CC BY
253
© о. А. кулаева, т. в. матвеева, л. а. лутова
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург
' под горизонтальным переносом генов понимают передачу генетического материала между организмами, которых нельзя определить в терминах родитель и потомок. существуют данные о том, что некоторые растения содержат в своих геномах последовательности, гомологичные т-Днк из агробактерий. определенные гены rol из Agrobacterium rhizogenes присутствуют в ряде видов рода Nicotiana как результат горизонтального переноса генов в эволюции данного рода растений. описанию этого явления и посвящен данный обзор.
' ключевые слова: горизонтальный перенос генов, Nicotiana, Agrobacterium rhizogenes
ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ ОТ АГРОБАКТЕРИЙ К РАСТЕНИЯМ
ВВЕДЕНИЕ
Под горизонтальным переносом генов понимают передачу генетического материала между организмами, которых нельзя определить в терминах родитель и потомок. На механизме горизонтального переноса основана генная инженерия. Однако для природных процессов значение этого явления еще не вполне ясно.
Для прокариотических организмов это — типичный механизм проявления комбинативной изменчивости, заменяющий половой процесс в его традиционных формах. Благодаря этому механизму полезные для бактериальной популяции свойства, например устойчивость к антибиотикам, очень быстро становятся всеобщим достоянием [15].
Эукариоты выработали специальные сложные адаптации для того, чтобы ограничивать и контролировать процесс горизонтального переноса генов. Важнейшими из этих адаптаций являются половое размножение и репродуктивная изоляция видов (изоляция, конечно, тоже не абсолютная); собственно, именно появление полового размножения и репродуктивной изоляции и привело к формированию нового класса биологических систем — эндогамных видов. Тем не менее, и эукариоты способны заимствовать чужие гены. Например, показано горизонтальное перемещение Р мобильных элементов среди разных видов Drosophila [11].
Множество кандидатов для изучения горизонтально перенесенных генов было выявлено у прокариот, получены многочисленные данные, касающиеся переноса генетической информации от бактерий к эукариотам. Считается установленным симбиотический характер «приобретения» эукариотами пластид и митохондрий от бактериальных эндосимбионтов [6, 26]. Горизонтальный перенос возможен от бактерий к животным. В Х-хромосоме некоторых насекомых учеными был обнаружен фрагмент генома Wolbachia (внутриклеточного эндосимбионта насекомых, влияющего на репродуктивный успех хозяина) [3]. Используя данные проекта по изучению генома Giardia, Андерсон с соавторами обнаружили в геноме дипломонады Giardia lamblia гены бактериальной природы. Большая часть этих генов кодирует белки, вовлеченные в анаэробный метаболизм. Данный факт указывает на существенную роль горизонтального переноса генов в процессе адаптации дипломонад к анаэробным условиям [3].
Имеются интересные данные о горизонтальном переносе генов в системе хозяин-паразит между грибами и их факультативными микопаразитами Parasitella parasitica [24], о переносе генов плазмидами и вирусами в симбиотических системах красных водорослей. Приводятся убедительные аргументы в пользу того, что некоторые растения, в частности звездчатка Stellaria, получили гены цитохромов от грибов в результате горизонтального переноса [42].
Была смоделирована система переноса генов от E.coli к некоторым видам Streptomyces и Saccharomyces [28]. Возможность переноса генов от растения к бактерии была исследована Шлетером, который исследовал перенос генов от растений картофеля к их патогену Erwinia chrysanthemi [36]. Был сделан вывод о том, что если такое событие и происходит в природе, то встречается оно крайне редко.
Горизонтальный перенос генов возможен и между животными и растениями. Было показано наличие гомологии между последователь-
ностью первого интрона РАР гена перца Capsicum annum и SINE элементом, относящемся к Ts ретро-транспозонам животных [35].
К настоящему моменту примеры горизонтального переноса генов в течение эволюции растительных видов четко показаны у представителей рода Nicotiana. Поиск новых примеров горизонтального переноса генов чрезвычайно важен для фундаментальной и прикладной науки. Остановимся подробнее на рассмотрении этого явления.
механизмы приобретения изменений посредством горизонтального переноса
Как и эволюция, осуществляемая вертикально наследуемыми изменениями, приобретение изменений посредством горизонтального переноса является следствием существования определенных процессов и механизмов. Во-первых, это процессы, делающие возможным обмен генетической информацией между разными организмами: коньюгация, трансформация, трансдукция. Во-вторых, это существование своего рода «транспортировочных средств» — плазмид, транспозонов, бактериофагов и вирусов. В-третьих, это работа механизмов, обеспечивающих поддержание приобретенной последовательности в чужом геноме — рекомбинация, модификация, репликация, репарация. В-четвертых, это способы осуществления экспрессии «чужой» последовательности.
