CC BY
277
А. Беликов. Vir-обусловленный перенос производных плазмиды R5F1010
БИОЛОГИЯ
УДК 577.21
VIR-ОБУСЛОВЛЕННЫЙ ПЕРЕНОС ПРОИЗВОДНЫХ ПЛАЗМИДЫ RSF1010 МЕЖДУ АГРОБАКТЕРИЯМИ И ЭНТЕРОБАКТЕРИЯМИ
В. А. Великов
Саратовский государственный университет Е-mail: v_velikov@mail.ru
Показана принципиальная способность генов вирулентности vir почвенной бактерии Agro-bacterium tumefaciens детерминировать перенос производных плазмиды RSF1010 в клетки энтеробактерий Escherichia coli, Erwinia carotovora и Erwinia herbicola. Перенос производных плазмиды RSF1010 из клеток микроорганизма A.tumefaciens, относящегося к семейству Rhizobiaceae, в клетки трех указанных представителей семейства Enterobacteriaceae происходит с эффективностью порядка 10~4 в пересчете на клетку бактерии-реципиента, что сравнимо с внутривидовыми скрещиваниями.
Ключевые слова: Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, гены vir, плазмида RSF1010, генетическая трансформация, конъюгация.
Vir-dependent Transfer of RSF1010-Derivatives between Agrobacterial and Enterobacterial Cells
V. А. Velikov
The capacity of Agrobacterium tumefaciens vir genes to determine transfer of RSF1010-derivates to the cells of unrelated heterologous bacteria, such as Escherichia coli, Erwinia carotovora and Erwinia herbicola, was shown. Transport of RSF1010-derivatives from A.tumefaciens cells (Rhizobiaceae) to the cells of three microorganisms from Enterobacteriaceae family has similar efficiency with intraspesific matings (10~4).
Key words: Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, vir genes, RSF1010 plasmid, genetic transformation, conjugation.
Бактерии рода Agrobacterium обладают способностью переносить в геном растений небольшую часть генетического материала своих Ti-плазмид, так называемую Т-ДНК. Экспрессия генов Т-ДНК вызывает у растений развитие опухолей - корончатых галлов [1]. Перенос Т-ДНК в растения осуществляется по механизму, сходному с механизмом бактериальной конъюгации [2]. Так, гены vir, кон -тролируюшие перенос Т-ДНК, проявляют выраженную гомологию нуклеотидных последовательностей с генами tra и trb, ответственными за конъюгацию у бактерий [2, 3], а границы Т-ДНК являются структурно-функциональными аналогами oriT [4]. Существуют данные о взаимозаменяемости отдельных элементов двух указанных систем, подтверждающие так называемую «конъюгативную модель» переноса Т-ДНК в растения [5, 6].
Подтверждением конъюгативной модели является потенциальная способность агробактерий переносить в растения природ-
ную мобилизуемую бактериальную плазмиду RSF1010 [7]; на основе этой плазмиды широкого круга хозяев из группы несовместимости Q в настоящее время создан ряд векторов для трансформации растений. При переносе плазмиды RSF1010 из клеток Agrobacterium tumefaciens в клетки растений белки vir контролируют формирование трансмембранного канала, а область oriT указанной плазмиды выполняет функции правой границы Т-ДНК Ti-плазмид. Кроме этого, достаточно широко известны эксперименты по vir-обусловленному переносу плазмиды RSF1010 между клетками разных штаммов Agrobacterium при конъюгационных скрещиваниях (в противовес к обычному tra-обусловленному переносу плазмид, также существующему у агробактерий) [8, 9].
В данной работе ставилась цель выяснить вопрос о том, ограничена ли способность к vir-обусловленному транспорту плазмиды RSF1010
Штаммы
внутривидовым переносом или же плазмида RSF1010 может передаваться из клеток Agro-bacterium в клетки различных бактерий, в том числе бактерий, не являющихся привычными почвенными обитателями. Выяснение вопроса о возможности межродового переноса RSF1010, кроме чисто научного интереса, позволяет оценить потенциальный риск распространения искусственно созданных агробактериальных векторов для трансформации растений среди бактерий из разных мест обитания.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и плазмиды. Использованные в работе бактериальные штаммы получены из коллекции Филиала Института биоорганической химии (ФИБХ) РАН (г. Пущино), стрептомицин-резистентные мутанты этих бактерий получены самостоятельно. Бактериальные штаммы приведены в табл. 1.
