CC BY
65
УДК 616.12- 007.2 - 053.1/2 - 07:575.113 (470.620) Кубанский научный медицинский вестник № 5 (140) 2013
О. П. БРАЙКО1, К. Ю. ЛАЗАРЕВ1, А. В. ПОЛОНИКОВ2, В. И. ГОЛУБЦОВ1, Я. Д. ШВЕЦОВ2
молекулярно-генетический анализ
полиморфизма VAL432LEUГЕНА CYP1B1И G590A ГЕНА NAT2
у детей с изолированным дефектом межжелудочковой перегородки в краснодарском крае
Кафедра биологии с курсом медицинской генетики ГБОУ ВПО «КубГМУ Минздрава Росии»,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. 89615274547. E-mail: brayko_op@mail.ru;
2кафедра биологии, медицинской генетики и экологии ГОУ ВПО КГМУ Минздрава России,
Россия, 305004, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3а, тел. 8 (471) 222-56-12. E-mail: poloniкov@rambler.ru
Изучена ассоциация полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 с предрасположенностью к дефекту межжелудочковой перегородки у детей в Краснодарском крае. Установлено, что в качестве прогностически неблагоприятной комбинации следует отметить вариант 432АG/590 GG, для которого выявлено статистически значимое различие в частотах генотипов полиморфизма Val432Leu CYP1B1 и полиморфизма G590A гена NAT2 между группами больных и здоровых (X2 =5,71, р=0,02; OR=2,74, CI=1,17-6,44).
Ключевые слова: врожденный дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП), полиморфизм, маркер предрасположенности, Краснодарский край.
О. P. BRAYKO1, К. U. LAZAREV1, А. V. POLONICOV2, V. I. GOLUBCOV, Y. D. SHVECOV2
THE MOLECULAR AND GENETIC ANALYSIS OF POLYMORPHISM VAL432LEU GENE CYP1B1 AND G590A GENE NAT2 IN CHILDREN ASSOCIATED WITH THE ISOLATED DEFECT OF INTERVENTRICULAR DEVELOPMENT IN KRASNODAR REGION
1Departmen biology with a course of medical genetics of GBOU VPO «Kuban states medical university»,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedin str., 4, tel. 89615274547. E-mail: brayko_op@mail.ru;
2departmen biology, medical genetics and ecology of GBOU VPO «Kursk states medical university»,
Russia, 305004, Kursk, Charles Marx str., 3a, tel. 8 (471) 222-56-12. E-mail: poloniкov@rambler.ru
The association of polymorphism Val432Leu gene of CYP1B1 and G590A gene NAT2 predisposition with to IVP in children is studied in Krasnodar region.
It is established that as predictively adverse combination it should be noted option 432AG/590 GG for which statistically significant distinction in frequencies of genotypes of polymorphism of Val432Leu CYP1B1 and polymorphism of G590A of a gene of NAT2 between groups sick and healthy (x2 =5,71, р=0,02; OR=2,74, CI=1,17-6,44).
Key words: congenital defect of interventricular partition (IVP), polymorphism, associated marker, Krasnodar region.
Дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП) занимает первое место в структуре врожденных пороков развития системы кровообращения (ВПР СК) в Краснодарском крае (51,8%) с частотой среди новорожденных 7,96%о [4]. Изолированные случаи данного порока сердца имеют мультифак-ториальную природу. На сегодняшний день накоплено значительное число данных о вовлеченности различных полиморфных генов в формирование предрасположенности к патологии мультифакто-риального генеза. Одними из таких генов являются гены ферментов детоксикации ксенобиотиков, экспрессия которых зависима от средовых факторов. Данные гены представляют интерес для исследований этиологии мультифакториальных заболеваний [7].
Процесс детоксикации включает две последовательные фазы [1]. CYP1B1 относится к группе семейст-
ва цитохром P450-зависимой монооксигеназы, первой фазы детоксикации ксенобиотиков [3, 8].
Ген NAT-2 кодирует аминокислотную последовательность цитозольного фермента ^ацетил-трансфе-разы II типа и имеет более 20 полиморфизмов. Как правило, 95% представителей популяций имеют 5-6 наиболее распространенных аллельных вариантов, остальные аллели достаточно редкие, на их долю приходится оставшиеся 5% индивидуумов. Аллельные варианты характеризуются различной активностью фермента. От активности фермента зависит эффективность очистки организма от многих токсинов и онкогенов, что определяет связь аллельных вариантов с большим или меньшим риском различных заболеваний [10, 11].
