CC BY
58
УДК 616.317-007.254:612.6-05](470.62)
ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМА G590A ГЕНА NAT2 С РАЗВИТИЕМ ВРОЖДЁННЫХ РАСЩЕЛИН ГУБЫ И НЁБА В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ
© Нехорошкина М. О., Бушуева О.Ю.1, Полоников А.В.1, Дарпинян М.М., Голубцов В.И.
Кафедра биологии с курсом медицинской генетики Кубанского государственного медицинского университета, Краснодар; 1 кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: Nekhoroshkina@ro.ru
Врождённые расщелины губы и/или нёба - распространенные врожденные дефекты, которые характеризуются выраженными анатомическими и функциональными нарушениями. Несиндромальные врожденные пороки развития рассматривают как многофакторные заболевания, этиология которых включает генетические факторы, средовые влияния и генно-средовые взаимодействия. Гены ферментов детоксикации ксенобиотиков могут играть важную роль в развитии врожденных пороков развития. В данной работе исследована связь полиморфизма G590A гена NAT2 с возникновением врождённых расщелин губы и/или нёба у жителей Краснодарского края. Было проведено генотипирова-ние у 105 детей с пороками и 154 родителей контрольной группы. Мы обнаружили значимые различия в частотах му-тантного генотипа 590AA между группой пациентов с врожденной расщелиной губы и/или неба и контрольной группой. Показано, что носительство мутантного генотипа 590АА существенно повышает риск формирования врожденных расщелин губы и/или неба у женщин (%2 =4,21 p=0,04). Проведенное исследование подтверждает возможную роль гена NAT2 в формировании риска развития врожденных расщелин губы и/или неба.
Ключевые слова: врождённые расщелины губы и/или нёба, N-ацетилтрансфераза II типа, однонуклеотидный полиморфизм.
ASSOCIATION OF POLYMORPHISM G590A OF THE NAT2 GENE WITH CONGENITAL CLEFT LIP
AND PALATE IN KRASNODAR REGION
Nekhoroshkina M.O., Bushueva O.Yu.1, Polonikov A.V.1, Darpinyan M.M., Golubtsov V.I.
Department of Biology with a Course of Medical Genetics of Kuban State Medical University, Krasnodar;
1 Department of Biology, Medical Genetics and Ecology of Kursk State Medical University, Kursk
Congenital cleft lip and/or palate is a common birth defect, which is characterized by severe anatomical and functional disorders. Nonsyndromic congenital malformations are treated as multifactorial diseases, whose development is determined by genetic factors, environmental influences and gene-environment interactions. Xenobiotic detoxification enzyme genes may play an important role in predisposition to the congenital malformations development. The aim of the present study was to investigate whether G590A of the NAT2 gene is associated with congenital cleft lip and palate in Krasnodar region. This SNP was genotyped in 105 children and their 154 parents. We found a significant difference in the frequency of genotype 590AA between cleft lip and/or palate and control females (%2 =4.21 p=0.04). The present study provides an evidence for a possible role of the NAT2 gene in the development of congenital cleft lip and/or palate.
Keywords: congenital cleft lip, cleft palate, N-acetyltransferase 2, single nucleotide polymorphism.
Врождённые расщелины губы и/или нёба (ВРГ и/или Н) - распространенные врожденные дефекты, которые стоят на 4-7-м месте среди врожденных пороков развития (ВПР) и занимают одно из первых мест по тяжести анатомических и функциональных нарушений [4]. Распространенность их зависит от влияния средовых факторов риска и характеризуется существенными межэтническими и межпопуляционными различиями. В настоящее время частота рождения детей с ВРГ и/или Н составляет от 1:500 до 1:1000 родившихся [1]. Краснодарский край, как самый большой в РФ по численности населения, занимает ведущее место среди других регионов по количеству детей-инвалидов (около 14000), среди которых 1,5-2 тысячи человек с врожденными пороками лица [4].
