CC BY
24
https://doi.org/10.17116/molgen2020380113
Третья транспортная система Pseudomonas aeruginosa как мишень для разработки антивирулентных препаратов
© А.Б. ШЕРЕМЕТ, Л.Н. НЕСТЕРЕНКО, Н.А. ЗИГАНГИРОВА
ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия Резюме
Pseudomonas aeruginosa лидирует среди антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий, вызывающих госпитальные инфекции. Множественная резистентность патогена, приводящая к низкой эффективности антибактериальной терапии, диктует необходимость поиска новых препаратов. Система секреции третьего типа (ССТТ) является ключевым фактором вирулентности P. aeruginosa. В обзоре кратко рассмотрены современные представления о структуре и регуляции ССТТ, которая определяет вирулентность широкого круга грамотрицательных бактерий с разным характером парази-тирования и крайне необходима для проявления патогенеза вызываемых ими заболеваний. Секреторный аппарат формируется после контакта бактерии с эукариотической клеткой и запускает процесс переноса факторов патогенности непосредственно в клетку хозяина. Регуляция активности такой сложной структуры представляет собой строго иерархически выстроенный процесс и происходит минимум на двух уровнях — транскрипционном и секреторном. ССТТ является одной из наиболее перспективных мишеней для разработки антивирулентных препаратов в силу целого ряда преимуществ по сравнению с антибиотиками: ингибиторы ССТТ не способствуют отбору устойчивых форм микроорганизмов, поскольку не подавляют размножение патогенов, а только ингибируют их вирулентность; ингибиторы действуют на возбудитель вне зависимости от приобретенной резистентности к антибиотикам; терапия этими препаратами не будет вызывать гибель нормальной микрофлоры человека и развитие дисбактериозов. К настоящему времени идентифицирован целый ряд ингибиторов ССТТ-бактерий различной природы с разным механизмом действия. По механизмам действия описанные ингибиторы могут подавлять транскрипцию генов ССТТ, транслокацию токсинов и дезактивировать эффекторные молекулы. Для многих разработанных ингибиторов показана их специфическая активность в экспериментах in vitro, однако лишь для некоторых была показана эффективность подавления инфекционного процесса на моделях животных. Для трех описанных в литературе препаратов (фтортиазинон и антитела MEDI3902 и КВ001) в настоящее время уже проводятся клинические исследования.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, антибиотикорезистентность, система секреции третьего типа, вирулентность, ингибиторы, инфекционный процесс, обзор.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Шеремет А.Б. — e-mail: anna-pimenova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5210-5010 Нестеренко Л.Н. — e-mail: nesterenko.mila@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-8893-5702 Зигангирова Н.А. — e-mail: zigangirova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6719-9403
Автор, ответственный за переписку: Шеремет А.Б. — е-mail: anna-pimenova@mail.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Шеремет А.Б., Нестеренко Л.Н., Зигангирова Н.А. Третья транспортная система Pseudomonas aeruginosa как мишень для разработки антивирулентных препаратов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(1):3-14. https://doi.org/10.17116/ molgen2020380113
Pseudomonas aeruginosa type three-secretion system as a target for development of antivirulence drugs
© A.B. SHEREMET, L.N. NESTERENKO, N.A. ZIGANGIROVA
N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology & Microbiology, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia Abstract
Pseudomonas aeruginosa is one of the leading antibiotic-resistant gramnegative organisms associated with nosocomial infections. Multiple pathogen resistance leads to the low antibiotic therapy efficiency. This situation requires developing novel antibacte-rials. The T3SS (type three secretion system) is a key factor in Pseudomonas aeruginosa virulence. This review presents a brief description of the T3SS structure and T3SS regulation, which determines a wide range virulence of gram-negative bacteria with a different types of parasitism and is extremely necessary for the manifestation of the pathogenesis of diseases caused by them. The secreted apparatus forms after bacteria and eukaryotic cell contact and starts the process of transferring the pathogenicity factors directly into the host cell. The regulation activity is a strictly hierarchically structured process that occurs at least at two levels, transcriptional and secretory. T3SS is one of the most attractive target for developing antibacterials as it possesses a number of advantages in comparison with antibiotics: T3SS inhibitors do not contribute to the formation of resistant forms in microorganisms, since they do not suppress the reproduction of pathogens, but only reduce bacterial virulence; inhibitors act regardless of acquired resistance; the therapy with these inhibitors will not cause dysbacteriosis. To date, a number of gram-negative bacteria
T3SS inhibitors with various nature and different mechanism of action have been identified. The described inhibitors can suppress the transcription of the T3SS genes, toxins translo cation and act on the effector molecules, according to the mechanisms of action. For many of the developed inhibitors, their specific activity was shown in in vitro experiments. But only in some cases the efficiency of the suppression was shown in animal models. Only three inhibitors are in clinical trials now: the Fluorothiazinone and the antibodies MEDI3902 and KB001.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, antibiotic resistance, type three secretion system (T3SS), virulence, inhibitors, infectious process, review.
INFORMATION ABOUT AUTHORS:
Sheremet A.B. — e-mail: anna-pimenova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5210-5010 Nesterenko L.N. — e-mail: nesterenko.mila@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-8893-5702 Zigangirova N.A. — e-mail: zigangirova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6719-9403
Corresponding author: Sheremet A.B. — e-mail: anna-pimenova@mail.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Sheremet A.B., Nesterenko L.N., Zigangirova N.A. Pseudomonas aeruginosa type three-secretion system as a target for development of antivirulence drugs. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(1):3-14 (Russian). https://doi.org/10.17116/molgen2020380113
Введение
Pseudomonas aeruginosa, или синегнойная палочка, условно патогенная грамотрицательная бактерия, вызывает до 30%, а в некоторых отделениях — до 50% всех оппортунистических внутрибольничных инфекций, которые сопровождаются высокой (34—48%) летальностью. Синегнойная палочка в высоком проценте случаев является причиной внутрибольничных пневмоний, первичных бактериемий, инфекций мочеполовой системы, гнойных послеоперационных и ожоговых инфекций. Несмотря на своевременное лечение антибиотиками, показатели смертности от си-негнойных инфекций остаются высокими, а в случае с больными, находящимися на искусственной вентиляции легких (ИВЛ), смертность доходит до 60% [1].
Трудности лечения псевдомонадной инфекции вызваны чрезвычайно высокой распространенностью у этого патогена множественной устойчивости к антибиотикам. Штаммы синегнойной палочки, циркулирующие в стационарах, часто устойчивы почти ко всем классам антибиотиков, доступным в больницах [2].
В сложившейся ситуации становится очевидной необходимость разработки новых стратегий для решения данной проблемы. Инновационным решением является изменение парадигмы борьбы с инфекциями: лекарство должно подавлять вирулентность, но не убивать патоген, тем самым предотвращая селективный отбор возникающих мутаций устойчивости к применяемому препарату. Уничтожение возбудителя, утратившего вирулентные свойства, будет происходить в результате воздействия иммунных защитных сил организма-хозяина. Подавление вирулентности приведет к ограничению проявления симптомокомплекса заболевания, а также позволит избежать гибели нормальной, не патогенной, микрофлоры человека [3].
Синегнойная палочка обладает разнообразными факторами патогенности, но ведущая роль среди них принадлежит системе секреции третьего типа (ССТТ). Мутации, приводящие к нарушению функций ССТТ, вызывают снижение или потерю вирулентности [4]. Острые синегнойные инфекции, вызванные штаммами, секретирующими токсины-эффекторы ССТТ, характеризуются высокой концентрацией возбудителя в пораженных органах и тканях, частыми рецидивами после выздоровления, а также приводят к значительному увеличению смертности [5].
Таким образом, ССТТ псевдомонад является перспективной мишенью для разработки инновационных антивирулентных препаратов на основе ингибиторов ССТТ. В данном обзоре рассмотрены современные представления о структуре, функции и регуляции ССТТ псевдомонад, охарактеризованы перспективные мишени для действия ингибиторов в составе секреторного аппарата и представлены данные о наиболее эффективных ингибиторах ССТТ P aeruginosa.