Таблица 1
бактерий
Штамм Особенности генотипа Характеристика, ссылка
Agrobacterium tumefaciens LBA 4301 recA- Rec-минус штамм-хозяин для различных агоробактериальных плазмид-векторов [10]
Agrobacterium tumefaciens LBA2525 virA: lacZ Ген вирулентности virA данного штамма сшит с репортерным геном lacZ для контроля за экспрессией vir-генов [11]
Escherichia coli HB101 F-, hsdS20 (rB- mB-), SupE44, recA13, ara-14, galK2, lacY1, proA2,rps L20 (Smr), xyl-5, mtl-1 Широко используемый штамм-хозяин для различных плазмид, дефектный по системе гомологичной рекомбинации [12]
Erwinia carotovora B15 Прототроф, (Бтг-мутант) Природный почвенный изолят [13]
Erwinia herbicola ATCC 27155 Прототроф, (Бтг-мутант) Природный почвенный изолят [14]
Указанные штаммы Agrobacterium являются лабораторными, они используются для проведения генетической трансформации растений в культуре клеток и тканей с последующей регенерацией трансформированных клеток во взрослые
растения in vitro. Штаммы энтеробактерий, за исключением лабораторного штамма E.coli HB101, являются природными изолятами.
Характеристики использованных в работе бактериальных плазмид приведены в табл. 2.
Таблица 2
е плазмиды
Наименование Маркер устойчивости к антибиотикам Размер, kb Группа несовместимости Характеристика, ссылка
pUCD2614 СЬГ Kmr 40,2 pSa Vir-помощник, содержит vir-гены Ti-плазмиды С58 [15]
pRSK1 Kmr 11,6 inc Q Бинарный вектор, содержит встроенную по BamH1- сайту 3,8 kb кассету с геном левансахаразы sacB из бактерии Bacillus subtilis [16]
pRSC1 Cmr 12,3
pUCD2335 Gmr 13,1 inc W Бинарный вектор, содержит только одну правую границу Т-ДНК [17]
pUCD2340 12,9 Бинарный вектор, содержит обе границы Т-ДНК [17]
Примечание. Cbr - устойчивость к карбенициллину, Kmr - устойчивость к канамицину, Cmr - устойчивость к хлорам-фениколу, Gmr - устойчивость к гентамицину.
В. А. Великов. Vir-обусловленный перенос производных плазмиды R5F1010
Плазмиды также получены из коллекции ФИБХ РАН. Все плазмиды представляют собой векторы для трансформации растений без клонированных целевых генов. Они имеют маркерные гены устойчивости к разным антибиотикам, что позволяет проводить многовариантные скрещивания. Поскольку базовые репликоны этих плазмид относятся к разным группам несовместимости, то они способны сосуществовать в одной клетке. Главное, чтобы у них были разные селективные маркеры для надежного выявления. Рекомбинации при этом исключены, поскольку донорный штамм агробактерии
дефектен по системе гомологичной рекомбинации.
Плазмиды pRSK и pRSCl, полученные нами ранее [16], имеют дополнительно репортерный ген левансахаразы из бактерии Bacillus subtilis, удобный для негативной селекции на агаризо-ванных средах, содержащих сахарозу. Плазмида pRSCl несет бактериальный маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cmr), плазмида pRSKl - маркер устойчивости к канамицину (Kmr). Кроме того, обе плазмиды имеют ген левансахаразы из транспозона Tn5-B12S [18], используемый при селекции как ген-репортер (рис. l).
RSF1010
SacB
Km1
EHilUlO
б
Рис. 1. Карты-схемы плазмид - производных ЯБИОЮ: а - pR.SK!; б - pRSC1. Обозначения: RSF1010 - фрагмент ДНК плазмиды RSF1010, 8асБ - ген левансахаразы яаеБ, Стк - ген устойчивости к хлорамфениколу, Ктк - ген устойчивости к канамицину, р15А - опУ репликации плазмиды р15А, Е - сайт рестрикции БсоЫ
Антибиотики для поддержания плазмид и спирте и использовали в концентрациях, указан-селекции трансконъюгатов растворяли в воде или ных в табл. 3.
