CC BY
79
Т. В. Матвеева, О. А. Павлова, К. И. Иваницкий, Л. А. Лутова
ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ ОТ АГРОБАКТЕРИЙ К РАСТЕНИЯМ РОДА NICOTIANA: ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ПРЕДПОСЫЛКИ И ПОСЛЕДСТВИЯ*
Введение
Под горизонтальным переносом генов понимают передачу генетического материала, существующего между организмами, которые нельзя определить в терминах «родитель» и «потомок». Для прокариотических организмов — это типичный механизм появления комбинативной изменчивости. В течение долгого времени подвергалось сомнению существование горизонтального переноса генов с участием эукариотических организмов. Первым фактом в пользу этой теории было открытие в 1970-е годы естественной векторной системы, основанной на почвенных бактериях рода Agrobacterium. Эта бактерия переносит фрагмент (Т-ДНК) большой плазмиды Ti (вызывающей образование опухолей — корончатых галлов) или плазмиды Ri (вызывающей образование бородатых корней). Оказавшись внутри клетки, этот фрагмент движется к ядру, где встраивается в геном растения [12, 14-17].
Лабораторные эксперименты показывают, что возможно регенерировать целые растения из трансгенных тканей. С другой стороны, имеются данные, показывающие, что ряд растений, не подвергавшихся трансформации в лабораторных условиях, таких как некоторые представители рода Nicotiana, уже содержат последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes в их геномах, т. е. горизонтальный перенос генов (ГПГ) имел место в эволюции рода Nicotiana [5, 7-9, 11].
Направление ГПГ подвергалось сомнению в течение длительного времени. Только в 2002 г. Сузуки и соавторы [15] прояснили ситуацию. Эти авторы получили полный сиквенс всего фрагмента, гомологичного Т-ДНК агробактерий, традиционно обозначаемого в литературе как клеточная Т-ДНК (клТ-ДНК) [17]. В клТ-ДНК N. glauca была обнаружена последовательность опинового гена, гомологичного таковому из микимо-пиновой плазмиды pRi1724 Т-ДНК. Гомологичный ген был обнаружен и у Nicotiana tabacum, N. glauca, N. tomentosa, N. tomentosiformis. Кроме того, авторы идентифицировали сайты инсерции Т-ДНК в геномы данных видов.
Поскольку пограничные к Т-ДНК последовательности растительной ДНК были различными у проанализированных видов, авторы заключили, что онкогены были перемещены к Nicotiana от Agrobacterium и в эволюции имело место несколько независимых событий трансформации. Кроме того, авторы предположили, что Т-ДНК от некоторой другой Ri плазмиды была перенесена в геномы N. benavidesii и N. otophora. В экспериментах Intrieri и Buiatti (2001) [8] было показано наличие онкогенов из Т-ДНК еще в нескольких видах, однако авторам не везде удалось выявить все изучаемые гены.
Имеющиеся на сегодняшний день факты позволяют предположить, что горизонтальный перенос генов от агробактерий играл важную роль в эволюции рода
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (№гранта 08-04-01005-а); а также правительства Санкт-Петербурга и Комитета по науке и высшей школе (грант для студентов №2.6/30—04/20).
© Т. В. Матвеева, О. А. Павлова, К. И. Иваницкий, Л. А. Лутова, 2009.
Nicotiana, поскольку эти события происходили неоднократно, а гены закрепились в ряду поколений. В случае нейтрального или негативного влияния новоприобретенной Т-ДНК вставки на изначально сбалансированную генетическую программу растения, совместное (последовательное) протекание процессов переноса Т-ДНК в растение и ее закрепление в ряду поколений видится маловероятным. Еще менее вероятными представляются независимые неоднократные события переноса и закрепления Т-ДНК у разных представителей рода Nicotiana. Вместе с тем до последнего времени широко обсуждается единственная функция данных генов, а именно участие в контроле опухоле-образования у гибридов табака. Однако, скорее всего, это не единственная и, возможно, не самая важная их функция.
Для прояснения сформулированных выше вопросов представляется логичным выяснить, какие общие черты представителей рода Nicotiana сделали возможным осуществление в их эволюции нескольких независимых актов трансформации Т-ДНК агробактерий и закрепление вставки в ряду поколений. Наиболее логичным, с нашей точки зрения, было бы начать исследование данного феномена с характеристики видов Nicotiana, несущих вставку Т-ДНК, а также видов без такой вставки, по способности к регенерации и трансформации штаммами агробактерий дикого типа.