Структура ССТТ P. aeruginosa
ССТТ является высококонсервативной структурой, имеющей значительное сходство у неродственных видов грамотрицательных микроорганизмов [6, 7]. Структурно ССТТ представляет собой трансмембранный комплекс, или инжектисому, позволяющий бактерии вводить свои токсины (называемые эффекторами) непосредственно в цитозоль эукариотиче-ской клетки-мишени. Процесс формирования структурного аппарата ССТТ и транспорта эффекторов активируется в результате контакта бактериальной и эукариотической клеток [8]. ССТТ проходит сквозь внутреннюю и внешнюю мембрану бактерии и мембрану клетки хозяина. Можно выделить 3 структурные части ССТТ: цитоплазматическая часть, базаль-ное тело и внеклеточная часть.
В цитоплазматическую часть ССТТ входят экспортный аппарат (ЭА), цитоплазматическое кольцо и АТФазный комплекс. ЭА расположен во внутренней мембране клеточной стенки и собран из 5 мембранных белков: PscR, PscS, PscT, PscU и PcrD [8]. Белок PcrD формирует экспортные ворота, представляющие собой кольцо, состоящее из 7 субъединиц, и в комплексе с другими белками ЭА выполняет функцию входного портала канала ССТТ для прохождения субстратов [9]. Непосредственно под экспортным аппаратом находится цитоплазматическое кольцо (Ц-кольцо), образуемое белком PscQ и расположенное вокруг АТФазного комплекса. АТФазный комплекс состоит из белка АТФазы PscN, белка стебелька PscO, белка PscL, который соединяет Ц-кольцо и АТФазу и является ее негативным регулятором, а также белка кофактора PscK [10]. Эти белки образуют сортировочную платформу.
Базальное тело состоит из кольцевых структур, встроенных в клеточную стенку бактерии. Белки внутренней мембраны, PscJ и PscD, образуют два мембранных кольца, встроенных друг в друга, внутри этих колец расположен ЭА [11]. Кольцо наружной мембраны, образованное N-концевыми доменами белка PscC, или секретина, проникает глубоко в периплазму и непосредственно взаимодействует с кольцом внутренней мембраны PscD, соединяя тем самым внутренние и наружные мембранные кольца.
Внеклеточная часть ССТТ состоит из иглы и транслокационного аппарата. Игла состоит из сотен копий белка PscF, собранных по спирали, и белка внутреннего стержня PscI, обусловливающего связь с базальным телом [12]. На конце иглы расположен белок кончика иглы PcrV. Длина иглы контролируется белком PscP, и у разных видов бактерий длина иглы может отличаться [13].
При контакте с клеткой хозяина ССТТ формирует в мембране эукариотической клетки транслокационный аппарат, состоящий из 3 структурных белков, 2 секретируемых белков PopB и PopD, которые взаимодействуют между собой и образуют комплекс PopB/D, необходимый для формирования поры в мембране клетки-хозяина, и одного белка PcrV. Белок PcrV псевдомонад является высокоспецифичным белком. Через транслокационную пору осуществляется транспорт эффекторов из бактериальной клетки в цитозоль клетки-мишени [14].
Регуляция секреторной активности ССТТ
P. aeruginosa
Известно, что сигналом, который запускает экспрессию генов ССТТ, является, в первую очередь, прямой контакт инжектисомы с клеткой хозяина, но точный механизм передачи сигнала еще мало изучен. Процесс секреции регулируется на двух уровнях: транскрипционном и секреторном. В отсутствие се-
кретирующих условий секреция белков ССТТ находится на базовом уровне.
Регуляция экспрессии генов ССТТ активатором
транскрипции ExsA
Регулон ССТТ P. aeruginosa состоит примерно из 40 генов, организованных внутри 10 транскрипционных единиц. Они кодируют структурные, регулятор-ные и эффекторные белки, а также цитоплазматиче-ские шапероны [15].
Все гены ССТТ, включая гены, кодирующие эффекторы, находятся под контролем белка ExsA — транскрипционного активатора AraC-типа, являющегося центральным регулятором регулона ССТТ P aeruginosa. Блокирование его функции приводит к снижению экспрессии генов ССТТ и подавлению вирулентности P. aeruginosa [15].
Регуляция экспрессии генов ССТТ контролируется каскадом ExsADCE из регуляторных белков ExsE, ExsC, ExsD и ExsA. При отсутствии индуцирующих ССТТ сигналов ExsC связан с ExsE, а ExsD с ExsA, что приводит к ингибированию ExsA-зависимой транскрипции. В условиях индукции (контакт с эу-кариотической клеткой, сниженное количество кальция) происходит выделение отрицательного регулятора ExsE, высвобождение ExsC и его связывание с ExsD, и в итоге освобождение ExsA, который связывается со своим промотором и активирует транскрипцию генов ССТТ. Каскад ExsADCE позволяет быстро индуцировать экспрессию генов ССТТ [16].
Активация ExsA ССТТ-независимыми путями
Помимо активации ExsА при участии вышеописанного каскада экспрессия гена exsA регулируется также тремя регуляторными путями: CyaB-cAMP / Vfr, GacSA-RsmYZ-RsmA и PsrA-RpoS.
Путь CyaB-cAMP/Vfr. Vfr — это цАМФ-зависи-мый регулятор транскрипции, известен как глобальный регулятор экспрессии генов вирулентности. Vfr-регулон состоит примерно из 200 генов, участвующих в регуляции экспрессии генов систем секреции третьего и второго типов, пилей IV типа и системы кворум сенсинг. В условиях индукции секреции аденилат-циклаза (CyaB) активируется и продуцирует циклическую АМФ, взаимодействующую с белком Vfr. Вместе с цАМФ регулятор Vfr увеличивает транскрипцию гена exsA, взаимодействуя с промотором, расположенным непосредственно перед exsA [17].
Путь GacSA-RsmYZ-RsmA. Экспрессия гена exsA P.aeruginosa также регулируется регулятором накопления углерода, RsmA. GacS — трехсторонняя сенсорная гистидинкиназа, которая воспринимает из окружающей среды сигналы индукции секреции, активирующие регулятор ответа GacA путем фосфори-лирования, что, в свою очередь, вызывает экспрессию малых регуляторных РНК RsmY и RsmZ. Транскрипты RsmY и RsmZ связывают регулятор накопления
углерода ИятА, что приводит к снижению экспрессии exsA [15].
Путь PsrA-RpoS. Р8гА, сенсорный регулятор длин-ноцепочечных жирных кислот, напрямую связывается с промоторной областью оперона ех8СБВА и позитивно регулирует экспрессию этих генов. Наряду с этим Р8гА также связывается с промоторной областью гена гро8 и позитивно регулирует его транскрипцию, которая, в свою очередь, репрессирует экспрессию exsA и другие гены ССТТ [18].
Секреторный путь регуляция ССТТ
Контроль сборки и функционирования ССТТ осуществляется также на уровне секреции белков, которые разделяют на следующие группы: ранние (белки иглы и стержня), средние (транслокаторы) и поздние (эффекторы) субстраты. Процесс секреции имеет строгую иерархию и происходит пошагово [8].
На первом этапе аутопротеаза Р8сИ и белок Р8сР, контролирующий длину иглы, участвуют в регуляции секреции ранних субстратов, непосредственно формирующих иглу ССТТ. На втором этапе Р8сИ участвует в переключении секреции на средние субстраты, что создает транслокационную пору в мембране клетки хозяина. Контроль такого переключения происходит в результате изменения конформации белка Р8сИ и его взаимодействия с белками экспортного аппарата [19].
На следующем этапе работает целый комплекс цитоплазматических белков: регулятор РсгО, привратник РорК, АТФаза ССТТ (Р8сК) и поздние субстрат-специфичные шапероны. Эти белки переключают секрецию со средних на поздние субстраты, что позволяет доставлять эффекторы ССТТ через иглу и транслокационную пору в клетку-хозяина [8, 20].
Белок РорК связан с тремя белками: Рсг1, Рсг2 и Р8сВ. Белки Рсг2 и Р8сВ образуют гетеродимерный шаперон. Весь этот комплекс из четырех белков соединен с ССТТ через взаимодействие Рсг1 с РсЮ. Белок РорК и связанные с ним регуляторы контролируют секрецию эффекторов за счет того, что они частично закупоривают канал секреции, будучи прикрепленными к ССТТ. В индуцирующих условиях РорК освобождает канал секреции, а эффекторы получают доступ к секреторному аппарату. Доступ происходит через сортировочную платформу [20].