Таблица 3
Рабочие концентрации антибиотиков, использованных для поддержания плазмид, селекции и контрселекции
a
Антибиотик Agrobacterium tumefaciens, мкг/мл Б.соН, мкг/мл E.carotovora, мкг/мл E.herbicola, мкг/мл Исходный раствор в Н2О, мг/мл
Карбенициллин, Cb 200 - - - 100
Рифампицин, Rf 100 - - - 50 (в 70% этаноле)
Канамицин, Km 100 100 100 100 100
Стрептомицин, Sm - 200 200 200 100
Гентамицин, Gm 25 5 5 5 25
Хлорамфеникол, Cm 50 25 25 25 50
Примечание. Обозначения см. табл. 2.
Условия проведения скрещиваний. Скрещивания A.tumefaciens с различными энте-робактериями-реципиентами проводили на твердой подложке в присутствии индуктора у/г-генов - ацетосирингона (3,5-диметокси-4-гидроксиацетофенон) с использованием стан-дарных процедур, частично модифицированных, как описано ниже, в соответствии с конкретными задачами.
В качестве донора в скрещиваниях использовали дефектный по системе гомологичной рекомбинации штамм A.tumefaciens ЬБА4301 [10], несущий у/г-хелперную плазмиду рИСВ2614 [15] с маркерами устойчивости к карбеницил-
лину и канамицину. Этот штамм обладает также хромосомной устойчивостью к рифампицину. В клетки указанного штамма вводили электро-порацией то или иное производное плазмиды RSF1010 либо бинарный вектор или оба типа плазмид вместе в зависимости от решаемой задачи. Плазмида рИСБ2614 сконструирована для целей генной инженерии растений, она имеет высокую копийность, несет у/г-гены Ть плазмиды природного штамма A.tumefaciens С58, но в отличие от нее не имеет ^а-генов, которые могут повлиять на результаты скрещивания. Экспрессию у/г-генов плазмиды рИСБ2614 в клетках штамма A.tumefaciens ЬБА4301 обе-
спечивали стандартным путем [19] - добавлением синтетического индуктора ацетосирингона (Sigma).
В качестве реципиентов плазмидной ДНК использовали бесплазмидные штаммы бактерий Escherichia coli, Erwinia carotovora, Erwinia her-bicola. Для всех трех штаммов энтеробактерий использовали стрептомицин-резистентные мутанты, изолированные в результате спонтанного мутагенеза.
Скрещивания осуществлялись в 3 различных вариантах, данные 3 повторностей в каждом варианте усреднялись.
Вариант 1. В клетки донорного штамма A.tumefaciens LBA4301(pUCD2614) вводили электропорацией сконструированные нами производные плазмиды RSF1010 с различными селекционными маркерами и геном-репортером sacB (см. рис. 1).
В качестве реципиентов использовали все три штамма энтеробактерий, как и во всех остальных вариантах.
Вариант 2. В другой серии экспериментов в донорный штамм бактерии A.tumefaciens LBA4301(pUCD2614) вводили бинарные векторы pUCD2335 либо pUCD2340. Это делали для того, чтобы выяснить вопрос о потенциальной способности или неспособности Vir- белков обеспечивать перенос Т-ДНК в бактерии. Бинарные векторы содержат в составе Т-ДНК бактериальный ген устойчивости к гентамицину, позволяющий вести селекцию в кишечной палочке и эрвинии. Основное различие этих векторов состоит в наличии обеих границ Т-ДНК (pUCD2340) либо только одной правой границы (pUCD2335), что предоставляет возможность следить за переносом либо целой плазмиды в автономном виде, либо за переносом только ее Т-ДНК по интеграции в хромосому реципиентной бактерии.
Вариант 3. В следующей серии экспериментов в донорный штамм бактерии вводили вместе с бинарным вектором pUCD2335 либо pUCD2340, принадлежащих к группе несовместимости IncW, одно из производных плазмиды RSF1010 - pRSK1 или pRSC1. Это делали для того, чтобы выяснить вопрос о способности или неспособности переноса природной Т-ДНК в бактерии в присутствии mob-генов и oriT in trans (поскольку в варианте 2, как позже выяснилось, переноса Т-ДНК в бактерии не происходит). OriT - область плазми-ды, ответственная за репликации, связанную с транспортом, т.е. репликацию по типу «катящегося кольца», гены mob участвуют в транспорте плазмиды RSF1010 в клетки различных бактерий in vivo и даже растений в культуре клеток in vitro. Указанные плазмиды были способны сосущество-
вать вместе в клетках агробактерии, поскольку имеют разные репликаторы опУ - области, ответственные за вегетативную репликацию (см. табл. 2).