В связи с этим представляется целесообразным тестирование полиморфных вариантов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 в качестве маркера предрасположенности к формированию ДМЖП.
Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекс фиксации генов системы детоксикации ксенобиотиков среди больных с ДМЖП в Краснодарском крае
Локусы, показатели Больные ДМЖП Контрольная группа
Val432Leu CYP1B1 100 232
N0 П) 432АА 39 (40,32) 85 (86,30)
432АG 49 (46,35) 113 (110,39)
432GG 12 (13,32) 34 (35,30)
Х (Н\«Е)(Р) 0,33 (>0,05) 0,13 (>0,05)
Но (Не) 0,49 (0,46) 0,49 (0,48)
D № +0,06 (0,50) +0,02 (0,33)
G590A NAT2 100 232
N0 П) 590II 48 (42,90) 105 (103,56)
590Ю 35 (45,19) 100 (102,89)
590GG 17 (11,90) 27 (25,56)
х (Н\«Е)(Р) 5,09 (р<0,05) 0,18 (>0,05)
Но (Не) 0,35 (0,45) 0,43 (0,44)
D (t) -0,23 (1,96) - 0,03 (0,35)
Примечание: ^ - объем выборки; N - наблюдаемое распределение фенотипов; N - ожидаемое распределение фенотипов; х2 (НдаЕ) - показатель соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга; р - достигнутый уровень значимости для х2 (НТОЕ); Но - наблюдаемая гетерозиготность; Не - ожидаемая гетерозиготность; D - индекс фиксации Райта; t - критерий Стьюдента, характеризующий индекс фиксации.
Таблица 2
Распределение частот аллелей полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 и в590А гена NAT2 в группах больных ДМЖП и здоровых индивидов
Исследуемая группа Val432Leu ОУР1В1 в590А гена ЫАТ2
432А 432в 590I 590 в
Больные ДМЖП (п=100) 0,635 0,365 0,655 0,345
Здоровые (п=152) 0,500 0,500 0,610 0,390
X2 (р) d. ^ =1 0,37 (0,54) 0,11 (0,74)
Таблица 3
Распределение частот генотипов полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и 6590А гена NAT2 между группами больных ДМЖП и здоровых индивидов (абс., %)
Исследуемая группа Val432Leu СУР1В1 в590А ЫАТ2
432АА 432Ав 432вв 590 II 590 1в 590 вв
Больные ДМЖП (п=100) 39 (39,0) 49 (49,0) 12 (12,0) 48 (48,0) 35 (35,0) 17 (17,0)
Здоровые (п=232) 85 (36,6) 113 (48,7) 34 (14,7) 105 (45,3) 100 (43,1) 27 (11,6)
X2 (р) d. ^ =1 0,17 (0,68) 0,002 (0,96) 0,41 (0,52) 0,21 (0,65) 1,90 (0,17) 1,75 (0,19)
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (140) 2013
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (140) 2013
Распределение частот комбинаций генотипов генов Val432Leu СУР1В1 и 6590А NAT2 в группах больных ДМЖП и здоровых индивидов, абс., %
Частоты комбинаций генотипов Критерий OR (95% CI)
Комбинации генотипов Больные ДМЖП (n=100) Контрольная группа (n=232) различия х2 (р)
CYP1B1432 AA/ NAT2 59011 22 (22,0) 37 (15,9) 1,75 (0,19) 1,49 (0,82-2,68)
CYP1B1432 AA/ NAT2 590 IG 16 (16,0) 36 (15,5) 0,01 (0,91) 1,04 (0,55-1,97)
CYP1B1432 AA/ NAT2 590 GG 3 (3,0) 13 (5,6) 1,03 (0,31) 0,52 (0,15-1,87)
CYP1B1432 AG/ NAT2 59011 16 (16,0) 53 (22,8) 1,99 (0,16) 0,64 (0,35-1,19)
CYP1B1432 AG/ NAT2 590 IG 19 (19,0) 49 (21,2) 0,19 (0,66) 0,88 (0,49-1,58)
CYP1B1432 AG/ NAT2 590 GG 12 (12,0) 11 (4,8) 5,71 (0,02) 2,74 (1,17-6,44)
CYP1B1432 GG/ NAT2 59011 8 (8,0) 16 (6,9) 0,13 (0,72) 1,17 (1,94-2,84)
CYP1B1432 GG/ NAT2 590 IG 3 (3,0) 13 (5,6) 1,03 (0,31) 0,52 (0,15-1,87)
CYP1B1432 GG/ NAT2 590 GG 1 (1,0) 4 (1,7) 0,25 (0,62) 0,58 (0,06-5,22)
Цель работы - определить ассоциацию полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 с предрасположенностью к ДМЖП у детей Краснодарского края.