Для последующей секреции из бактериальной клетки эффекторы с их родственными шаперонами взаимодействуют с комплексом АТФазы. Здесь гидролиз АТФ с помощью АТФазы помогает отщеплять шапероны от комплекса эффектор-шаперон и одновременно разворачивать их, а далее секретировать эффекторы через иглу ССТТ [10].
Таким образом, присоединение иглы к мембране клетки хозяина и образование транслокационной поры запускает доставку развернутых эффекторов че-
рез полый канал, образованный внутри иглы, непосредственно в цитозоль эукариотических клеток.
Как стало известно в последнее время, еще один цитоплазматический белок, PscO, энергетически обеспечивает функционирование секреторного аппарата при участии протон-движущей силы. Так, P. Halder и соавт. [10] на модели ротационной секреции показали, что протондвижущая сила, наряду с гидролизом АТФ, ответственна за вращение основания инжекти-сомы и, таким образом, за один оборот секретирует развернутые молекулы эффекторных белков через ци-топлазматический комплекс, базальное тело, иглу и, в конечном счете, в эукариотическую клетку.
Эффекторы ССТТ и другие транспортируемые
ССТТ белки
Синегнойная палочка обладает разнообразными факторами патогенности, но ведущая роль в патогенезе принадлежит эффекторным белкам ССТТ. На данный момент у синегойной палочки идентифицировано 4 эффекторных белка-экзотоксина: ExoU и ExoS, ExoT и ExoY [6].
Наиболее вирулентные штаммы P. aeruginosa продуцируют экзотоксин ExoU. N-концевой фрагмент экзотоксина ExoU обладает фосфолипазной активностью. Конечным результатом токсического действия ExoU на клетку является клеточная гибель, которая характеризуется стремительным, в течение 1—2 ч, нарушением целостности цитоплазматической мембраны, как при некрозе. Токсическое действие ExoU направлено против фагоцитов, а также на преодоление эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации и персистенции [21].
Экзотоксины ExoS и ExoT являются бифункциональными белками, активирующими ГТФ-азы и обладающими АДФ-рибозилтрансферазной активностью. Несмотря на то что эффекторы ExoT и ExoS имеют идентичные на 76% аминокислоты и структурное сходство, тем не менее функционально они разные.
Активность ExoS направлена на нарушение ци-тоскелета, что приводит к округлению клеток и снижению захвата псевдомонад определенными типами клеток, т.е. вызывает подавление фагоцитоза. Необратимое разрушение цитоскелета может приводить к нарушению клеточных контактов и способствовать проникновению псевдомонад через эпителиальный барьер. Гибель иммунных клеток при действии ExoS P. aeruginosa позволяет патогену персистировать в организме [22].
Активность ExoT направлена на подавление миграции, адгезии и пролиферации клеток, а также блокирование фагоцитоза и нарушение целостности эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации [23].
Значение 4-го эффекторного белка, ExoY, являющегося аденилатциклазой, до конца еще не из-
учено. Его активность приводит к нарушению ци-тоскелета, ингибированию захвата псевдомонад клетками хозяина и увеличению проницаемости эндотелия [24].
С помощью ССТТ транспортируются также и другие белки, как, например, пилин (PilA, главный компонент пилей IV типа) или PscI (компонент стержня базального тела ССТТ), а также различные белки жгутика, включая флагеллин (FliC). Распознавание и транспорт FliC обусловлено гомологичным и структурным сходством базального тела жгутика и ССТТ [8].
Мишени и механизм действия ингибиторов ССТТ
P. aeruginosa
На сегодняшний день идентифицировано несколько классов низкомолекулярных веществ, специфически ингибирующих ССТТ грамотрицательных бактерий. Помимо низкомолекулярных соединений ингибиторы ССТТ также представлены полимерами, белками, полипептидами-мимети-ками, полисахаридами. Для нескольких ингибиторов были выявлены конкретные мишени в ССТТ, но большинство мишеней для ингибиторов ССТТ еще предстоит идентифицировать или охарактеризовать. Суммарная информация об известных на настоящий момент ингибиторах ССТТ, их молекулярных мишенях, представителях родов бактерий, для которых показано действие ингибиторов, а также о химических классах соединений представлена в таблице.
По мишеням воздействия на ССТТ ингибиторы могут быть разделены на следующие группы:
1) действующие на генетическую регуляцию СССТ (гидразоны салицилового альдегида, N-ги-дрокси-бензимидазолы, растительные фенольные соединения);
2) действующие на функционирование аппарата ССТТ (гидроксихинолины, тиазолидиноны, фени-лацетамиды, PcrV-антитела (KB001, V2L2MD), PcrV/ PsI-антитела MEDI3902);
3) действующие на эффекторные белки ССТТ (экзоцин, арильные сульфаниламиды, псевдолипаза A, (-)-hopeaphenol).
Ингибиторы генетической регуляции ССТТ
Одними из первых, хорошо охарактеризованных ингибиторов ССТТ являются соединения класса ги-дразонов салицилового альдегида, активные в отношении широкого круга бактерий, таких как Y. pseudotuberculosis, S. enterica серовар Typhimurium, Shigella spp., Chlamydia spp., E. coli O157:H7, P. aeruginosa и растительного патогена Erwinia amylovora [25, 26].
В 2003 г. А. Kauppi и соавт. [25] в результате скрининга химической библиотеки из 9400 соединений идентифицировали несколько гидразонов салицилового альдегида, таких как INP0007 и INP0010, эффек-
тивно подавлявших секрецию эффектора YopE Y. pseudotuberculosis in vitro.
Другое соединение этого класса, INP0341, подавляло транскрипцию генов ССТТ, в том числе у штаммов с их конститутивной экспрессией, и снижало уровень экспрессии экзотоксинов. Авторы предположили, что возможным механизмом действия ингибитора является подавление транскрипции опе-рона, кодирующего ССТТ P. aeruginosa [26].
Было показано, что INP0341 ингибировал ССТТ-зависимую внутриклеточную репликацию C. trachomatis в клетках HeLa, подавляя секрецию хла-мидийного эффекторного белка IncA. Также соединения этого класса подавляют секрецию эффектор-ных белков у Salmonella enterica in vitro [27].
Результаты исследований на моделях у животных демонстрировали снижение клинических симптомов инфекций, вызванных S. enterica серовар Typhimurium и Citrobacter rodentium, после терапии гидразона-ми салицилового альдегида [28]. В другой работе [29] была показана эффективность терапии соединением INP0341 в отношении вагинальной хламидийной инфекции у мышей.
Действие ингибитора INP0341 на P. aeruginosa было показано на модели ожоговой инфекции у мышей. Аппликационная терапия INP0341 достоверно повышала продолжительность жизни у животных в группе лечения, однако не предотвращала системное распространение инфекции и гибель мышей [30].
К недостаткам соединения салицилиден-ацилги-дразида INP0341 можно отнести неудовлетворительные фармакокинетические параметры, связанные с невозможностью достигать высоких концентраций в плазме крови, а также короткий период полувыведения этого вещества. Таким образом, гидразоны салицилового альдегида могут рассматриваться как перспективные препараты на основе специфических ингибиторов ССТТ широкого круга грамотрицательных бактерий, требующие, однако, дальнейших фармакологических оптимизаций.
Соединения N-гидроксибензимидазола (N-hy-droxybenzimidazoles) были получены путем скрининга низкомолекулярных соединений и представляют собой класс антивирулентных молекул, которые ингибируют ДНК-связывающую активность некоторых AraC белков [31]. У псевдомонад белок ExsA является ключевым регулятором транскрипции ССТТ регулона AraC-типа. Было показано, что N-гидроксибензимидазолы взаимодействуют с ДНК-связывающим доменом ExsA, тем самым ингибируя ДНК-связывающую активность белка ExsA и подавляя ExsA-зависимую активацию транскрипции. Такое взаимодействие, по-видимому, является специфическим, поскольку ингибиторы не подавляли активацию транскрипции, связанную с глобальным регулятором вирулентности, белком Vfr [32].