Протокол скрещивания. Скрещивания проводили с применением распространенных методов, описанных в лабораторных руководствах [19]. Скрещивания осуществляли на целлюлозных фильтрах, помещенных на поверхность агаризо-ванных питательных сред. С целью обеспечения экспрессии у/г-генов в качестве твердой подложки для скрещиваний использовали агаризованную среду МББР [19] с низким значением рН, в которую добавляли индуктор ацетосирингон.
Ночную культуру донорного штамма АЛите/ае1ет разводили в соотношении 1:10 средой МББР, добавляли ацетосирингон (100 мкМ) и инкубировали в течение 6 часов на встряхивателе при 28 °С. При этом плотность суспензии достигала 1х108 клеток/мл и происходила индукция генов вирулентности с накоплением соответствующих белков в клетках. После этого культуру смешивали в соотношении 5:1 с культурами Е.соИ, Егм>Ма саго^уога или Егм>Ма ЪегЫсо1а, находящимися в среднелогарифмической фазе роста в бульоне ЬБ с такой же концентрацией 1*108 клеток/мл. Медленно растущие бактерии A.tumefaciens брались с 5-кратным избытком. По 50 мкл смеси наносили на бумажные фильтры БА85/22 (8сЫеюЬег&8Ьие1), помещенные на поверхность агаризованной среды МББР с индуктором, предварительно разведенной наполовину средой ЬБ для поддержания жизнеспособности энтеробактерий. Инкубацию осуществляли при 28 °С в течение двух суток, как это рекомендовано для внутривидовых скрещиваний. Контрольные скрещивания без ацетосирингона проводили по той же схеме.
По истечении двух суток инкубации фильтры помещали в пробирки с 2 мл среды ЬБ, смывали клетки в среду энергичным встряхиванием на шейкере и производили высевы бактериальных клеток из разведений на поверхность ЬБ-агара с соответствующими антибиотиками для селекции плазмид. Для контрселекции против клеток агробактерий в среду добавляли стрептомицин. Инкубировали 16 ч в течение ночи при температуре 37 °С для Е.соИ или 30 °С для Егм>Ма. Для энтеробактерий в сравнении с Agгobacteгium этого времени достаточно для формирования достаточно крупных хорошо видимых колоний. На следующее утро производили подсчет выросший колоний и оценивали частоты переноса в пересчете на клетку реципиента. Частота переноса определялась как соотношение числа клеток, получивших плазмиду (выросшие колонии), к общему числу клеток реципиента в суспензии на
В. А. Великов. Vir-обусловленный перенос производных плазмиды RSF1010
момент нанесения на фильтр. Выросшие клоны пересевали штрихом до отдельных колоний на эти же среды для очистки, убеждаясь при этом, что как по характеру роста, так и по скорости роста они не похожи на донорные бактерии Agrobacterium tumefaciens. В их чувствительности к рифампи-цину убеждались посевами на соответствующую среду. Для выявления плазмид из клеток транс-конъюгатов выделяли плазмидную ДНК, которую анализировали электрофорезом.
Анализ трансконъюгатов. Выделение плаз-мидной ДНК проводили стандартным методом щелочного лизиса клеток [12]. Электрофорети-ческий анализ ДНК в агарозном геле проводили по стандартной методике [12].
Результаты и их обсуждение
При осуществлении скрещиваний в условиях индукции vir-генов мы наблюдали перенос производных плазмиды ЯББЮЮ из клеток агро-бактерии в клетки кишечной палочки и в клетки эрвинии. Плазмидная ДНК обнаруживалась для эрвинии как в клетках фитопатогенного штамма, так и в клетках непатогенного штамма. Без индукции генов вирулентности переноса не про-
Частоты переноса п.