материалы и методы исследования
Объектом исследования явились дети с ДМЖП (100 человек), родившиеся в 1998-2012 гг., а также группа популяционного контроля (232 человека) славянской национальности из 38 территориальных образований и 6 городов Краснодарского края. Родители всех детей были рождены и постоянно проживали на территории Краснодарского края. Средний возраст детей с ДМЖП составил 3,11±0,81 года (46 мальчиков - 46% и 64 девочки - 64%). Дизайн настоящего исследования предполагал, что группой популяционного контроля явились родители детей с ДМЖП, не имеющих врожденных пороков развития, все они имеют славянскую национальность и являются коренными жителями Краснодарского края.
Для систематизации и статистической обработки данных была сформирована электронная база с включенными сведениями каждого пробанда.
С целью верификации диагноза всем больным было проведено комплексное обследование, включавшее клинические методы с использованием физикального обследования, анкетирования, и специальные (ЭКГ, УЗИ, рентгенография сердца и др.), а также клинико-генеалогический, цитогенетический методы исследования.
ДНК выделяли из замороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции
[6]. Анализ полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 проводили методом полимеразной цепной реакции с соответствующим анализом данных в амплификаторе CFX96 Bio-rad, в режиме Real time.
Использованные праймеры и зонды («Синтол», Россия) для полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1:
F: 5'-TgTCAACCAgTggTCTgTgAATC -3';
R: 5'-TCACTCTgCTggTCAggTCCTT-3' ;
5'-FAM-ACCCAgTgAAgTgg-RTQ1-3';
5'-ROX-ATgACCCACTgAAgTg-BHQ2-3' [11];
для полиморфизма G590A гена NAT2:
F: 5'-CTgCCAAAgAAgAAACACCAAAA -3';
R: 5'-TggAgACgTCTgCAggTATgTATT-3' ;
5'-FAM-ACCTCgAACAATTg-RTQ1-3';
5'-ROX-TgAACCTCAAACAATT-BHQ2-3'.
После денатурации (5 мин при 95° С) выполняли 39 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров -1 мин при 48° С (для полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1) и 45° С (для полиморфизма G590A гена NAT2); денатурация - 15 сек. при 95° С. Использован метод дискриминации аллелей (метод Taq Man зондов).
Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборке больных и здоровых лиц использовали критерий х2 [2, 5, 9]. Уровень статистической значимости различий между группами при-
нимали р<0,05. Об ассоциации аллелей и генотипов с предрасположенностью к ДМЖП судили по величине отношения шансов (OR) [12]. Границы 95%-ного доверительного интервала (С1) для OR вычисляли методом В. Woolf. Уровень статистической значимости для D - показатель, отражающий различия между наблюдаемыми и ожидаемыми отношениями гаплотипов специфических аллелей двух локусов при нулевой гипотезе (Н0) о независимости их наследования рассчитывали с помощью критерия х2 для таблиц сопряженности 2^2 [9].
результаты исследования и их обсуждение
Анализ распределения генотипов изучаемых полиморфных генов Val432Leu CYP1B1 и G590A NAT2 показал, что эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (>0,05), но эмпирическое распределение генотипов G590A NAT2 не соответствует теоретически ожидаемому в связи с уменьшением наблюдаемого уровня гетерозиготности (р<0,05). Уровень аллельного разнообразия по данным локусам составил Н0=0,49 (для локуса Val432Leu CYP1B1), Н0=0,35 (для локуса G590A NAT2) среди индивидуумов с ДМЖП и Н0=0,49 (для локуса Val432Leu CYP1B1), Н0=0,43 (для локуса G590A NAT2) в популяционной выборке. Распределение генотипов Val432Leu CYP1B1 как у индивидов с ДМЖП (х2=0,33; d. f.=1; р>0,05), так и в контрольной группе (х2=0,13; d. f.=1; р>0,05) соответствовало ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга, а распределение генотипов G590A NAT2 у детей с ДМЖП (х2=5,09; d. f.=1; р<0,05) не соответствовало ожидаемым частотам по сравнению с контрольной группой (х2=0,18; d. f.=1; р>0,05) (табл.1).
В таблице 2 представлены частоты аллелей полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 в группах больных ДМЖП и здоровых индивидов. Как видно, статистически значимых различий в частотах аллелей полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 между группами больных ДМЖП и здоровых не установлено (р>0,05).