Суммарная информация об ингибиторах ССТТ Pseudomonasaeruginosa и их основных характеристиках
Ингибиторы
Предполагаемый механизм действия
Влияние на эукариотическую клетку
Действие in vivo
Ссылка
Гидразоны
салицилового
альдегида(ЮТ0341)
N-гидрокси-бензимидазолы
Растительные фенольные соединения (TS027 и TS 103) Гидроксихинолоны (INP1855)
Тиазолидиноны (TTS29)
Фенокси-ацетамиды
Тиадиазиноны (фтортиазинон)
Анти-PcrV антитела (KB001, V2L2-MD)
Возможным механизмом действия является подавление экспрессии оперона, кодирующего ССТТ
Карбокситерминальный домен ЕхйА, предотвращающий связывание с сайтами-промоторами на бактериальной ДНК Влияние на экспрессию exoS через регуляторный путь GacSA-RsmYZ-RsmA-ExsA Нарушение секреции ЕхзЕ; ингибирование АТФазной активности ССТТ и жгутика
Предположительно действует на PscC секретин
PscF (компонент белка иглы)
Предположительно действует на стадии транслокации эффекторных белков
Анти-PcrV/PsI антитела (MEDI3902)
PcrV (компонент транслокационного аппарата ССТТ) и PscI (экзополисахарид)
1: ССТТ-опосредованную цитотоксичность, экспрессию и секрецию ExoS; образование биопленок; подвижность за счет действия на жгутик ^нтернализацию бактерий 1ССТТ-опосредованную цито токсичность
НД
^нтернализацию бактерий; ^воспалительный ответ; транслокацию ExsE, ExoS, FliC; ExoS, ExoU, и NL-ЯС4-опосредованную цитотоксичность НД
^секреции и транслокации ExoS
^нтернализации бактерий ^нтернализации бактерий клетками HeLa; фагоцитарную активность
^транслокации эффекторных белков; воспалительного ответа; дозозависимое снижение цитотоксичности, апоптоза, некроза
^цитотоксичности и способности бактерий прикрепляться к эпителиальным клеткам
Модель ожоговой инфекции на фоне иммунодефицита
- НД
[26—30]
PcrV (компонент транслокационного аппарата ССТТ)
^транслокации эффекторных белков;
Тфагоцитирующей функции макрофагов
НД
Модель острой пневмонии на животных (профилактика и лечение)
[31—33]
[34]
[35—38]
НД [39—41]
^площади абсцесса [42—44]
Модель острой [45—50]
пневмонии
на мышах,
профилактика и
лечение; успешное
окончание 1 фазы
клинических
исследований
на здоровых
добровольцах; II
фаза клинических
исследований
Модель острой [51]
пневмонии
на животных
(профилактика и
лечение), пневмония
у иммунодефицитных
животных, ожоговая
инфекция и
бактериемия;
Успешное окончание
I фазы клинических
исследований;
Стадия 11Ь
клинических
исследований
Острая и [52, 53]
хроническая
инфекция
пневмония,
бактериемия,
септический шок;
успешное окончание
I стадии клинических
исследований; II
стадия клинических
исследований
Окончание таблицы на след. стр.
Суммарная информация об ингибиторах ССТТ Pseudomonasaeruginosa и их основных характеристиках (окончание)
Ингибиторы Предполагаемый механизм действия Влияние на эукариотическую клетку Действие in vivo Ссылка
Псевдолипазин А Предположительно действует ^ЕхоБ-опосредованной НД [55]
(PseudolipasinA) на секретируемый фермент фосфолипазу, возможно, на аллостерическом сайте клеточной гибели
Арилсульфонамиды Фосфолипазная А2 активность Ехои ^Ехои-опосредованной НД [56]
(Arylsulfonamides) клеточной гибели
Циклические Секреция ССТТ ^секреции Ехои НД [57]
пептомеры
Экзосин (Exosin) АДФ-рибозилтрансферазная ферментативная активность ExoS iExoS опосредованной цитотоксичности на клетках млекопитающих НД [58]
Тиенопиримидиноны АДФ-рибозилтрансферазная ферментативная активность ExoS НО НД [59]
(-)-Hopeaphenol Секреция ССТТ? ^ССТТ-опосредованной цитотоксичности, секреции и экспрессии ExoS НД [60]
Примечание. t — повышение; 1 — снижение; НД — нет данных.
Биологические эффекты N-гидроксибензимид-азола проявлялись в снижении экспрессии генов ССТТ и ССТТ-опосредованной цитотоксичности in vitro. Действие N-гидроксибензимидазолов in vivo пока показано не было [33].
Соединения TS027 и TS103 были идентифицированы в результате скрининга библиотеки растительных фенольных соединений. Они подавляли транскрипцию гена exoS через регуляторный путь Gac-SA-RsmYZ-RsmA-ExsA. На данном этапе разработки влияние соединений TS027 и TS103 на ССТТ-опо-средованную цитотоксичность не исследовали [34].
Ингибиторы функционирования аппарата ССТТ
Гидроксихинолины были впервые описаны как ингибиторы экспрессии генов ССТТ у Y. pseudotuberculosis [35], а затем у P. aeruginosa. INP1855, ингибитор из класса гидроксихинолинов, был получен путем скрининга библиотеки из 17 500 синтетических низкомолекулярных органических молекул. Было показано, что гидроксихинолин INP1855 подавлял секрецию отрицательного регулятора транскрипции ExsE, эффекторного белка ExoS и белка жгутика FliC, и это дало основание предположить, что у гидроксихинолинов в ССТТ и во флагелле может быть общая мишень [36]. Исследования механизма действия указывают на то, что такой мишенью INP1855 может быть АТФаза, поскольку воздействие INP1855 на бактериальные клетки повышает уровень АТФ только у штаммов, экспрес-сирующих ССТТ и/или флагеллу. Данное исследование было проведено на белке АТФазного комплекса YscN у Y. pseudotuberculosis. На данный момент нет четких данных, которые бы показывали прямое действие ингибитора INP1855 на белок АТФазного комплекса PscN у P. aeruginosa. Однако, поскольку белок YscN имеет 57% гомологии с белком PscN (по данным выравнивания BLAST), можно предполо-
жить, что INP1855 будет также ингибировать и активность белка PscN [37].
In vitro INP1855 защищал эукариотические клетки от ССТТ-опосредованной цитотоксичности и подавлял активацию каспазы-1 с последующим высвобождением IL-1p в фагоцитирующих клетках, что указывало на подавление процесса активации NLRC4 инфламосомно-го сигнального пути [38]. Лечение ингибитором INP1855 in vivo на модели острой псевдомонадной пневмонии у мышей приводило к снижению повреждений и количества псевдомонад в легких, а также к ограничению диссеминации бактерий в селезенку.
При этом не было отмечено разницы в высевах из тканей легкого от животных из группы лечения и контрольной группы, так как ингибитор INP1855 не действовал на жизнеспособность бактерий. Однако при этом было показано уменьшение притока нейтрофи-лов и макрофагов в очаг инфекции, а также значительное уменьшение уровня IL-1p и повышение уровня IL-17 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), что говорит о купировании острого воспаления. Работа с ги-дроксихинолинами продолжается, однако данных о переходе разработок на стадию доклинических исследований в литературе пока не описано [37].
Тиазолидиноны. Соединение класса тиазолидино-нов, 2-имино-5-арилидентиазолидинон, было выбрано как перспективный ингибитор ССТТ, который обладал широким спектром действия против грамо-трицательных патогенов [39]. Этот ингибитор был получен в результате скрининга библиотеки из 92 000 низкомолекулярных соединений с помощью высокопроизводительного экспериментального тестирования соединений в отношении подавления функции ССТТ у S. enterica серовар Typhimurium. Для этого был сконструирован штамм сальмонелл, у которого ССТТ-зависимым образом секретировался белок-эффектор SipA, «слитый» с белком YplA Y. en-terocolitica, обладающим фосфолипазной активно-
стью. Было показано, что 2-имино-5-арилидентиа-золидинон дозозависимо ингибирует секрецию эф-фекторных белков сальмонелл SipA и SspH1, не влияя на рост бактерий [39]. При изучении механизма действия полученного ингибитора было выявлено, что он вызывает снижение количества структурных белков ССТТ, InvG, PrgH и PrgK, формирующих секретирующий комплекс во внутренней и наружной мембране клеточной стенки S. enterica серовар Typh-imurium, что предполагает ингибирование сборки или дестабилизацию секреторного аппарата [40].