Таким образом, целью данного исследования была характеристика морфогенетических процессов у видов Nicotiana в ответ на кокультивацию с агробактериями.
В задачи работы входило:
• характеристика интенсивности опухолеобразования, корнеобразования и побегообразования при трансформации штаммами A. tumefaciens (T37, C58, A6) и A. rhizogenes (15834, 8196, A4) видов, содержащих клТ-ДНК(Ж suaveolens, N. gossei, N. tabacum), и не содержащего клТ-ДНК (N. rustica);
• выборочная оценка присутствия онкогенов Т-ДНК в ДНК, выделенной из тканей эксплантов с различными морфогенетическими реакциями.
Материалы и методы исследования
В качестве материала в работе использованы виды N. gossei, N. rustica, N. suaveolens, в качестве положительного контроля использовали N. tabacum из коллекции НИИ табака махорки и табачных изделий.
Семена стерилизовали 30%-ной перекисью водорода, промывали стерильной водой и в условиях ламинарного бокса высевали на чашки Петри с питательной средой Мурасиге—Скуга без гормонов [10]. Проростки с 5-7-ю листьями переносили в стеклянные сосуды объемом 150-250 мл, заполненные на 10-15% питательной средой того же состава, и далее поддерживали черенкованием.
Для проведения трансформации в работу был вовлечен бактериальный материал — штаммы дикого типа. Штаммы Agrobacterium rhizogenes: 15834-3, 8196, A-4, штаммы Agrobacterium tumefaciens: T37-3, C58, A6-2. Штаммы агробактерий были любезно предоставлены профессором Е. Нестрером (Eugene W. Nester Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, Washington, USA).
Трансформацию проводили методом листовых дисков [2]. В качестве негативного контроля использовали вариант с культивированием эксплантов без добавления суспензии бактерий. Позитивным контролем служила трансформация хорошо изученного ранее вида— N. tabacum всеми исследуемыми штаммами. По истечении 1,5 месяцев с момента эксплантации проводили учеты эффективности морфогенетических процессов во всех вариантах опыта и контроле. Оценивали процент эксплантов с различными
морфогенетическими реакциями и его ошибку. Для изучения трансгенной природы полученных тканей проводили ПЦР -анализ. ДНК выделяли согласно методике, основанной на использовании 2-кратного ЦТАБ-буфера [13]. ПЦР проводили в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержала 5-200 нг ДНК, по 10пМ праймеров и зондов, 2 мМ dNTP каждого, 2 единицы активности (е.а.) Taq-полимеразы («Силекс М»), 1 х буфер для Taq-полимеразы («Силекс М»). В работе были использованы следующие праймеры и зонды к онкогенам:
RolBL: atgcagaaagtgctggaggaa, RolBR: gtgcggccaagcaaggttgtg, RolB_probe: R6G-atcgtbgtcgcagcacggcctccattcca-BHQ1, tmsL: aatggtcgataaggctgatga; tmsR: gaaagcgaccrtcg-gccagcct; iptL: tcatcgcagccaagcaagctca; iptR: gttggcgaataatatgccaacga; tms_probe: Rox-tgcaagctaacccagcgytgcactcg-BHQ2; Ipt_probe: R6G-ccatgcacytgagcaacgagatagat-BHQ2. В качестве контроля использовали праймеры и зонд к референсному гену gadph-F: actg-gtgtcttcactgacaagg, gadph-R: tgacacccacaacaaacatcgg, Probe_gadph: Cy5-acaaggctgctgct-cacttgaagg-BHQ2.
ПЦР проводили по программе: 5 мин при 93°C, 40 циклов —15 с при 93°C, 60 с — 50° C, 60 с — 72° C, далее 15 мин при 25° C с использованием прибора АНК 32 (Институт аналитического приборостроения РАН).