особенности горизонтально перенесенных последовательностей
Рассеянное(случайное)распределение генов какой-либо последовательности среди самых различных видов, вне зависимости от их родства и принадлежности к какому-либо определенному таксону, является признаком того, что эта последовательность является «чужой». [32]. Примером этого является экспансия за последние 50 лет генов анти-биотикоустойчивости среди патогенов человека и животных и ассоциированными с ними коммен-сальными популяциями бактерий, а также оперонов деградации ксенобиотиков. Именно за счет горизонтального переноса, а не мутационным путем, происходит быстрая адаптация к различным антибиотикам и ксенобиотикам среди бактерий. Переносимые детерминанты ассоциированы с мобильными генетическими элементами такими, как плазмиды, транспозоны, генные кассеты, бактериофаги, которые являются своего рода транспортными средствами, распространяя детерминанты устойчивости (по одному или в кластерах), между родами и видами
бактерий. По сравнению с антибиотикоустойчивос-тью процессы, ведущие к деградации ксенобиотиков, требуют более комплексных генетических систем, обычно это опероны из 10 и более генов или даже регулоны нескольких оперонов. Например, большая конъюгативная плазмида pNL1 Sphingomonas aromaticovorans содержит 15 генных кластеров, напрямую вовлеченных в катаболизм и транспорт ароматических соединений, что позволяет хозяйской клетке утилизировать такие соединения, как бифенил, нафтален, ксилен и крезол. Биодеградацион-ные опероны часто интегрированы в хромосому, при этом соседствующие остатки фагов или плазмид напоминают о некогда подвижной природе этих оперонов. Перенос генов и оперонов играет важную роль в процессе адаптации прокариот к разнообразным экологическим нишам [15].
О направлении горизонтального переноса генов (если он имел место) в ряде случаев можно судить по характерным особенностям исследуемых последовательностей: эукариотические черты генов, обнаруженных в бактериальном геноме, говорят об их эукариотическом происхождении и наоборот. Например, у агробактерий обнаружен ген ros, продукт которого является регулятором гена ipt и имеет в своей структуре домен типа цинковых пальцев, характерный для эукариотических регуляторов транскрипции. Предполагается, что ген ros мог оказаться в геноме агробактерий в результате горизонтального переноса [ 10].
Узкое филогенетическое распределение генов в пределах одной или нескольких групп также может свидетельствовать об их «чужеродности». Примером могут служить данные, свидетельствующие о том, что некоторые нетрансформированные растения рода Nicotiana в своих геномах содержат последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes, что указывает на участие горизонтального переноса генов в эволюции рода Nicotiana.
агробактериальная трансформация и строение RiИ TI плазмид
Агробактерии — это почвенные бактерии, патогены растений, способные к переносу набора генов в геном хозяина посредством плазмиды (названной pRi в случае A. rhizogenes и pTi в случае A. mtumefaciens). A. rhizogenes вызывает у зараженных растений появление синдрома «бородатого корня», выражающегося в более быстром, пла-гиотропном росте сильно ветвящихся корней [9]. Ri плазмида содержит Т-ДНК, включающую в себя гены rol (от root locus) (A,B,C,D), ответственные за индукцию образования дополнительных корней, и открытые рамки считывания ORF13 и ORF14 —
гены, необходимые для усиления индукции корне-образования [8]. Т-ДНК расположена между парой прямых повторов и переносится из бактериальной в растительную клетку с последующей индукцией образования «бородатых» корней. Растения — ре-генеранты, полученные из такой корневой культуры, трансгенные по всей Т-ДНК Ri плазмиды или трансформированные одним из четырех генов, показывают фенотипические изменения в морфологии растений (карликовость, нарушение апикального доминирования), особенно листьев (сморщенность) и цветков, и модификацию гормональных потребностей инфицированных тканей in vitro [43]. Показано, что у трансформированных растений изменяется содержание таких фитогормонов, как цитокинины, абсци-зовая кислота, гиббереллины и ауксин. По-видимому, спонтанное корнеобразование у трансформированных растений происходит не из-за изменения баланса эндогенных гормонов, а вследствие повышения чувствительности клеток к ауксину. Хотя изучение генов rol ведется уже длительный период времени, вопрос о действии и функциях продуктов этих генов остается открытым (табл. 1) [30]. Функция продукта гена rolC до сих пор не выяснена до конца, но описано его влияние на метаболизм цитокининов и гибберелинов [33]. Гиперэкспрессия гена rolC приводит к общей ювенилизации (цитокининпо-добному эффекту), хотя одновременно стимулирует также пролиферацию корней [37]. Продуктом гена Ri rolB является тирозин фосфатаза, локализованная на плазматической мембране. Белок RolB участвует в каскаде реакций, определяющих трансдукцию ауксинового сигнала [12]. Уровень экспрессии этого гена является ауксинзависимым [27]. Показана корреляция образования дополнительных боковых
корней и взаимодействие продукта гена rolB с 14 — 3 — 3 белками табака [30]. Молекулярная активность продукта гена rolA пока не известна. Установлено, что он увеличивает чувствительность к ауксину во время цветения и может стимулировать корнеоб-разование и рост корней. Продукты генов ORF13 и ORF14 еще не идентифицировали, но предполагается их участие в негативной регуляции патогенеза [17, 25]. Показано, что ORF13 вызывает экспрессию генов транскрипционных факторов KNOX, а также некоторых генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла у томата. Продукт гена ORF 13 содержит ретинобластома-связывающий мотив и взаимодействует с белком ретинобластомы in vitrcj, что приводит к переходу инфицированных агробактерией клеток из фазы G1 в S фазу. В ПАМ (побеговой апикальной меристеме) это взаимодействие приводит к увеличению числа клеточных делений и повышенному образованию листовых зачатков. В листьях вмешательство ORF13 в регуляцию клеточного цикла приводит к более ранней остановке развития органа [40]. Фенотипический эффект трансформации табака ORF13 под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты проявляется в укорочении междоузлий, деформации листьев, мужской стерильности и снижении апикального доминирования.