Учитывая структурное сходство ССТТ и аппарата жгутика в области базальной структуры, расположенной в цитоплазматической мембране, изучали действие ингибитора 2-имино-5-арилидентиазоли-динона на подвижность бактерий S. enterica серовар Typhimurium. Было показано, что 2-имино-5-арили-дентиазолидинон не подавляет флагеллярную систему, что свидетельствует о локализации возможной мишени ингибитора в наружной мембране клеточной стенки. Авторы предположили, что такой мишенью может являться консервативный белок секретин, который присутствует не только в составе ССТТ, но и в составе систем секреции второго (ССВТ) и четвертого типа (ССЧТ). На модели P. aeruginosa было установлено, что 2-имино-5-арилидентиазолидинон подавлял транслокацию эффекторного белка ССВТ эластазы, значимого фактора вирулентности псевдомонад, а также ингибировал подвижность, зависящую от пилей ССЧТ. Таким образом, вероятной мишенью полученного ингибитора может являться секретин, единственный белок, общий для систем секреции типов II, III и IV [40].
Для 2-имино-5-арилидентиазолидинона было показано, что он подавлял ССТТ других грамотрица-тельных патогенов, таких как Yersinia. spp., Pseudomonas spp. и Francisella novicida [39]. То есть полученный ингибитор подавлял вирулентность патогенов млекопитающих и растений, снижая вызванную сальмонеллами гибель макрофагов и подавляя реакции гиперчувствительности у растений табака, индуцированные бактериями P. syringae. Таким образом, ингибитор 2-имино-5-арилидентиазолидинон является перспективным антивирулентным препаратом широкого спектра действия, однако данных о дальнейшей разработке этого класса ингибиторов в доступной литературе нами не было обнаружено [41].
Феноксиацетамиды представляют собой еще один класс ингибиторов ССТТ. Они были определены как ингибиторы ССТТ P. aeruginosa путем скрининга in vitro [42]. Было выдвинуто предположение, что фе-ноксиацетамиды специфически связываются с белком иглы PscF. Основой для этой гипотезы стало наблюдение, что мутации в этом белке инактивируют ингибирующие свойства феноксиацетамида MBX1641 [43]. Было показано in vitro, что феноксиацетамиды снижали ССТТ-опосредованную цитотоксичность и
облегчали интернализацию бактерий в клетки HeLa. Терапия феноксиацетамидами показала положительные результаты при подавлении псевдомонадной инфекции на модели абсцесса у мышей [44].
Тиадиазиноны. В «НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России был разработан новый низкомолекулярный ингибитор ССТТ, названный CL-55, относящийся к классу 2,4-дизамещенных-4Н- [1, 3, 4] -тиадиазин-5-онов. Соединение было получено в результате экспериментального скрининга более 400 низкомолекулярных соединений различных классов и модифицировано с целью улучшения физико-химических свойств, таких как растворимость и стабильность, и снижения токсичности для эукариоти-ческих клеток [45, 46].
Механизм действия был продемонстрирован на псевдомонадах, хламидиях и сальмонеллах при использовании специфических сывороток к эффектор-ным белкам, что показало подавление транслокации этих белков [47—50].
На моделях in vitro ингибирование активности ССТТ приводило к дозозависимому подавлению ци-тотоксичности в отношении эукариотических клеток, связанной с активностью эффекторов P. aeruginosa Ехои и Ехо8. Ингибитор приводил к восстановлению фагоцитарной активности непрофессиональных фагоцитов, которая подавляется при участии белка ЕхоS, обладающего АДФ-рибозилтрансферазной активностью. Для псевдомонад было показано, что ингибитор ССТТ подавлял также подвижность, обусловленную флагеллярным аппаратом [47].
У хламидий подавление транспорта эффекторных белков семейства Inc приводило к блокированию внутриклеточного размножения как при продуктивной, так и персистентной инфекции в культуре клеток [48, 49]. Для сальмонелл было показано, что ингибитор подавлял транслокацию белков, кодируемых двумя островами патогенности, SPI-1 и SPI-2, что приводило к блокированию инвазии и подавлению внутриклеточного выживания [50].
В использованных тестах in vitro была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) препарата, которая составила 5—20 мкг/мл. В соответствии с механизмом действия выбранный ингибитор в условиях in vitro не обладал антибактериальным действием в отношении как изученных патогенов, так и представителей нормальной микрофлоры человека.
Проведенные исследования возможности формирования устойчивости показали, что в отличие от антибиотиков чувствительность к препарату не менялась в условиях длительного пассирования в присутствии препарата. В исследовании L. Nesterenko и соавт. [50] было продемонстрировано действие CL-55 на экспериментальную инфекцию, вызванную S. enterica серовар Typhimurium. Было обнаружено, что CL-55 подавляет сальмонеллезную инфекцию в
модели генерализованной инфекции на мышах, приводя к полному уничтожению возбудителя в селезенке, печени и крови после терапии в течение 5 дней.
На основе низкомолекулярного соединения CL-55 была разработана лекарственная форма препарат Фтортиазинон (ФТ). Терапевтическое действие ФТ in vivo оценивали на модели псевдомонадной пневмонии, вызванной клиническими изолятами P. aerug-inosa с различными профилями множественной ан-тибиотикорезистентности. На разработанной модели было показано достоверное снижение бактериальной нагрузки в тканях легкого и высокий протективный эффект в группе лечения. На модели пневмонии и ожоговой инфекции, вызванной псевдомонадами, было показано блокирование генерализации инфекции, т.е. подавлялась бактериемия, характерная для таких заболеваний. На фоне лечения патоморфологические изменения в тканях были существенно меньше выражены по сравнению с контрольными животными.
ФТ демонстрировал равную эффективность с антибиотиками в отношении подавления острого инфекционного процесса и устранения возбудителя из организма животных в сопоставимых с антибиотиками дозах [47]. Для ФТ был проведен полный цикл токсикологических исследований. В ходе проведения комплексного доклинического исследования, включавшего изучение мутагенности и канцерогенности, острой токсичности, хронической токсичности, ал-лергизирующих свойств, иммунотоксичности и репродуктивной токсичности, не было выявлено результатов, препятствующих дальнейшей разработке препарата. Препарат ФТ прошел I фазу клинических исследований, по результатам проведения которой были получены данные, свидетельствующие о безопасности препарата. В настоящее время препарат проходит II фазу клинических испытаний на пациентах с осложненными инфекциями мочевыводящих путей.
Ингибиторы на основе антител. Среди ингибиторов, подавляющих функционирование ССТТ, отдельно можно выделить препараты на основе специфических антител. Для инактивации транслокона ССТТ P. aeruginosa были разработаны кроличьи поликло-нальные анти-PcrV-антитела и мышиные монокло-нальные анти-PcrV-антитела (mAb166.2a), ингиби-рующие транслокацию эффекторов псевдомонад. Такое ингибирование приводило к восстановлению фагоцитарной активности макрофагов в отношении патогена [51—53]. Несмотря на вариабельность последовательности PcrV среди различных штаммов P. aeruginosa, анти-PcrV антитела были эффективны в снижении цитотоксичности широкого спектра клинических изолятов, что позволяет предположить перспективность их применения в клинике.
Исследования по оценке возможности действия антител на биопленки были проведены V. Ray и со-авт. [54]. В этой работе исследователи показали, что
моноклональные антитела к экзополисахариду PsI действуют на образование и созревание биопленок, а также на уже сформировавшиеся биопленки.
Одним из препаратов на основе антител сразу к двум мишеням является MEDI3902. MEDI3902 (MedImmune LLC; Неймеген, Нидерланды) — это гу-манизированые бивалентные биспецифические моноклональные антитела (mAb), действие которых направлено на инактивацию как белка кончика иглы PcrV, так и на экзополисахарида PsI. MEDI3902 снижали цитотоксичность клинических изолятов, экс-прессирующих PcrV (100%) и PsI (98%) [51].