Результаты исследования и их обсуждение
В рамках изучения причин и последствий горизонтального переноса генов от агробактерий к представителям рода Nicotiana в процессе его эволюции была оценена способность к трансформации видов данного рода, содержащих последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes (N. suaveolens, N. gossei,) и вида, не содержащего кл-Т-ДНК (N. rustica), штаммами дикого типа A. tumefaciens (T37, C58, A6) и A. rhizogenes (15834, 8196, A4). В качестве положительного контроля трансформации использовали модельный объект N. tabacum. В том случае, когда при трансформации контрольного ранее охарактеризованного по исследуемым признакам вида мы видели проявление таких же морфогенетических реакций, как описано в литературе [3], то трансформацию считали успешной и анализировали опытные варианты.
Нами было показано, что при трансформации исследованных видов штаммами агробактерий наблюдаются разнообразные морфогенетические реакции: образование опухолей, бородатых корней, побегов. Данные реакции могут проявляться независимо друг от друга, однако, в большинстве случаев проявление реакций носит совместный характер, например, развитие побегов из опухолей (рис. 1).
Интенсивность наблюдаемых морфогенетических процессов была различной (см. рис. 2) как в отношении штаммов бактерий, так и в отношении видов Nicotiana, что согласуется с ранее описанными фактами, свидетельствующими о взаимодействии генотипов агробактерии и растения в процессе трансформации [1].
Анализируя результаты в целом, можно сказать, что штамм 8196 A. rhizogenes, обладает большей вирулентностью по сравнению с другими использованными штаммами, поскольку более эффективно трансформирует исследованные нами виды, а также, по литературным данным [3], N. tabacum. В отношении штаммов A. tumefaciens однозначного вывода сделать нельзя, поскольку максимальную вирулентность по отношению к разным видам имеют разные штаммы (C58 и A6).
Характеризуя способность к трансформации исследованных видов табака, можно отметить, что виды N. suaveolens и N. gossei характеризуются низкой способностью к трансформации, вместе с тем для них характерна способность образовывать
Рис. 1. Различные типы морфогенетических процессов, наблюдаемых при трансформации видов Nicotiana штаммами Agrobacterium а —опухолеобразование, б — корнеобразование, в —побегообразование, г — побегообразование на опухолях.
спонтанные опухоли на среде без гормонов. Эти виды образуют опухоли и в ответ на трансформацию штаммами агробактерий обоих видов. При этом при трансформации A. tumefaciens опухоли крупнее. Кроме того, для N. suaveolens характерна высокая способность к побегообразованию. Вид N. rustica трансформируется более эффективно.
Для доказательства трансгенной природы опухолевых тканей (опухолевидных наростов и бородатых корней) нами была проведена ПЦР в реальном времени на ДНК, выделенной из случайной выборки опухолей и бородатых корней, с праймерами к онкогенам агробактерий и с праймерами к референсному гену gadph. Поскольку традиционно считается, что трансгенные ткани являются гемизиготными по вставке Т-ДНК,
N gossei
Рис. 2. Интенсивность (в процентах) морфогенетических процессов, наблюдаемых при трансформации видов Nicotiana штаммами Aдrobacterium (подробное описание в тексте). Черным цветом указан процент эксплантов с опухолями, белым — с побегами, серым — с корнями.
мы ожидали, что значения пороговых циклов при амплификации фрагментов онкогенов будут на единицу больше, чем значения пороговых циклов при амплификации референсного гена. Такие цифры показывали бы, что концентрация матрицы, содержащей референсный ген, и матрицы, содержащей онкогены, находятся в соотношении 2:1. Однако результаты были неожиданными. В табл. 1 в качестве примера приведены данные по анализу опухолей, индуцированных штаммом А6 на эксплантах N. доззвЪ. Они свидетельствуют о том, что практически во всех тканях концентрация онкогенов в несколько раз превышала концентрацию референсного гена. Такое возможно, во-первых, в случае присутствия агробактерий в трансгенных тканях, а, во-вторых, в случае многократных вставок Т-ДНК. Второй вариант является маловероятным, поскольку различия в 1-16 раз говорят о том, что в каждой клетке трансгенной ткани должно быть от 2 до 32 вставок. В литературе подобных фактов не описано. Вместе с тем есть данные о том, что агробактерии могут длительное время сохраняться в тка-
Таблица 1. Значения пороговых циклов ПЦР в реальном времени на ДНК, выделенной из эксплантов N. доввец трансформированных штаммом А6 А. tumefaciens
Тип ткани № образца Значение порогового цикла Различие концентрации матрицы, раз
праймеры к онкогену ipt праймеры к референсному гену gadph
опухоли 1 22 25 8
2 20 24 16
3 18 21 8
4 26 27 2
5 26 27 2
6 26 26 1
7 21 23 4
8 21 24 4
ткани эксплантов без опухолей 1 > 40 26 —
2 > 40 25 —
3 > 40 27 —
4 > 40 28 —
A. tumefaciens (+ контроль) 16 > 40 —
^трансформированный N. gossei > 40 23
нях растения после трансформации [6]. Скорее всего, именно их присутствие и дало такую картину. Следует отметить, что для контроля нами была проведена ПЦР на ДНК, выделенной из живых частей эксплантов, на которых не обнаружено признаков неопластического роста. В этом случае не было отмечено и амплификации с праймеров к последовательностям онкогенов, а амплификация референсного гена происходила нормально. Следовательно, агробактерии присутствуют именно в трансгенных тканях, а не на эксплантах вообще. Таким образом, в данном эксперименте был продемонстрирован аттрагирующий эффект со стороны трансгенных тканей по отношению к агробактериям.