A. tumefaciens вызывает у зараженных растений образование в месте соединения стебля и корня опухолей, называемых корончатыми галлами. Корончатые галлы появляются в результате сверхпродукции фитогормонов ауксина и цитокинина, которая определяется генами Т-ДНК. Ti плазмида A. tumefaciens является удобной векторной системой для трансформации [38]. В участке Т-ДНК гомологичном у разных Ti плазмид выявили три гена, участвующие
Таблица 1
Функции онкогенов агробактерий (по Filippini F. et al., 1996; Stieger P. et al., 2004; Klee H. S. and Romano C. P., 1994; Maurel C. et al., 1994)
Вид агробактерии Онкоген Предполагаемая функция
Л CU с cu &) 0 1c s— < rolB Участник сигнальной трансдукции ауксина
rolC Влияние на метаболизм цитокининов и гиббереллинов
rolA Повышает чувствительность клеток к ауксину во время цветения, стимуляция корнеобразования и роста корней
ORF^ Регуляция клеточного цикла
ORF14 Негативная регуляция патогенеза
сл с <u '0 «iS <u E D < Tmsl Превращение триптофана в индолил-3-ацетамид (ИАМ)
Tms2 Превращение ИАМ в индолилуксусную кислоту
Tmr (ipt) Контроль первой ступени биосинтеза цитокинина
5 Модификация ростовых характеристик опухолей, индуцированных Т-ДНК
6b Модификация чувствительности растительных тканей к цитокининам
в биосинтезе фитогормонов (табл. 1). Инактивация каждого из этих генов приводила к значительным изменениям опухолевого фенотипа, супрессия всех трех генов приводила к ингибированию опухоле-образования [34]. Гены tmsl и tms2 контролируют механизм биосинтеза индолилуксусной кислоты из триптофана, характерный для бактерий [21, 44]. Ген tmr (ipt) кодирует изопентинилтрансферазу, результатом действия которой является образование изопентиладенозинмонофосфата, из которого образуется зеатин и его производные [22]. В Т-ДНК некоторых штаммов A. tumefaciens присутствует также ген 5 (по номеру транскрипта). Продукт этого гена способен превращать триптофан в индо-лил-3-лактат — слабый аналог ауксина, который действует как антагонист ауксина, связываясь с сайтами связывания этого фитогормона [23]. В Т-ДНК Ti-плазмид выделяют также локус tml, мутация в этом локусе вызывает образование больших опухолей у трансформированных растений. В составе этого локуса выделяют ген 6b, модифицирующий чувствительность растительных тканей к цитокини-нам [39] (табл. 1).
поиск последовательностей гомологичных т-днк agrobacterium rhizogenes в геномах растений рода nicotiana
В 1982 году Уайт с соавторами [45] обнаружили Т-ДНК подобную последовательность в геноме не-трансформированного Nicotiana glauca. Обнаруженная последовательность была более чем на 80 % гомологична
Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes и была названа кл (клеточная)-ДНК [46]. Гибридизацией по Са-узерну было показано, что кл-ДНК содержит последовательности ORFs 11 (rolB), 12(rolC), 13, 14, и 15 (rolD), которые были названы NgrolB, NgrolC, NgORF13, NgORF14 и NgrolD, соответственно. Кл-ДНК была представлена несовершенными инвертированными повторами, которые содержали одну копию гена NgrolB и по две копии остальных генов. Повторы, гомологичные Т-ДНК A. rhizogenes, названные левым и правым «плечами», простираются приблизительно на 10 kb (рис. 1) [14].
В геноме N. tabacum тоже были найдены последовательности, гомологичные генам rol A. rhizogenes, названные trol, или tORF [13, 29]. Была выдвинута гипотеза возникновения этих генов в эволюции рода Nicotiana, благодаря горизонтальному переносу.
Анализ экспрессии вышеуказанных онкогенов показал, что она является тканеспецифичной и присутствует как в исходных видах, так и в опухолевых
гибридах. Было показано, что tORF13 экспрессируется в молодых листьях, чашелистиках, лепестках и апексах, ген trolC экспрессируется в молодых тканях N. tabacum [13, 29]. Экспрессия генов NgrolC и NgrolB была выявлена в стеблях N. glauca [4]. В опухолях, формирующихся у гибридов N. glauca Х N. langsdorffii обнаружили экспрессию NgrolC, NgORF13, NgORF14 и NgrolB [5, 18]. Нагата с соавторами [31] изучили экспрессию генов NgrolC и NgrolB в генетических опухолях, инициированных на отрезанных листьях табака, и показал, что ген NgrolB экспрессируется у трехдневных эксплантов во всех делящихся клетках в месте среза, в то время как ген NgrolC экспрессируется в дифференцированных тканях таких, как прокамбий в тератомах. Во время регенерации растений и опухолевых тканей наблюдалось градуальное уменьшение экспрессии этих генов. Авторы предположили, что гены Ngrol могут участвовать в генетическом контроле образования опухолей: NgrolB на стадии митозов, а NgrolC на стадии дифференцировки тканей. Однако обнаружение экспрессии этих генов не только в опухолевых гибридах, но и в исходных видах, внесло некоторые сомнения в гипотезу их участия в процессе образования опухолей у табака. Кроме того, не все из этих генов кодируют функциональные продукты [4, 25]. Ген NgrolB содержит две точковые мутации, негативно воздействующие на его функционирование, при этом активность гена NgrolC сохранилась с момента агробактериальной трансформации пред-ковых видов табака [4]. Некоторые авторы предполагают гормональную регуляцию генов Ngrol. Ауксином позитивно регулируется уровень экспрессии NgrolB, негативно — NgrolC [5, 18]. В тканях листа N. tabacum накопление мРНК trolC негативно регулируется ауксином и индуцируется цитокинином [13, 29]. Регуляторные участки генов Ngrol схожи с таковыми у генов Ri rol A. rhizogenes. В парах NgrolB-Ri rolB, NgrolC- Ri rolC была показана похожая тка-неспецифичность экспрессии и схожий механизм регуляции ауксином [31].