Для MEDI3902 были проведены доклинические исследования. По их результатам показано, что MEDI3902 оказывал протективный эффект на модели острой летальной пневмонии, вызванной P. aeruginosa, а также на модели бактериемии и ожоговой модели. Было выявлено, что MEDI3902 сохраняет целостность тканей легкого, снижает бактериальную нагрузку и предотвращает распространение патогена в селезенку и почки.
MEDI3902 прошел I фазу клинических испытаний и в настоящее время находится на II фазе испытаний при лечении пациентов, находящихся на ИВЛ на фоне госпитальной псевдомонадной инфекции.
Другой препарат на основе антител был разработан против белка кончика иглы PcrV, KB001 (Kalobios Pharmaceuticals; Сан-Франциско, Калифорния, США) на основе моноклональных антител к PcrV, mAb166.2a. Для препарата KB001 была показана безопасность в отношении здоровых добровольцев. Однако клинические испытания на пациентах с муко-висцидозом не показали достаточную эффективность препарата КВ001, и его дальнейшее исследование было приостановлено [52].
V2L2MD — это еще один вариант антител, показавший свое действие как на клетках, так и на животных. Антитела анти-PcrVMAb V2L2MD in vitro снижали ССТТ-опосредованную цитотоксичность на человеческих бронхоэпителиальных клетках.
Антитела оказывали протективный эффект при заражении животных летальной дозой P. aeruginosa на модели острой пневмонии, а на модели нелетальной пневмонии было отмечено значительное снижение бактериальной нагрузки в легких, селезенке и почках.
В современной литературе пока не представлено данных о применении антител V2L2MD в качестве препарата для лечения псевдомонадных инфекций у людей [53].
Ингибиторы эффекторных белков ССТТ
Еще одной стратегией снижения вирулентности является воздействие непосредственно на эффектор-ные белки ССТТ, которых у P. aeruginosa к настоящему времени описано четыре. Такой подход направлен на снижение токсического воздействия на клетки хозяина, однако имеет ограничения в связи с тем,
что не все эффекторы экспрессируются в каждом отдельном штамме.
Псевдолипазин А был первым ингибитором белка ExoU. Он получен в результате скрининга in silico. Псевдолипазин выступает в качестве специфического ингибитора активности фосфолипазы А2 белка ExoU P. aeruginosa, не влияя при этом на другие эука-риотические фосфолипазы [55].
Арилсульфамиды также являются ингибиторами белка ExoU. Некоторые соединения этой группы арил-сульфамидов значительно ингибировали цитотоксич-ность, опосредованную белком ExoU, при этом не вызывая неспецифической цитотоксичности [56].
При сравнении действия арилсульфонамидов и псевдолипазина А было показано, что активность арилсульфонамидов не превышала активности псев-долипазина А при ингибировании ExoU-опосредован-ной цитотоксичности. Действие этих соединений на животных к настоящему времени показано не было.
Семейство синтетических циклических пептид-пептоидных гибридных молекул (пептомеров) идентифицировали в экспериментальном скрининге ингибиторов ССТТ. Ингибиторы этого класса демонстрировали дозозависимое подавление секреции эффектора ExoU у P. aeruginosa, не влияя при этом на рост или подвижность бактерий. При изучении действия пептомеров на флагеллу ингибирующего эффекта отмечено не было. Действие пептомеров in vivo еще предстоит исследовать [57].
Ингибитор экзоцин был получен путем скрининга низкомолекулярных ингибиторов на клетках дрожжей, экспрессирующих ExoS P. aeruginosa. Экзоцин подавлял ферментативную активность АДФ-рибозил-трансферазы белка ExoS P. aeruginosa. Экзоцин действовал в качестве конкурентного ингибитора в отношении субстрата NAD+ белка ExoS. Было показано действие in vitro на клетках млекопитающих. Экзоцин защищал клетки СНО (chinese hamster ovary, клетки китайского хомячка) от лизиса, вызванного синегной-ными бактериями. Данных по дальнейшему исследованию этого ингибитора найти не удалось [58].
Тиенопиримидиноны — относительно новый класс ингибиторов АДФ-рибозилтрансферазы белка ExoS. Ингибирование белка ExoS показано in vitro путем ферментативного анализа. Было разработано несколько соединений, которые блокировали АДФ-ри-бозилтрансферазную активность белка ExoS P. aeruginosa. Подробно действие тиенопиримидинонов в тестах in vitro и in vivo не описано [59].
Хопафенол замыкает класс ингибиторов, действующих на эффекторные белки ССТТ. Он был получен в результате скрининга библиотек природных соединений и относится к классу полифенолов, которые являются тетрамерами ресвератрола. Было показано, что хопафенол ингибировал ССТТ у Y. pseudotubercu-losis: отмечалось подавление экспрессии и транслокации белка YopE, экспрессии и секреции трансло-
катора YopD и секреции белка YopH. У C. trachomatis хопафенол уменьшал проникновение в клетки и последующий внутриклеточный рост. При действии на P. aeruginosa хопафенол блокировал секрецию белка ExoS и снижал ССТТ-опосредованную цитотоксич-ность. Таким образом, было показано действие хопа-фенола in vitro на клетках млекопитающих, однако данных о действии in vivo пока нет [60].
Заключение
Ключевым фактором вирулентности псевдомонад является ССТТ, с помощью которой бактерия транспортирует эффекторные белки в клетку хозяина. Основное действие эффекторных белков направлено на подавление иммунного ответа: они ингибируют миграцию и фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, рекрутируемых к очагу инфекции, вызывают гибель иммунных клеток. Внутрибольничные инфекции, вызванные синегнойной палочкой, практически не поддаются стандартному антибактериальному лечению вследствие множественной устойчивости к антибиотикам у клинических штаммов. Очевидно, что для решения проблемы антибиотикорезистентности и повышения эффективности лечения необходимо выбирать новые мишени для разработки антибактериальных препаратов. Одной из перспективных мишеней в составе факторов вирулентности является ССТТ гра-мотрицательных бактерий в связи с ее крайне важной функцией в развитии инфекционного процесса.
Анализ литературы показывает, что в последние 20 лет в лабораториях всего мира активно проводились исследования в области разработки ингибиторов, действующих на ССТТ различных бактерий. К настоящему времени разработан целый ряд ингибиторов разной природы и с разными механизмами действия. Однако конкретные молекулярные мишени идентифицированы лишь для небольшого числа описанных соединений, а механизмы еще мало изучены. Среди описанных ингибиторов для основной массы соединений показано только действие in vitro. Действие на моделях in vivo было показано для гидрокси-хинолонов и гидразонов салицилового альдегида. Самыми перспективными ингибиторами на данный момент являются два соединения: фтортиазинон, относящийся к классу тиадиазинонов, и препарат на основе антител MEDI3902, для которого на данный момент завершены клинические исследования II фазы. Стоит отметить, что препараты на основе антител обладают низкой биодоступностью при перораль-ном введении и должны вводиться инъекционно, в отличие от низкомолекулярных ингибиторов, которые обладают более высокой пероральной биодоступностью и, соответственно, более привлекательны в качестве лекарственных препаратов. Описанные данные дают надежду на то, что новые препараты на основе ингибиторов ССТТ позволят решить существу-
ющую проблему лечения и могут применяться как в составе комплексной терапии, так и, возможно, при дальнейшем изучении, при монотерапии.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Weiss E, Essaied W, Adrie C, Zahar JR, Timsit JF. Treatment of severe hospital-acquired and ventilator-associated pneumonia: a systematic review of inclusion and judgment criteria used in randomized controlled trials. Critical Care. 2017;21(1):162. https://doi.org/10.1186/s13054-017-1755-5
2. Weiner LM, Webb AK, Limbago B, Dudeck MA, Patel J, Kallen AJ, et al. Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2011—2014. Infection control & hospital epidemiology. 2016;37(11):1288-1301. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2011.07.013
3. Rasko DA, Sperandio V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews Drug discovery. 2010;9(2):117. https://doi.org/10.1038/nrd3013
4. El-Solh AA, Hattemer A, Hauser AR, Alhajhusain A, Vora H. Clinical outcomes of type III Pseudomonas aeruginosa bacteremia. Critical care medicine. 2012;40(4):1157.
https://doi.org/10.1097/CCM.0b013e3182377906
5. Hauser AR, Cobb E, Bodí M, Mariscal D, Vallés J, Engel JN, et al. Type III protein secretion is associated with poor clinical outcomes in patients with ventilator-associated pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa. Critical care medicine. 2002;30(3):521-528.