Таким образом, показана различная способность к трансформации видов обоих групп Nicotiana исследуемыми штаммами. Суммируя наши результаты с литературными данными, можно сказать, что среди видов, содержащих клТ-ДНК, отмечены как формы, обладающие высокой способностью к трансформации (N. tabacum), так и формы, поддающиеся трансформации исследованными штаммами с низкой эффективностью (N. suaveolens, N. gossei). Среди видов, не содержащих клТ-ДНК, также нет единообразия в отношении проявлений исследуемого признака.
Отмечена низкая способность к трансформации N. langsdorffii всеми штаммами за исключением C58 [3], в то время как N. rustica эффективно трансформировался штаммами A. rhizogenes и штаммом A6 A. tumefaciens. Вместе с тем для всех исследованных видов характерна высокая регенерационная способность, а для N. langsdorffii и N. suaveolens склонность к побегообразованию in vitro [3, 4].
Таким образом, высокая регенерационная способность представителей рода Nico-tiana, наряду со способностью к трансформации отдельными штаммами агробактерий, могла послужить предпосылкой привнесения в их геном последовательности Т-ДНК A. rhizogenes. Вместе с тем как фактов, иллюстрирующих роль привнесенных последовательностей в отношении признаков, влияющих на агробактериальную трансформацию, так и сходства в отношении гормонального статуса представителей обоих групп выявлено не было (табл. 2). Вообще, фитогормональная гипотеза появления Т-ДНК
в геноме растений, основанная на положительном эффекте изменения гормонального статуса растения по сравнению с нетрансформированными растениями после акта случайной агробактериальной трансформации, не выдерживает серьезной критики. Это связано с тем, что у ряда видов рода ШеоНаиа (а возможно, и других родов), в геномах которых уже показано наличие Т-ДНК, изначально должна была быть настолько несовершенная и разбалансированная гормональная машина, что даже грубое внедрение чужеродной Т-ДНК агробактерий, могло бы улучшить ее.
Таблица 2. Особенности морфогенетических реакций in vitro у некоторых видов Nicotiana
Вид Наличие клТ-ДНК [8] Способность к трансформации Доминирующая морфогенетическая реакция in vitro
N. tabacum + высокая нет преобладания какой-либо реакции
N. suaveolens + низкая побегообразование
N. gossei + » опухолеобразование
N. rustica — высокая нет преобладания какой-либо реакции
N. langsdorffii — низкая побегообразование
Поскольку механизм фитогормональной регуляции является очень древним и важнейшим для растения, у эволюции было более чем достаточно времени для его совершенствования и оттачивания. В связи с этим можно предполагать резко негативное влияние гормональной части агробактериальной вставки. Однако тот факт, что Т-ДНК все же закрепилась в геноме растений, говорит о некоей важнейшей, позитивной функции Т-ДНК, несущей растению преимущества с лихвой компенсирующие негативное влияний гормональной кассеты. Данное явление до сих пор остается совершенно неизученным, хотя понимание этого фундаментального процесса позволило бы дать ответы на многие вопросы коэволюции патогенов и хозяев, о перерастании паразитизма в симбиоз, и, наконец, о тонких механизмах начальных этапов становления симбиотических взаимоотношений между бактериями из семейства Rhizobiaceae и растениями.