Интриери и Буятти проанализировали распространение и последовательности генов rol у большого числа видов рода Nicotiana (табл. 2). Была сделана попытка проследить эволюцию генов rol у рода Nicotiana и оценить их влияние дифференци-ровку видов этого рода [20].
Для обнаружения генов rol авторами был использован ПЦР-анализ. ДНК выделяли из тканей листа и амплифицировали с использованием ПЦР-прай-меров, последовательности которых находились на границах кодирующей последовательности каждого из четырех генов. То есть с их помощью можно было амплифицировать полноразмерный ген. Эксперименты, проведенные с праймером rolC N. glauca,
Таблица 2
виды рода Nicotiana, исследованные Intrieri M. C. and Buiatti M. (Intrieri M. C. and Buiatti M., 2001)
Подрод Вид Ген
Rustica N. glauca rolC rolB ORF13 ORF14
N. cordifolia rolC rolB ORF13 ORF14
N. benavidesii rolC
Tabacum N. tomentosiformis rolC ORF13 ORF14
N. otophora rolC ORF13 ORF14
N. setchelli rolC
N. tabacum rolC ORF13 ORF14
Petunioides N. arentsii rolC
N. acuminata rolC
N. miersi rolB
N. bigelovii rolB
N. debneyi rolC
N. gossei rolC
N. suaveolens rolC
N. exigua rolC
обеспечили амплификацию фрагмента ожидаемого размера 543 bp у видов N. glauca, N. cordifolia, N. debneyi. Была проведена также амплификация фрагментов с использованием праймеров rolC N. tabacum у N. tabacum, N. tomentosiformis, N. otophora, N. suaveolens. Для подтверждения специфичности полученных фрагментов пробы ПЦР были разделены в 1,2 % агарозном геле, перенесены на нейлоновые мембраны и гибридизова-ны с соответствующими последовательностями из A. rhizogenes и N. glauca. В обоих случаях гибриди-зационные профили подтвердили данные ПЦР и выявили дополнительные амплифицированные фрагменты, невидимые на геле у большого числа видов (N. benavidesi, N. setchelli, N. arentsi, N. acuminata, N. gossei, N. exigua). Присутствие последовательностей, подобных го1В, было выявлено в гибридизаци-онных экспериментах у N. glauca и N. cordifolia. Также были проведены эксперименты с использованием праймеров ORF13 и ORF14 N. glauca. Фрагменты ожидаемого размера были получены у видов, принадлежащих к подродам Rustica и Tabacum (N. cordifolia, N. tabacum, N. tomentosiformis, N. otophora).
У N. glauca участок, полученный от A. rhizogenes, организован как несовершенный инвертированный повтор и порядок генов соответствует таковому в Ri плазмиде. Исследования, проведенные с комбинациями праймеров для амплификации единичных генов rol, показали, что у N. cordifolia исследуемый участок практически идентичен таковому в Ri плазмиде. У N. debneyi большой участок, включающий
rolB, ORF13 и ORF14, по-видимому, делетирован. N. tomentosiformis и N. tabacum вероятно потеряли rolB и участок внутригенной последовательности, располагавшийся до rolC и ORF13.
В 1930 году Костов описал образование опухолей у гибридов Nicotiana. Наф разделил все виды табака на две группы: « + » и « — ». Основываясь на их морфологических характеристиках, виды из группы « + » были также названы побегообразующими, виды из группы « — » — корнеобразующими. Скрещивания внутри группы не ведут к опухолеобразованию. Гибриды, полученные от скрещиваний видов из групп « + » и « — », являются опухолеобразующими [цит. по 1, 19].
Интриери и Буятти исследовали распространение генов rol у рода Nicotiana и показали их отсутствие у всех побегообразующих видов, и их присутствие у корнеобразующих видов [20]. Методом ПЦР с обратной транскрипцией был проведен анализ экспрессии генов rol, обнаруженных у представителей рода Nicotiana (табл. 3). мРНК trolB присутствовала во всех гормоннезависимых каллусных тканях, но не в листовых эксплантах. RolC экспрессировался в каллусах и листьях у видов подрода Rustica, N. glauca и N.cordifolia, только в каллусах у видов подрода Petunioides и никакой экспрессии не наблюдалось у видов подрода Тabacum. ORF13 и ORF14 всегда экспрессировались в каллусе всех видов, а ORF13 транскрибировался в листьях N. tabacum и N. tomentosiformis [20]. В опухолевых тканях экспрессировались все гены [4, 5, 18, 31].