исходило. В том что своим появлением в клетках энтеробактерий плазмиды-производные RSF1010 обязаны работе генов vir, говорит факт отсутствия генов конъюгационного переноса (tra-генов) в донорных и реципиентных штаммах бактерий. Контроль за прохождением индукции vir-генов в описанных условиях скрещивания осуществляли путем сравнения с известными репортерными системами. В качестве «свидетеля» использовали штамм A.tumefaciens LBA2525 с маркером virB-lacZ, который растили параллельно с донорными штаммами на MSSP-агаре с X-Gal и IPTG [19] в присутствии ацетосирингона. Этот контроль позволял нам визуально наблюдать окрашивание бактериальных колоний в синий цвет при росте на данной среде. В отсутствие ацетосирингона окращивания не наблюдалось, поскольку, как очевидно, гены вирулентности не экспрессировались. Это позволяет полагать, что и vir-гены штамма A.tumefaciens LBA4301(pUCD2614) с различными векторными плазмидами в описанных условиях скрещиваний нормально экспрессировались.
Частоты появления плазмид-производных RSF1010 в клетках энтеробактерий приведены в табл. 4.
Таблица 4
мид в скрещиваниях
Донор Селектируемый маркер Реципиент, частота переноса
E.coli E.carotovora E.herbicola
A.tumefaciens LBA4301 (pUCD2614, pRSd) Cmr 4,3 ■ 10-4 4,7 ■ 10-4 4,2 ■ 10-4
A.tumefaciens LBA4301 (pUCD2614, pRSK1) Kmr 5,1 ■ 10-4 6,3 ■ 10-4 6,2 ■ 10-4
A.tumefaciens LBA4301 (pUCD2614, pUCD2335) Gmr 0 0 0
A.tumefaciens LBA4301 (pUCD2614, pUCD2340) Gmr 0 0 0
A.tumefaciens LBA4301 (pUCD2614, pUCD2335, pRSC1) Стг 8,9 ■ 10-4 7,7 ■ 10-4 1,3 ■ 10-5
A.tumefaciens LBA4301 (pUCD2614, pUCD2340, pRSK1) Kmr 1,3 ■ 10-5 1,5 ■ 10-5 9,3 ■ 10-4
В среднем одна из 10 000 клеток бактерии-реципиента получала признак устойчивости к соответствующему антибиотику и, следовательно, плазмиду. В этих скрещиваниях функции отсутствующих генов tra, обеспечивающих в норме конъюгацию, взяли на себя гены vir, контролирующие генетическую трансформацию растений.
Следует заметить, что в клетки агробактерий при внутривидовых скрещиваниях производные плазмиды RSF1010 переносятся с частотами приблизительно такого же порядка 1х10-4 [8].
На рис. 2 приведены результаты электрофореза плазмидной ДНК, выделенной из стрептомицин-устойчивых клонов E.coli, E.carotovora и E.herbicola, полученных в результате скрещивания (вариант 1). Во всех проанализированных клонах каждого микроорганизма (по 8 клонов) обнаруживалась плазмидная ДНК pRSC1 оди-
12 3 4 5 6
Рис. 2. Плазмидные профили трансконъюгатов от скрещивания агробактерий с энтеробактериями: 1 - плазмида pR.SC! в клетках A.tumefaciens LBA4301; 2 - бесплаз-мидный штамм E.coli НВ101; 3 - бесплазмидный штамм E.carotovora В15; 4 - плазмида pRSC1 в клетках E.coli НВ101; 5 - плазмида pRSC1 в клетках E.carotovora В15;
6 - плазмида pRSC1 в клетках E.herbicola АТСС 27155
накового размера, т.е. перенесенные плазмиды поддерживались целиком, не претерпевая каких-либо делеций.
«Спасения» маркера путем встройки в хромосому реципиента не происходило, поскольку бес-плазмидных трансконъюгатов не было получено. Аналогичные результаты электрофоретического анализа ДНК получены для плазмиды pRSKl.
Проведенные эксперименты показали, что vir-гены агробактерий могут обеспечивать перенос производных плазмиды RSF1010 между клетками различных неродственных бактерий, а не только между агробактериями. В частности, происходит перенос в клетки кишечной палочки, занимающей с агробактериями в природе разные экологические ниши. Идет перенос и в клетки эрвинии - фитопатогенной бактерии, способной колонизовать поверхность растений, как и Agro-bacterium. Причем транспорт осуществляется примерно с такой же эффективностью, как при внутривидовых скрещиваниях.
Таким образом, искусственно созданные векторы для трансформации растений способны к эффективному распространению между разными бактериями, что необходимо учитывать при проведении работ с ними.