Предполагаем, что отмеченный нами аттрагирующий эффект со стороны трансгенных тканей в отношении агробактерий может распространяться и на другие почвенные микроорганизмы, тем самым качественно изменяя состав ризосферы. Накопление нового фактического материала (описание новых видов с последовательностями, гомологичными Т-ДНК, и их детальная характеристика) позволит сделать более глубокие обобщения и выявить роль исследуемых генов в генетических механизмах эволюции растений.
Литература
1. Богомаз Д. И. Изучение взаимодействия генотипов растения и штамма Agrobacterium tumifaciens при получении форм картофеля, устойчивых к калорадскому жуку // Экологическая генетика. 2005. Т. 1. C. 34-41.
2. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джэкоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Учебное издание / Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена; пер. с англ. Г. И. Эйснер, В. М. Андрианова. М., 1991. 408 с.
3. Матвеев Т. В., Пигичка Т. Ю., Лутова Л. А. Характеристика морфогенетических реакций Nicotiana langsdorffii при трансформации штаммами агробактерий дикого типа in vitro // Экологическая генетика. 2007. Т. 3. С. 21-24.
4. Павлова О. А., Матвеева Т. В. Характеристика способности Nicotiana suaveolens к регенерации и агротрансформации in vitro // Сборник тезисов 12-й Международной Пущинской школы-конференции для молодых ученых «Биология — наука XXI века» (10-14 ноября 2008 года, Пущино). Пущино, 2008. C. 217.
5. Aoki S., Kawaoka A., Sekine M., Ichikawa T., Fujita T., Shinmyo A., Syono K. Sequence of the cellular T-DNA in the untranaformed genome of Nicotiana glauca that is homologous to ORFs 13 and 14 of the Ri plasmid and analysis of its expression in genetic tumors of N. glauca х N. langsdorffii // MGG. 1994. Vol. 243. P. 706-710.
6. Charity J. A, Klimaszewska K. Persistence of Agrobacterium tumefaciens in transformed conifers // Environ Biosafety Res. 2005. Vol. 4, N 3. P. 167-177.
7. Ichikawa T., Ozeki Y., Syono K. Evidence for the expression of the rol genes of Nicotiana glauca in genetic tumors of N. glauca х N. langsdorffii // MGG. 1990. Vol. 220. P. 17-180.
8. Intrieri M. C., Buiatti M. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and evolution of the genus Nicotiana // Molecular Phylogenetics and evolution. 2001. Vol. 20. P. 100110.
9. Meyer A.D., Ichikawa T., Meins F. Horizontal gene transfer: regulated expression of a tobacco homologue of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene // MGG. 1995. Vol. 249. P. 265-273.
10. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 165-170.
11. Nagata N., Kosono S., Sekine M., Shinmyo A., and Syono K. The regulatory functions of the rolB and rolC genes of Agrobacterium rhizogenes are conserved in the homologous genes (Ng rol) of Nicotiana glauca in tobacco genetic tumors // Plant Cell Physiol. 1995. Vol. 36. P. 10031012.
12. Otten L., Canaday J., Gerard J. C., Fournier P., Crouzet P., Paulus F. Evolution of agrobacteria and their Ti plasmids // Mol Plant Microbe Interact. 1992. Vol. 5. P. 279-287.
13. Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd ed. New York; Cold Spring Harbor, 2001.
14. Schell J., Van Monta.gu M., De Beuckeleer M., De Block M., Depicker A., De Wilde M., Engler G., Genetello C., Hernalsteens J. P., Holsters M., Seurinck J., Silva B., Van Vliet F., Villarroel R. Interactions and DNA transfer between Agrobacterium tumefaciens, the Ti-plasmid and the plant host // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1979. Vol. 204. P. 251-266.
15. Suzuki K., Yamashita I., Tanaka N. Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes during their evolution // Plant. J. 2002. Vol. 32, N 5. P. 775-787.
16. White F. F., Ghidossi G., Gordon M. P., and Nester E. W. Tumor induclion by Agrobacteriun rhizogenes involves the transfer of plasmid DNA to the plant genome // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. Vol. 79. P. 3193-3319.
17. White F. F., Garfinkel D. J., Huffman G. A., Gordon M. P., Nester E. W. Sequence homologous to to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genomes of uninfected plants // Nature. 1983. Vol. 301. P. 348-350.
Статья поступила в редакцию ЗІ июля 2009 г.