Таблица 3
Анализ экспрессии последовательностей, подобных онкогенам A. rhizogenes (Intrieri M. C. and Buiatti M., 2001)
Вид Ткань
лист каллус
Экспрессия rolB
N. glauca - +
N. cordifolia +
N. langsdorffii - -
N. miersi - +
Экспрессия rolC
N. glauca + +
N. cordifolia + +
N. tabacum - -
N. tomentosiformis - -
N. langsdorffii - -
N. debneyi - +
Экспрессия ORF13
N. glauca - +
N. cordifolia - +
N. tabacum + +
N. tomentosiformis + +
N. langsdorffii - -
Экспрессия ORF14
N. glauca - +
N. cordifolia - +
N. tabacum - -
N. tomentosiformis - -
N. langsdorffii - -
« + » — обнаружение экспрессии онкогена « — » — отсутствие экспрессии онкогена
Предполагают, что у межвидовых гибридов Nicotiana, родительские формы которых относятся к разным по знаку группам, опухоли образуются благодаря комбинации двух факторов: экспрессии генов rol и экспрессии генов «побегообразования». Руководствуясь экспериментальными данными, согласно которым в культуре in vitro N. glauca из группы « — » характеризуется более низкой потребностью в ауксинах для индукции корнеобразования, а N. langsdorffii из группы « + » — более низкой потребностью в цито-кининах для индукции побегообразования, Ишикава и Сионо предложили следующую гипотезу опухоле-образования у табака. Виды группы « — » несут гены, усиливающие синтез свободных ауксинов и/или чувс-
твительность к ним. Виды группы « + » несут гены, усиливающие синтез свободных цитокининов и/или чувствительность к ним. У гибридных растений эти гены объединяются и в результате внешнего (физические факторы) и/или внутреннего (гибридизация) стресса активируются [19].
Гипотеза коэволюции перенесенных бактериальных генов и растительных геномов подтверждается данными филогенетического анализа генов ю1С, ORF13 и ORF14 растений и бактерий, проведенного с использованием программы MEGA (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) [20]. Характер дивергенции всех перенесенных бактериальных генов схож с дивергенцией видов Nicotiana, описанной Гудспит [ 16].
Сузуки с соавторами исследовали происхождение и структуру клТ-ДНК в геномах растений рода Nicotiana [41]. Было выявлено, что клТ-ДНК N. glauca происходит от Т-ДНК Ri плазмиды мики-мопинового типа A. rhizogenes. КлТ-ДНК содержит два гомолога генов микимопинсинтазы (mis), NgmisL, NgmisR (рис. 1).
Во всех органах N. glauca выявляется низкий уровень транскрипции этих гомологов. Гомолог mis был также обнаружен в геномах трех других видов Nicotiana: N. tomentosiformis, N. tomentosa, N. tabacum. Место инсерции бактериальных генов у этих трех видов отличается от такового у N. glauca. Это свидетельствует о независимом инфицировании предков некоторых растений Nicotiana Ri плазмидой микимопинового типа A. rhizogenes. Время каждого инфицирования не установлено, но предполагается, что включение Т-ДНК в геном N. tomentosiformis произошло менее, чем шесть миллионов лет назад, еще до образования N. tabacum. На основании результатов гибридизации ДНК-видов рода Nicotiana и гомологов генов микимопинсинтазы была построена схема дивергенции части рода Nicotiana (рис. 2). На данный момент установлено, что существуют две группы клТ-ДНК: одна в подроде Rustica и другая в под-роде Tabacum, поскольку локализация клТ-ДНК в геноме N. glauca отличается от таковой у представителей подрода Tabacum [41].
С*
і
-О
А
N. glauca
N. benavidesii N. knightiana N. paniculata N. rustica (N. undulata) N. langsdorffii
N. sylvestris
N. tabacum
N. tomentosiformis
N. tomentosa
N. otophora N. glutinosa
Рис. 2 Схема дивергенции части рода Nicotiana (черные и белые стрелки показывают предполагаемое инфицирование плазмидой микимопинового типа и неизвестного типа опинов, соответственно. Виды, содержащие Т-ДнК Щ плазмиды микимопинового типа, заключены в прямоугольник, виды, содержащие Т-ДНК Щ плазмиды неизвестного типа опинов, подчеркнуты) (Suzuki К. et а1, 2002)
RB
A. rhizogenes pRi 1724 DNA
И 7771 Б53
rol A V/A rol C ORF13 £ OR 1 1 j
rol B
ORF13a
mis
1 kb
NgmisL
N. glauca genome DNA
probe
NgrolCR NgORF13R NgORF14R
NgORF14L NgORF13L NgrolCL [ ^ ш шNgmisR
т Y7À j! N grolB ! Щ VJJJl NgORF13aR [ 1
E
H
NgL
EE E
I—I
NgORF13
■Regions sequenced in the present study
EE
NgmisR
H h
NgR
-►
-► Region previously sequenced by Aoki et al. (1994)
Region previously sequenced by Furner et al. (1986)
Рис. 1. Структура клТ-ДНК в геноме N.glauca (пояснения в meKcme)(Suzuki K. et al., 2002)
E
E
E
роль горизонтального переноса генов в эволюции рода nicotiana
Предполагается, что перенос агробактериальных онкогенов произошел на раннем этапе эволюции рода Nicotiana. Высокий уровень консервативности перенесенных последовательностей и влияние онкогенов A. rhizogenes на изменение чувствительности трансформированных клеток к эндогенным фитогормонам позволяет говорить о физиологической роли онкогенов A. rhizogenes, возможно, внесшей вклад в эволюцию видов рода Nicotiana. В ходе эволюции род Nicotiana разделился на две группы: подрод Cestroid и Petunioid. У представителей этих двух групп наблюдается разное соотношение ауксинов и цитокининов
[7]. Листовые экспланты растений этих двух групп могут формировать корни или побеги, соответственно. Отсутствие генов rol у всех побегообразующих видов и их присутствие у корнеобразующих видов, а также влияние генов rol на чувствительность клеток к фитогормонам, позволяет предположить, что разделение рода на две группы может быть связано с привнесением в растительный геном агробактериальных онкогенов. Зависимость экспрессии онкогенов от физиологического контекста (соотношения гормонов) также свидетельствует в поддержку этой гипотезы [20]. Предполагается, что возникновение в эволюции опухолеобразующих межвидовых гибридов табака (возможно, связанное с привнесением онкогенов в растительный геном) служило барьером к образованию внутривидовых гибридов и, таким образом, влияло на видообразование. рШ- трансгенные растения показывают фенотипические изменения в морфологии растений (карликовость, нарушение апикального доминирования), особенно листьев (сморщенность) и цветков, модификацию гормональных потребностей инфицированных тканей in vitro и увеличение корневой массы [43]. Увеличение корневой массы, возможно, было очень выгодным в условиях засушливого климата.