В таблице 3 представлен сравнительный анализ частот генотипов исследуемого полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 между группами больных ДМЖП и здоровых индивидов. Статистически значимых различий в распределении генотипов полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 не установлено (р>0,05). Частота мутантного генотипа 590II, NAT2 в группе больных ДМЖП (17,0%) выше, чем в популяционной выборке (11,6%) (х2=1,00; р=0,32). Однако различия между группами по данному генотипу не достигали принятого в исследовании уровня статистической значимости (х2=1,75; р=0,19).
Анализ парных сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов приведен в таблице 4. Установлено, что в качестве прогностически неблагоприятной комбинации следует отметить вариант 432АG/590 GG, для которого выявлено статистически значимое различие в частотах генотипов полиморфизма Val432Leu CYP1B1 и полиморфизма G590A гена NAT2 между группами больных и здоровых (х2=5,71, р=0,02; OR=2,74, CI=1,17-6,44).
Нами проведено изучение полиморфизмов Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 на этнически гомогенной выборке русских жителей Красно-
дарского края, больных врожденным изолированным ДМЖП. Опираясь на данные литературы, мы предположили, что полиморфизмы Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2, как гены системы детоксикации, могут быть ассоциированы с развитием врожденного изолированного ДМЖП.
В ходе проведенного исследования установлено, что полиморфные варианты Val432Leu гена CYP1B1 и G590A гена NAT2 не ассоциированы с развитием врожденного изолированного ДМЖП. Полученные данные по изучению комбинаций генотипов генов Val432Leu CYP1B1 и G590A NAT2 указывают, что вариант CYP1B1 432 АG/NAT2 590 GG (х2=5,71; р=0,02; OR=2,74; 95%С1 1,17-6,44) является вероятным прогностическим маркером для выявления предрасположенности формирования врожденного изолированного ДМЖП. Однако, учитывая сложность патогенеза данного врожденного порока развития системы кровообращения, считаем необходимым расширить поиск молекулярно-генетических маркеров и комбинаций генотипов предрасположенности к развитию врожденного изолированного ДМЖП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов В. С., Асеев М. В., Баранова Е. В. Гены предрасположенности и генетический паспорт // Природа. - 1999. -№ 3. - С. 17-37.
2. Вейр Б. Анализ генетических данных. Дискретные генетические признаки. - Москва: «Мир», 1995. - С. 85-104.
3. Кольман Ян, Рем Клаус-Генрих. Наглядная биохимия // Taschenatlas der biochemie. - Москва: Мир, 2000. - 470 с.
4. Лазарев К. Ю., Голубцов В. И., Полоников А. В., Брайко О. П., Панкова Е. Е., Матулевич С. А. Анализ структуры и распространенности изолированных врожденных пороков развития системы кровообращения среди новорожденных Краснодарского края (по результатам мониторинга 1998-2009 гг). // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 2 (125). - С. 95-100.
5. Лванга С. К., Чжо-Ек Тыэ. Обучение медицинской статистике: Двадцать конспектов лекций и семинаров. ВОЗ. - М.: Медицина, 1989. - 216 с.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 480 с.
7. Полоников А. В., Иванов В. П., Солодилова М. А. Эколо-го-токсико-генетическая концепция мультифакториальных заболеваний: от понимания этиологии до клинического применения // Медицинская генетика. - 2008. - № 11. - С. 3-19.
8. Пономаренко Т. С., Сычев Д. А., Чикало А. О., Бердникова Н. Г., Кукес В. Г. Система цитохрома Р450 в легких: роль в патогенезе заболеваний и фармакокинетике лекарственных средств // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2012. - № 1. - С. 25-28.
9. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: Медиа Сфера, 2002. - 312 с.
10. Gross М., Kruisselbrink T., Anderson K. Distribution and concordance of N-acetyltransferase genotype and phenotype in an american population // Cancer epidemiology biomarkers & prevention. - 1999. - Vol. 8. - P. 683-692.
11. Hein D. W., Doll M. A., Fretland A. J. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms // Cancer epidemiol. biomarkers. prev. - 2000. - V. 9. № 1. - P. 29-42.
12. Pearce N. (Department of medicine, Wellington school of medicine, PO Box 7343 Wellington, New Zealand). What does the odds ratio estimate in a case-control study? // International. journal of epidemiology. - 1993. - № 22. - P. 1189-1192.
Поступила 09.04.2013
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (140) 2013
