, молекулярно-генетические анализы [6]. В данном исследовании мы использовали для идентификации две селективные среды - ММ1Си и MM2Cu. По данным литературы, фитопатогенная бактерия Erwinia amylovora абсолютно не растёт на среде ММ1Си, а на среде MM2Cu на 2-5 сутки образует колонии желтого цвета. Как видно из рис. 6, штаммы бактерий 1, 12, 14 и 16, выделенные из поражённых деревьев черешни и яблони, относятся к P. syringae. Штамм №5 не растёт на среде ММ1Си, соответственно он относится к Erwinia amylovora [10,11].
Таким образом, на основании приведенных данных мы можем рекомендовать селективную среду ММ1 Си для идентификации Erwinia amylovora.
ЛИТЕРАТУРА
1. Карантин растений. Под редакцией А.С. Васютина. М: 2002, 536 с.
2. Обзор распространения по странам мира карантинных вредителей, болезней и сорняков. МСВХ РУз, Главная государственная инспекция республики Узбекистан по карантину растений. Ташкент, 2007, 63 стр.
3. Определитель бактерий Берджи под редакцией Дж. Хоуб. Москва: «Мир», 1997; для Европы под редакцией Ю.Ф. Савотикова, А.И. Сметника. М: «Колос», 1996.
4. Варшалович А.А., Шамонин Н.Г. Руководство по досмотру и экспертизе растительных и других подкарантинных материалов. М: «Колос», 1972, 54 с.
5. Справочник по сельскохозяйственной фитопатологии. Под редакцией д. б. н. К. В. Попковой. М: «Колос», 1976.
6. Проект Межгосударственного Стандарта по карантину растений ... Евразийский Совет по Стандартизации, Метрологии и Сертификации (ЕАСС). Методы выявления и идентификации возбудителя ожога плодовых деревьев. Москва. Стандартинформ. http://vniikr.ru/files/pdf/tehn%20comitet/t_prst3.pdf.
7. Методические указания по выявлению ожога плодовых культур. Сборник инструктивных и методических материалов по карантину растений. Сыктывкар, 1995.
8. Методы диагностики карантинных болезней. Сборник научных трудов. Москва, 1985.
9. Сборник инструктивных и методических материалов по карантину растений. Под общей ред. начальника Росгоскарантина к. э. н. Васютина А. С., директора ВНИИКР д. б. н. Сметника А.И., Барнаул, 2000.
10. Beckerman J. Disease susceptibility of common apple cultivars. Plant Pathology, 2006, No. 12/6 (http://www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/person/382/PearCultivarFactSheet CombinedwithSunrise.pdf ).
11. Russo N.L., Robinson T.L., Fazio G., Aldwinckle H.S. Fire blight resistance of Budagovsky 9 apple rootstock. Plant Disease, 2008, vol. 92, pp. 385-391.
ECONOMY