заключение
Поиск последовательностей, подобных онкогенам Т-ДНК А. rhizogenes, ведется уже два десятилетия. В основном все исследования сосредоточены на изучении этого явления у рода Nicotiana. Постулировано, что на раннем этапе эволюции рода Nicotiana некоторые его представители были инфицированы предком А. rhizogenes. В результате этого заражения часть последовательности Т-ДНК агробактерий встроилась в растительный геном. К настоящему времени последовательности, подобные онкогенам Т-ДНК А. rhizogenes, обнаружены у 15 видов таба-
ков [20]. Представители рода Nicotiana — это в основном однолетние травы и небольшие кустарники. Они хорошо размножаются как семенами, так и вегетативно. Показана хорошая регенерационная способность табаков [2]. Высказываются предположения, что вышеперечисленные факторы могли повлиять на появление и закрепление в геноме табаков онкогеноподобных последовательностей. Высокий уровень консервативности перенесенных последовательностей и влияние онкогенов А. rhizogenes на изменение чувствительности трансформированных клеток к эндогенным фитогормонам позволяет говорить о физиологической роли онкогенов А. rhizogenes, возможно внесшей вклад в эволюцию видов рода Nicotiana. Поиск новых примеров горизонтального переноса генов чрезвычайно важен для фундаментальной и прикладной науки. Возможно, что исследования по данной теме надо сосредоточить на изучении видов, обладающих следующими чертами. Чтобы перенесенные последовательности закрепились в геноме в череде последовательных поколений, эти растения должны хорошо размножаться как семенами, так и вегетативно. Инфицирование агробактерией происходит только в случае поранения растения. Растения, несущие вставку Т-ДНК, регенерируют из пораненной области растения. Таким образом, высокая способность к регенерации является существенным ограничением при выборе растений для исследования. Поскольку, показано, что агробактериальная трансформация однодольных растений затруднена, то, скорее всего, онкогеноподобные последовательности стоит искать в двудольных растениях. На сегодня описано мало свидетельств горизонтального переноса генов. Однако можно предположить, что последовательности Т-ДНК из разных видов агробактерий в процессе эволюции независимо встраивались в геномы различных видов растений. В части геномов они сохранились до наших дней (например, у представителей рода Nicotiana), в то время как у других растений могли быть утеряны.
Описание бактериальных генов, присутствующих в сельскохозяйственных культурах, может помочь успокоить общественное мнение относительно использования генно-инженерных пищевых продуктов. Это особенно своевременно теперь, когда генная инженерия сельскохозяйственных культур подвергается нападкам как неестественный лабораторный процесс, который необходимо запретить. Если наши исследования продемонстрируют, что Т-ДНК от А. rhizogenes или А. tumefaciens присутствует в других растениях, включая пищевые культуры, то люди едят пищу, подвергнутую генно-инженерному воздействию, в течение тысячелетий.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы CRDF и Минобразования ВННЕ, грант ST012-0 и ВР2М12.
Литература
1. Байдербек Р. Опухоли растений / Байдербек Р. — Москва: Наука, 1981. (41).
2. Жуковский П. М. Культурная флора СССР / Жуковский П. М. — Л., 1971. — Т. 9. (46).
3. Andersson J. O. Phylogenetic analyses of diplomonad genes reveal frequent lateral gene transfers affecting eukaryotes/AnderssonJ.O.,SjogrenA.M.,DavisL.A.M. [et al.] // Curr.Biol.this issue. — 2002. — Vol. 32. (8). — P. 1123-1128. (5).
4. Aoki S. Horizontal gene transfer and mutation of Ngrol genes in the genome of Nicotiana glauca / Aoki S., Syono K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA — 1999. — Vol. 96., N 23. — P. 13229-13234. (36).
5. Aoki S. Sequence of the cellular T-DNA in the untransformed genome of Nicotiana glauca that is homologous to ORFs 13 and 14 of the Ri plasmid ana analysis of its expression in genetic tumors of N. glauca x N. langsdorfii / Aoki S., Kawaoka A., Sekine M. [et al.] // Mol.Gen.Genet. — 1994. — Vol. 243. — P. 706-710. (37).