6. Hauser AR. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 2009;7(9):654. https://doi.org/10.1038/nrmicro2199
7. Cornelis GR, Van Gijsegem F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Reviews in Microbiology. 2000;54(1):735-774. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.54.1.735
8. Deng W, Marshall NC, Rowland JL, McCoy JM, Worrall LJ, Santos AS, et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 2017;15(6):323. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.125
9. Zilkenat S, Franz-Wachtel M, Stierhof YD, Galán JE, Macek B, Wagner S. Determination of the stoichiometry of the complete bacterial type III secretion needle complex using a combined quantitative proteomic approach. Molecular & Cellular Proteomics. 2016;15(5):1598-1609. https://doi.org/10.1074/mcp.M115.056598
10. Halder PK, Roy C, Datta S. Structural and functional characterization of type three secretion system ATPase PscN and its regulator PscL from Pseudomonas aeruginosa. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2019;87(4):276-288. https://doi.org/10.1002/prot.25648
11. Worrall LJ, Hong C, Vuckovic M, Deng W, Bergeron JRC, Majewski DD. et al. Near-atomic-resolution cryo-EM analysis of the Salmonella T3S in-jectisome basal body. Nature. 2016;540(7634):597. https://doi.org/10.1038/nature20576
12. Lombardi C, Tolchard J, Bouillot S, Signor L, Gebus C, Liebl D, et al. Structural and functional characterization of the Type Three Secretion System (T3SS) needle of Pseudomonas aeruginosa. Frontiers in Microbiology. 2019;10:573. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00573
13. Wood SE, Jin J, Lloyd SA. YscP and YscU switch the substrate specificity of the Yersinia type III secretion system by regulating export of the inner rod protein YscI. Journal of bacteriology. 2008;190(12):4252-4262. https://doi.org/10.1128/JB.00328-08
14. Mattel PJ, Faudry E, Job V, Izoré T, Attree I, Dessen A. Membrane targeting and pore formation by the type III secretion system translocon. The FEBS journal. 2011;278(3):414-426. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2010.07974.x
15. Diaz MR, King JM, Yahr TL. Intrinsic and extrinsic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Frontiers in microbiology. 2011;2:89.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00089
16. Intile PJ, Balzer GJ, Wolfgang MC, Yahr TL. The RNA helicase DeaD stimulates ExsA translation to promote expression of the Pseudomonas aerugino-sa type III secretion system. Journal of bacteriology. 2015;197(16):2664-2674. https://doi.org/10.1128/JB.00231-15
17. Marsden AE, Intile PJ, Schulmeyer KH, Simmons-Patterson ER, Urbanows-ki ML, Wolfgang MC, et al. Vfr directly activates exsA transcription to reg-
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ulate expression of the Pseudomonas aeruginosa type III secretion system. Journal oof bacteriology. 2016;198(9):1442-1450. https://doi.org/10.1128/JB.00049-16
18. Shen DK, Filopon D, Kuhn L, Polack B, Toussaint B. Psr. A is a positive transcriptional regulator of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa. Infection and immunity. 2006;74(2):1121-1129. https://doi.org/10.1128/IAI.74.2.1121-1129.2006
19. Ho O, Rogne P, Edgren T, Wolf-Watz H, Login FH, Wolf-Watz M. Characterization of the ruler protein interaction interface on the substrate specificity switch protein in the Yersinia type III secretion system. Journal of Biological Chemistry. 2017;292(8):3299-3311. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.770255
20. Lee PC, Zmina SE, Stopford CM, Toska J, Rietsch A. Control of type III secretion activity and substrate specificity by the cytoplasmic regulator PcrG. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014;111(19):2027-2036. https://doi.org/10.1073/pnas.1402658111
21. Sato H, Frank DW. ExoU is a potent intracellular phospholipase. Molecular microbiology. 2004;53(5):1279-1290. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2004.04194.x
22. Jia J, Wang Y, Zhou L, Jin S. Expression of Pseudomonas aeruginosa toxin ExoS effectively induces apoptosis in host cells. Infection and immunity. 2006;74(12):6557-6570. https://doi.org/10.1128/IAI.00591-06
23. Wood SJ, Goldufsky JW, Bello D, Masood S, Shafikhani SH. Pseudomonas aeruginosa ExoT induces mitochondrial apoptosis in target host cells in a manner that depends on its GTPase-activating protein (GAP) domain activity. Journal oof Biological Chemistry. 2015;290(486):29063-29073. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.689950
24. Hritonenko V, Mun JJ, Tam C, Simon NC, Barbieri JT, Evans DJ, et al. Ad-enylatecyclase activity of Pseudomonas aeruginosa ExoY can mediate bleb-niche formation in epithelial cells and contributes to virulence. Microbial pathogenesis. 2011;51(5):305-312. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2011.08.001
25. Kauppi AM, Nordfelth R, Uvell H, Wolf-Watz H, Elofsson M. Targeting bacterial virulence: inhibitors of type III secretion in Yersinia. Chemistry & biology. 2003;10(3):241-249. https://doi.org/10.1016/S1074-5521(03)00046-2
26. Anantharajah A, Buyck JM, Sundin C, Tulkens PM, Mingeot-Leclercq MP, Van Bambeke F. Salicylideneacylhydrazides and hydroxyquinolines act as inhibitors of type three secretion systems in Pseudomonas aeruginosa by distinct mechanisms. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2017;61(6):e02566-16. https://doi.org/10.1128/AAC.02566-16
27. Gu L, Zhou S, Zhu L, Liang C, Chen X. Small-molecule inhibitors of the type III secretion system. Molecules. 2015;20(9):17659-17674. https://doi.org/10.3390/molecules200917659
28. Kimura K, Iwatsuki M, Nagai T, Matsumoto A, Takahashi Y, Shiomi K, et al. A small-molecule inhibitor of the bacterial type III secretion system protects against in vivo infection with Citrobacterrodentium. The Journal oof antibiotics. 2011;64(2):197-203. https://doi.org/10.1038/ja.2010.155
29. Slepenkin A, Chu H, Elofsson M, Keyser P, Peterson EM. Protection of mice from a Chlamydia trachomatis vaginal infection using a salicylideneacylhydra-zide, a potential microbicide. The Journal of antibiotics. 2011;64(2):197-203. https://doi.org/10.1093/infdis/jir552
30. Uusitalo P, Hägglund U, Rhöös E, Norberg HS, Elofsson M, Sundin C. The salicylideneacylhydrazide INP0341 attenuates Pseudomonas aeruginosa virulence in vitro and in vivo. The Journal of antibiotics. 2017;70(9):937-943. https://doi.org/10.1038/ja.2017.64
31. Kim OK, Garrity-Ryan LK, Bartlett VJ, Grier MC, Verma AK, Medjanis G, et al. N-hydroxybenzimidazole inhibitors of the transcription factor LcrF in Yersinia: novel antivirulence agents. Journal of medicinal chemistry. 2009;52(18):5626-5634. https://doi.org/10.1021/jm9006577
32. Grier MC, Garrity-Ryan LK, Bartlett VJ, Klausner KA, Donovan PJ, Dudley C, et al. N-Hydroxybenzimidazole inhibitors of ExsA MAR transcription factor in Pseudomonas aeruginosa: In vitro anti-virulence activity and metabolic stability. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2010;20(11):3380-3383. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2010.04.014
33.
34
41.
42.
Marsden AE, King JM, Spies MA, Kim OK, Yahr TL. Inhibition of Pseudomonas aeruginosaExsA DNA-binding activity by N-hydroxybenzimidaz-oles. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2016;60(2):766-776. https://doi.org/10.1128/AAC.00732-ll
Yamazaki A, Li J, Zeng Q, Khokhani D, Hutchins WC, Yost AC, et al. Derivatives of plant phenolic compound affect the type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa via a GacS-GacA two-component signal transduction system. Antimicrobial agents and chemotherapy. 56(1):36-43. https://doi.org/10.1128/AAC.00732-11
35. Enquist PA, Gylfe Ä, Hägglund U, Lindström P, Norberg-Scherman H, Sundin C, et al. Derivatives of 8-hydroxyquinoline — antibacterial agents that target intra-and extracellular Gram-negative pathogens. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2012;22(10):3550-3553. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2012.03.096
36. Rietsch A, Vallet-Gely I, Dove SL, Mekalanos JJ. ExsE, a secreted regulator of type III secretion genes in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005;102(22):8006-8011. https://doi.org/10.1073/pnas.0503005102
37. Anantharajah A, Faure E, Buyck JM, Sundin C, Lindmark T, Mecsas J, et al. Inhibition of the injectisome and flagellar type III secretion systems by INP1855 impairs Pseudomonas aeruginosa pathogenicity and inflammasome activation. The Journal of infectious diseases. 2016;214(7):1105-1116. https://doi.org/10.1093/infdis/jiw295
38.