Нам не удалось зафиксировать перенос Т-ДНК между скрещиваемыми бактериями иначе как только в составе мобилизуемой плазмиды. В вариантах скрещивания, где использовалась бинарная векторная система трансформации растений и не присутствовала плазмида RSF1010, трансконъюгатов не было получено вовсе (см. табл. 4). Это еще раз показывает что «конъюга-тивная модель» и конъюгация не одно и то же, поскольку собственно Т-ДНК в бактерии не переносится. Она может попадать в бактериальные клетки только при конъюгационном переносе всей плазмиды, что было убедительно показано в проведенных экспериментах, детально обсуждаемых далее.
Для выяснения этого вопроса в своей работе мы использовали наглядную систему с бинарными векторами. В практике трансформации растений широко применяют удобные в работе бинарные векторные системы, где vir-гены и Т-ДНК находятся на разных репликонах, причем Т-ДНК находится в составе относительно небольшой плазмиды (не более 15 кб в сравнении с 200230 кб природной Ti-плазмиды), что облегчает манипуляции с ней. В таких системах отсутствуют tra-гены Тьплазмид, что исключает их возможное ингибирующее либо стимулирующее действие на экспрессию vir-генов, как это может быть в случае с природными Ti-плазмидами. Следует отметить, что природные Ti-плазмиды, имеющие
обе системы переноса ДНК, переносятся между бактериями исключительно только за счет экспрессии tra-генов [20].
Основное различие у двух используемых нами бинарных векторов состояло в наличии обеих границ Т-ДНК либо только одной правой границы, что в принципе позволяет следить за переносом либо целой плазмиды, либо только ее Т-ДНК. Целая плазмида может поддерживаться в клетках реципиента автономно или Т-ДНК может встроиться в хромосому подобно тому как она встраивается в хромосому растений. Однако трансконъюгатов в этих экспериментах получено не было: появления маркера бинарного вектора в энтеробактериях при межвидовых скрещиваниях мы не наблюдали (см. табл. 4). Даже дополнительное введение плазмиды RSF1010 в клетки агробактерий с бинарными векторами (vir-гены и Т-ДНК плюс mob-гены in trans) не позволяет осуществить перенос Т-ДНК в бактерии. В то же время присутствие бинарного вектора на перенос RSF1010 в таких системах существенного влияния не оказывает.
В обоих указанных вариантах в клетках трансконъюгантов обнаруживалась ДНК плазмид pRSC1 или pRSK1, но не бинарного вектора, поскольку выявляемые плазмиды имели соответствующие размеры и кодировали устойчивость к соответствующим антибиотикам. Кроме того, в клетках трансконъюгатов экспрессировался ген левансахаразы sacB - они были чувствительны к сахарозе. На рис. 3 приведены результаты посева бактерий (103 клеток) штамма E.coli HB101 на питательный агар, содержащий 5% сахарозы.
(
J
Рис. 3. Результаты посева бактериальных клеток на среды с сахарозой: а - штамм Е.еоН НВ101, содержащий плазмиду рЯЖ1, на ЬВ-агаре с 5% сахарозой; б - бес-плазмидный штамм Е.еоН НВ101 (контроль)
Слева (а) посеяны бактерии штамма-транс-конъюгата с перенесенной плазмидой рЯБК1, справа (б) - исходного штамма после 2-суточной
В. А. Великов. Vir-обусловленный перенос производных плазмиды R5F1010
инкубации при 37 °С. Видно, что в варианте а отсутствуют бактериальные колонии, в то время как исходный штамм хорошо растет на среде с сахарозой.
Таким образом, Т-ДНК не переносится из агробактерий в клетки энтеробактерий даже в присутствии плазмиды-помощника RSF1010, способной преодолевать этот барьер. Вероятно, отрицательный результат по переносу Т-ДНК в бактерии может быть связан с тем, что ожидаемые в результате переноса Т-ДНК-несущие плазмиды должны сразу же циркуляризоваться для того, чтобы сохраниться в клетках (что происходит при конъюгационном переносе плазмид еще на внутренней мембране клетки-реципиента), а для этого необходимо присутствие особых генетических детерминант. Эти детерминанты, обеспечивающие процесс «репликонации» вместе с другими жизненно важными функциями плазмид rep,par, inc, cop картируются сцепленно в области так называемого «базового репликона» [21]. В наших бинарных системах таких детерминант нет, поскольку Т-ДНК не поддерживается автономно в растительной клетке, а должна встроиться в хромосому. Механизмы же интеграции Т-ДНК в хромосому при переносе в бактерии нарушены, поскольку про- и эукариотические хромосомы сильно различаются. Это представляется наиболее вероятной причиной отрицательного результата при работе с бинарной системой.