6. Archibald J. M. Recycled plastids: a green movement in eukaryotic evolution / Archibald J. M., Keeling P. J. // Trends Genet. — 2002. — Vol.18. — P 577-584. (4).
7. Bogani P. A physiological and molecular analysis of the genus Nicotiana / Bogani P., Lio P., Intrieri M. // Molecular Phylogenetics and Evolution. — 1997. — Vol. 7. — P. 62-70. (45).
8. Capone I. Induction and growth properties of carrot roots with different complements of Agrobacterium rhizogenes T-DNA / Capone I., Spano L., Cardarelli M. [et al.] // Plant Mol. Biol. Vol. — 1989. — Vol. 13. — P. 43-52. (14).
9. Chilton M. D. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis / Chilton M. D., Drummond M. H., Merlo D. J. // Cell. — 1977. — Vol.11. — P 263-271. (13).
10. Chou A. Y. Agrobacterium transcriptional regulator Ros as a prokaryotic zink finger protein that regulates the plant oncogene ipt / Chou A.Y., Archdeacon J., Kado K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. — Vol. 95. — P. 5293-5298. (12).
11.Daniels S. B. Evidence for horizontal transmission of the P transposable element between Drosophila species / Daniels S. B., Peterson K. R., Strausbaugh L. D. [et al.] // Genetics / — 1990. — Vol. 124. — P. 339-355. (2).
12.Filippini F. A plant oncogene as a phosphatase / Filip-pini F., Rossi V., Marin O. [et al.] // Nature. — 1996. — Vol. 379. — P. 499-500. (19).
13. Frundt C. A tobacco homologue of the Ri-plasmid ORF13 gene causes cell proliferation in carrot root discs / Frundt C., Meyer A. D., Ichikawa T., Meins F. // Mol. Gen.Genet. — 1998. — Vol. 259, N 6. — P. 559568. (35).
14.Furner I. J. An Agrobacterium transformation in the evolution of the genus Nicotiana / Furner I. J., Huffman G. A., Amasino R. M. [et al.] // Nature. — 1986. — Vol. 319. — P. 422-427. (33).
15. Gogarten J. P. Prokaryotic evolution in light of gene transfer / Gogarten J. P., Doolittle W F., Lawrence J. G. // Mol. Biol. Evol. — 2002. (1).
16.Goodspeed T. H. Ed. The genus Nicotiana / Good-speed T H. — Waltham, 1954. (43).
17.Hansen G. A new open reading frame, encoding a putative regulatory protein, in Agrobacterium rhizogenes T-DNA / Hansen G., Vaubert D., Clerot D. [et al.] // Aacad.Sci. — 1994. — Vol. 317, N 1. — P 49-53. (22).
18.Ichikawa T. Evidence for the expression of the rol genes of N. glauca in genetic tumors of N. glauca x N. langsdorffii / Ichikawa T., Ozeki Y., Syono K. // Mol. Gen. Genet. — 1990. — Vol. 220, N 2. — P. 177180. (38).
19.Ichikawa T. Tobacco genetic tumors / Ichikawa T., Syono K. // Plant Cell Physiol. — 1991. — Vol. 32.
(8). — P. 1123-1128. (42).
20.Intrieri M. C. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and the evolution of the genus Nicotiana / Intrieri M. C., Buiatti M. // Molecular Phylogenetics and evolution. — 2001. — Vol. 20. (1) — P. 100-110. (40).
21.Inze D. Genetic analysis of the individual T-DNA genes of Agrobacterium tumefaciens: further evidence that two genes are involved in indole-3-acetic acid synthesis / Inze D., Follin A., Van Lijsebettens M. [et al.] // Mol. Gen. Genet. — 1984. — Vol.194. — P. 265-274. (26).
22.Klee H. S. The roles of phytohormones in development as studied in transgenic plants / Klee H. S., Romano C. P. // Crit. Rev. Plant. Sci. — 1994. — Vol. 13, N 4. — P. 311-324. (28).
23.Korber H. T-DNA gene 5 of Agrobacterium modulates auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone antagonist in plants / Korber H., Strizhov N., Staiger D. // EMBO J. — 1991. — Vol. 10. — P. 3983-3991. (29).
24. Koufopanov V. Adaptation for horizontal transfer in homing endonuclease / Koufopanov V, Goddard M. R., Burt A. // Mol. Biol. Evol. — 2002. — Vol. 19, — P 239-246. (6).
25. Lemcke K. and Schmulling T. A putative rolB gene homologue of Agrobacterium rhizogenes TR-DNA has different morphogenetic activity in tobacco than rolB // Plant. Mol. Biol. — 1998. — Vol. 16. — no. 5. — P 803-808. (21).
26.Margulis L. Symbiosis in cell evolution: microbial communities in the archean and proterozoic eons. 2nd end / Margulis L. — W H. Freeman &Co, 1995. (3).
27.Maurel C. Alterations of auxin perception in rolB mRNA expression and increase in auxin sensitivity reveal multiple control by auxin / Maurel C., Leblanc N., Barbier-Brygoo H. [et al.] // Plant Physiol. — 1994. — Vol. 105, N 4 — P. 1209-1215. (20).
28. Mazodier P. Integric conjgation beween Escherichia coli and Streptomyces species / Mazodier P., Petter P., Thompson C. // J. Bacteriol. — 1989. — Vol.171. — P. 3583-3585. (8).