39.
Anantharajah A, Buyck JM, Faure E, Glupczynski Y, Rodriguez-Villalobos H, De Vos D, et al. Correlation between cytotoxicity induced by Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from acute infections and IL-1ß secretion in a model of human THP-1 monocytes. Pathogens and disease. 2015;73(7). https://doi.org/10.1093/femspd/ftv049
Felise HB, Nguyen HV, Pfuetzner RA, Barry KC, Jackson SR, Blanc MP, et al. An inhibitor of gram-negative bacterial virulence protein secretion. Cell host & microbe. 2008;4(4):325-336. https://doi.org/10.1016/j.chom.2008.08.001 40. Tosi T, Estrozi LF, Job V, Guilvout I, Pugsley AP, Schoehn G, et al. Structural similarity of secretins from type II and type III secretion systems. Structure. 2013;21(11):1979-1991. https://doi.org/10.1016/j.str.2014.07.005
Tsou LK, Dossa PD, Hang HC. Small molecules aimed at type III secretion systems to inhibit bacterial virulence. Medchemcomm. 2013;4(1):68-79. https://doi.org/10.1039/C2MD20213A
Arnoldo A, Curak J, Kittanakom S, Chevelev I, Lee VT, Sahebol-Amri M, et al. Identification of small molecule inhibitors of Pseudomonas aerugino-saexoenzyme S using a yeast phenotypic screen. PLoS genetics. 2008;4(2). https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000005 43. Bowlin NO, Williams JD, Knoten CA, Torhan MC, Tashjian TF, Li B, et al. Mutations in the Pseudomonas aeruginosa needle protein gene pscF confer resistance to phenoxyacetamide inhibitors of the type III secretion system. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2014;58(4):2211-2220. https://doi.org/10.1128/AAC.02795-13
44.
45
Berube BJ, Murphy KR, Torhan MC, Bowlin NO, Williams JD, Bowli TL, et al. Impact of type III secretion effectors and of phenoxyacetamide inhibitors of type III secretion on abscess formation in a mouse model of Pseudomonas aeruginosa infection. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2017;61(11):e01202-17.10.1128/AAC.01202-17
Зигангирова Н.А., Гинцбург А.Л. Мишень-специфический поиск антивирулентных препаратов для лечения хронических инфекций. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2011;4:107-115. Zigangirova NA, Gintsburg AL. Target-specific screening of antivirulence preparations for chronic infection therapy. Zhurnal mikrobiologii, epidemi-ologii, iimmunobiologii. 2011;4:107-115. (In Russ.).
46. Zigangirova NA, Zayakin ES, Kapotina LN, Kost EA, Didenko LV, Davy-dova DY, et al. Development of chlamydial type III secretion system inhibitors for suppression of acute and chronic forms of chlamydial infection. Ac-taNaturae (англоязычная версия). 2012;2(13).
47. Sheremet AB, Zigangirova NA, Zayakin ES, Luyksaar SI, Kapotina LN, Nes-terenko LN, et al. Small Molecule Inhibitor of Type Three Secretion System Belonging to a Class 2, 4-disubstituted-4H-[1, 3, 4]-thiadiazine-5-ones Improves Survival and Decreases Bacterial Loads in an Airway Pseudomonas aeruginosa Infection in Mice. BioMed research international. 2018. https://doi.org/10.1038/ja.2015.131
48. Koroleva EA, Kobets NV, Zayakin ES, Luyksaar SI, Shabalina LA, Zigangirova NA. Small molecule inhibitor of type three secretion suppresses acute and chronic chlamydia trachomatis infection in a novel urogenital Chlamyd-ia model. BioMed research international. 2015. https://doi.org/10.1155/2015/484853
49. Zigangirova NA, Kost EA, Didenko LV, Kapotina LN, Zayakin ES, Luyksaar SI, et al. A small-molecule compound belonging to a class of 2,4-disubstitut-ed 1, 3, 4-thiadiazine-5-ones inhibits intracellular growth and persistence of Chlamydia trachomatis. Journal of medical microbiology. 2016;1(91-98). https://doi.org/10.1099/jmm.0.000189
50. Nesterenko LN, Zigangirova NA, Zayakin ES, Luyksaar SI, Kobets NV. Balunets DV, et al. A small-molecule compound belonging to a class of 2, 4-disubstituted 1, 3, 4-thiadiazine-5-ones suppresses Salmonella infection in vivo. The Journal of antibiotics. 2016;6:422. https://doi.org/10.1038/ja.2015.131
51.
52.
53
57.
58.
DiGiandomenico A, Keller AE, Gao C, Rainey GJ, Warrener P, Camara MM, et al. A multifunctional bispecific antibody protects against Pseudomonas aeruginosa. Science Translational Medicine. 2014;6(262):262ra155-262ra155.
Warrener P, Varkey R, Bonnell JC, DiGiandomenico A, Camara M, Cook K, et al. A novel anti-PcrV antibody providing enhanced protection against Pseudomonas aeruginosa in multiple animal infection models. Antimicrobial agents and chemotherap. 2014;58(8):4384-4391.
DiGiandomenico A, Patel A, Smith T, Keller A, Elliot ST, Wachter L, et al. DNA-delivery of monospecific and bispecific monoclonal antibodies targeting Pseudomonas Aeruginosaprotect mice from lethal pneumonia. D24. GRAM NEGATIVE PNEUMONIAS: FROM BENCH TO BEDSIDE. American Thoracic Society. 2016;A7898-A7898.
54. Ray VA, Hill PJ, Stover CK, Roy S, Sen CK, Yu L, et al. Anti-Psl targeting of Pseudomonas aeruginosa biofilms for neutrophil-mediated disruption. Scientific reports. 2017;7(1):1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16215-6
55. Lee VT, Pukatzki S, Sato H, Kikawada E, Kazimirova AA, Huang J, et al. Pseudo-lipasin A is a specific inhibitor for phospholipase A2 activity of Pseudomonas aeru-ginosa cytotoxin ExoU. Infection and immunity. 2007;75( ):1089-1098. https://doi.org/10.1128/IAI.01184-06
56. Kim D, Baek J, Song J, Byeon H, Min H, Min KH. Identification of aryl-sulfonamides as ExoU inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2014;24(16):3823-3825. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2014.06.064
Lam H, Schwochert J, Lao Y, Lau T, Lloyd C, Luu J, et al. Synthetic cyclic peptomers as type III secretion system inhibitors. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2017;58(7):3762-3767. https://doi.org/10.1128/AAC.00060-17
Arnoldo A, Curak J, Kittanakom S, Chevelev I, Lee VT, Sahebol-Amri M, et al. Identification of small molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosaex-oenzyme S using a yeast phenotypic screen. PLoSgenetics. 2008;4(2):e1000005. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000005
59. Saleeb M, Sundin C, Aglar Ö, Pinto AF, Ebrahimi M, Forsberg Ä, et al. Structure—activity relationships for inhibitors of Pseudomonas aerugino-saexoenzyme S ADP-ribosyltransferase activity. European journal oof medicinal chemistry. 2018;143:568-576. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2017.11.036
60. Zetterström CE, Hasselgren J, Salin O, Davis RA, Quinn RJ, Sundin C, et al. The resveratrol tetramer (-)-hopeaphenol inhibits type III secretion in the Gram-negative pathogens Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa. PLoS One. 2013;8(12):e81969. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081969
Поступила в редакцию 03.06.19
Received April 03.06.19
После доработки 08.07.19
Revised April 08.07.19
Принята к публикации 10.07.19
Accepted 10.07.19