Исчезновение детерминант, обеспечивающих циклизацию перенесенного материала в системе транспорта Т-ДНК в растениях, могло произойти в процессе ее эволюции из конъюгационной в то время, когда произошла дупликация oriT, т. е. когда произошло появление границ Т-ДНК. Появление двух границ (или нескольких как у октопиновых Ti-плазмид) явилось, на наш взгляд, ключевым этапом в ее становлении и развитии. Терминация репликации на никированной левой границе позволила избежать затрат на бессмысленный с точки зрения эволюции транспорт в растения материала Ti-плазмиды, устроенного по прокариотическому принципу. Такое явление было закреплено отбором и в дальнейшем обе системы, объединившись на одном реплико-не, эволюционировали сопряженно. Поэтому описанные расхождения в гомологии vir-генов Ti-плазмид с собственными tra-генами иногда значительно больше, чем с tra-генами некоторых других плазмид [4].
Таким образом, установленная трудами многих исследований гомология в нуклеотидных последовательностях vir- и tra-генов и способность агробактерий к vir-обусловленному транспорту природной плазмиды RSF1010 как в раститель-
ные, так и в бактериальные клетки лишь косвенно подтверждает конъюгативную модель переноса Т-ДНК в растения, но не ставит знак равенства между конъюгацией и агробактериальной генетической трансформацией растений. Обе системы переноса ДНК природных Ti-плазмид являются глубоко специализированными, работают в клетке независимо друг от друга и экспрессируются, по всей вероятности, альтернативно.
Способность векторов на основе RSF1010 попадать в клетки неродственных бактерий, на наш взгляд, опасности не представляет, поскольку для того чтобы эти бактерии смогли трансформировать растения, необходимо совместное присутствие Ti-плазмидных vir-генов и хромосомных chv-генов Agrobacterium tumefaciens, которые у энтеробактерий отсутствуют. В то же время эксперименты показывают, что бактерии рода Agrobacterium способны к эффективному обмену генетической информацией с другими бактериями с использованием самых разнообразных механизмов транспорта ДНК из клетки в клетку.
Список литературы
1. ChiltonM.-D., DrummondM. N., MerloD. J., MontoyaA., Gordon M. P., Nester E. W. Stable incorporation of plas-mid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis // Cell. 1977. Vol. 11, № 2. P. 263-267.
2. Lessl M., Balser D., Pansegraw W., Lanka E. Seg-uence similarities between the RP4 Tra2 and the VirB region strongly support the conjugation model for T-DNA transfer // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, № 28. P. 20471-20480.
3. Shirasu K. Membrane location of the Ti plasmid VirB proteins involved in the biosynthesis of a pilin-like con-jugative structure on Agrobacterium tumefaciens // FEMS Microbiol. Letters. 1993. Vol. 111, № 2-3. P. 287-294.
4. Alt-Moerbe J., Stryker L., Fugua C., Li P. L., Farrand S. K., Winans S. C. The conjugal transfer system of Agrobac-terium tumefaciens octopine-type Ti plasmids is closely related to the transfer system of an IncP plasmid and distantly related to Ti plasmid vir genes // J. Bacteriol. 1996. Vol. 178, № 14. P. 4148-4257.
5. CookD. M., Farrand S. K. The Ori T region of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58 shares DNA seguence identity with the transfer origin of RSF1010 and RK2/RP4 and with T region borders // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174, № 19. P. 6238-6246.
6. Buchanan-Wollaston V., Passiatore J. E., Cannon F. The mob and oriT mobilization functions of a bacterial plasmid promote its transfer to plants // Nature. 1997. Vol. 328. P. 172-176.
7. Lee L. Y., Gelvin S. V. Osa protein constitutes a strong oncogenic suppression system that can block vir-dependent transfer of IncQ plasmids between Agrobacterium cells and the establishment of IncQ plasmids in plant cells // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, № 21. P. 7254-7561.