29.Meyer A. D. Horizontal gene transfer: regulated expression of a tobacco homologue of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene / Meyer A. D., Ichikawa T., Meins F. // Mol. Gen. Genet. — 1995. — Vol. 249. — P. 265-273. (34).
30. MoriuchiH. Nuclear localization and interaction of RolB with plant 14-3-3 protein correlates with induction of adventitious roots by the oncogene rolB / Moriuchi H., Okamoto C., Nishihama R. // The Plant Journal. — 2004. — Vol. 38. — P. 260-275. (16).
31.Nagata N. The regulatory functions of the rolB and rolC genes of Agrobacterium rhizogenes are conserved in the homologous genes (Ngrol) of Nicotiana glauca in tobacco genetic tumors / Nagata N., Kosono S., Seldne M. [et al.] // Plant Cell Physiol. — 1995. — Vol. 36. (6). — P. 1003-1012. (39).
32. Nielsen K. M. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria a rare event? / Nielsen K. M., Bones A. M., Smalla K., van Elsas J. D. // FEMS Microbiol Rev. — 1998. — Vol. 22. (2). — P 79-103. (11).
33. Nilsson O. Hormonal characterisation of transgenic tobacco plantsexpressing the rolC gene of Agrobacterium rhizogenes Tl-DNA / Nilsson O., Moritz T., Imbault N. [et al.] // Plant Physiol. — 1993. — Vol. 102. — P. 363-371. (17).
34. Ooms G. Crown gall plant tumors of abnormal morphology, induced by Agrobacterium tumefaciens, carryng mutated octopine Ti plasmids: analysis of T-DNA functions / Ooms G., Hooykaas P. J., Moole-naar G., Schilperoort R. A. // Gene. — 1981. — Vol. 14, N 1-2. — P. 33-50. (25).
35. Pozueta-Romero J. Identification of a short interspersed repetitive element in partially spliced transcripts of Bell pepper (Capsicum annum) PAP gene: new evolutionary aspects of plant RNA-related SINEs / Pozueta-Ro-mero J., Houln G., Schantz R. // Gene. — 1998. — Vol. 214, N 1-2. — P. 51-58. (10).
36. Schlueter K. Horizontal gene transfer from a transgenic potato line to a bacterial pathogen (Erwinia chrysanthemi) occurs — if at all — at an extremely low frequency / Schlueter K., Fuetterer J., Potry-kus I. // Biol. Technology. — 1995. — Vol.13, N 10. — P. 1094-1098. (9).
37. Schmuelling T. // Hormonal content and sensitivity of transgenic tobacco and potato plants expressing single rol genes of Agrobacterium rhizogenes T-DNA / Schmuelling T., Fladung M., Grossman K. // Plant J. — 1993. — Vol. 3. — P. 371-382. (18).
38. Sheng J. Agrobacterium plant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel / Sheng J., Citovsky V. // Plant Cell. — 1996. — Vol. 8. — P. 1699-1710. (24).
39. Spanier K. A functional analysis of T-DNA gene 6b: the fine tuning of cytokinin effects on shoot development / Spanier K., Schell J., Schreirer P. // Mol. Gen. Genet. — 1989. — Vol. 219. — P. 209-216. (30).
40. Stieger P. A. The ORF13 T-DNA gene of Agrobacterium rhizogenes confers meristematic competence to differentiated cells / Stieger P. A., Meyer A. D., Kath-mann P. // Plant Physiology. — 2004. — Vol. 135 — P. 1798-1808. (23).
41. Suzuki K. Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution / Suzuki K., Yamashita I., Tanaka N. // The Plant Journal. — 2002. — Vol. 32. — P. 775-787. (44).
42. Syvanen M. On the occurrence of horizontal gene transfer among an arbitrarily chosen group of 26 genes / Syvanen M. // J. Mol. Evol. — 2002. — Vol. 54. (2). — P. 258-66. (7).
43. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype / Tepfer D. // Cell. — 1984. — Vol. 34. — P 959-967. (15).
44. ThomashowL. S. Crown gall oncogenesis: evidence that a T-DNA gene from the Agrobacterium Ti plasmid PtiA6 encodes an enzyme that catalyses synthesis of indole-acetic acid / Thomashow L. S., Reeves S., Thomashow M. F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1984. — Vol. 81 — P. 5071-5075. (27).
45. White F. F. Tumor induction by Agrobacterium rhizogenes involves the transfer of plasmid DNA to the plant genome / White F. F., Ghidossi G., Gordon M. P., Nester E. W. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 1982. — Vol. 79. (10). — P. 3193-3197. (31).
46. White F. F. Sequence homologous to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genome of uninfected plants / White F. F., Garfinkel D. J., Huffman G. A. [et al.] // Nature. — 1983. — Vol. 301. (5898). — P 348-350. (32).
Horizontal gene transfer from agrobacteria to plants
O. A. Kulaeva, T. V. Matveeva, L. A. Lutova
' SUMMARY: Horizontal gene transfer is transfer of genetic material between organisms, which could not be termed as progenitor and ancestor. There is some data, that some plants contain in their genomes sequences, homologous to T-DNA from agrobacteria. Some rol genes from Agrobacterium rhizogenes are present in number of species from genus Nicotiana as a result of horizontal gene transfer in plant evolution. This review is devoted to this scientific problem.
' KEY WORDS: horizontal gene transfer, Nicotiana, Agrobacterium rhizogenes