С точки зрения медицинской генетики несин-дромальные ВРГ и/или Н рассматривают как многофакторные заболевания, этиология которых включает генетические факторы, средовые влияния и генно-средовые взаимодействия [7]. Патогенетические аспекты ВРГ и/или Н и ведущие средовые факторы риска на сегодняшний день остаются предметом научных дискуссий. Предполагается, что в формировании предрасположенности к распространенным заболеваниям мультифакториального генеза, к которым относятся ВРГ и/или Н, существенное влияние принадлежит генам ферментов детоксикации ксенобиотиков, экспрессия которых зависит от средо-вых факторов [2, 3]. Степень токсического воздействия на плод является результатом сложных
генно-средовых взаимодействий, а определенные полиморфные варианты генов ФБК могут определять формирование фенотипов, которые в меньшей степени способны к детоксикации экзогенных соединений и накоплению токсичных промежуточных метаболитов [10].
^ацетилтрансферазы - ферменты 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков - ацетилируют лекарственные средства, содержащие ароматические аминные и гидразиновые группы [18]. Описано множество аллельных вариантов этих генов, включая однонуклеотидные замены, инсерции, делеции [12]. G590A полиморфизм гена ЫАТ2 -один из наиболее функционально значимых. Известно, что нуклеотидная замена 590G/A, расположенная во 2-м экзоне гена NAT2, снижает активность фермента [8]. Формирующийся при этом фенотип «медленного ацетилятора» может быть связан с повышенным риском развития врожденных пороков, в том числе ВРГ и/или Н [14]. Это предположение подтверждает факт, что ген ^ацетилтрансферазы 2 экспрессируется в тканях плода уже на ранних сроках беременности, а также в плаценте и участвует в трансформации определенных ароматических аминов в соединения, которые могут обладать тератогенным эффектом [10, 15]. Вышесказанное подтверждает актуальность исследований, направленных на поиск ассоциаций полиморфных вариантов гена NAT2 с риском развития врожденных пороков.
Целью нашего исследования стало изучение ассоциации полиморфизма G590A гена NAT2 (ге 1799930) с возникновением врождённых расщелин губы и/или нёба у проживающих в Краснодарском крае.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования послужила выборка представителей русской этнической группы, состоящая из 105 пациентов отделения лечения детей с врождённой челюстно-лицевой патологией Центра восстановительной медицины и реабилитации, а также Кубанской межрегиональной медико-генетической консультации за период 2008-2012 гг. Всем пациентам было проведено общеклиническое, клинико-генеалогическое и лабораторно-инструментальное обследование. Из исследования исключали пациентов, имеющих сочетанную патологию со стороны других органов и систем. Родители исследуемых в количестве 154 человека составили контрольную группу.
У всех пациентов проводился забор венозной крови, объёмом 5 мл. Выделение ДНК произво-
дили из размороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции на базе генетической лаборатории Курского государственного медицинского университета. Анализ полиморфизма гена NAT2 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и дискриминации аллелей с помощью TagMan зондов на амплификаторе RotorGene Q6 plex с использованием следующих локус-специфических олиго-нуклеотидных праймеров и зондов: F: 5'- ctgccaaagaagaaacaccaaaa -3' R: 5'- tggagacgtctgcaggtatgtatt -3' 5-FAM- acctcgaacaattg-RTQ 1 -3' 5' -ROX-tgaacctcaaacaatt-BHQ2-3' Параметры ПЦР: 40 циклов, температура отжига праймеров - 480С, время отжига - 30 с, заключительная элонгация 720С - 1 мин. ПЦР-диагностика проводилась на базе Кубанского медицинского университета в лаборатории «Моле-кулярно-генетических исследований».
Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборке больных и здоровых использовали критерий %2 Пирсона. Для сравнения частот аллелей и генотипов гена NAT2 между различными группами использовали критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Различия рассматривали как статистически значимые при р<0,05. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к заболеванию судили по величине отношения шансов (odds ratio, OR) с 95% доверительным интервалом (CI). Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета Statistics 6.0 (StatSoft, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Отклонения частот генотипов исследуемого полиморфного варианта от равновесия Харди-Вайнберга в основной и контрольной группах не наблюдалось (р>0,05).
Сравнительный анализ частот аллелей изучаемого полиморфизма гена NAT2 представлен в таблице 1. При сравнении частот аллелей нами не были получены статистически значимые различия между исследуемыми группами: частота аллеля A в основной группе составила 0,333, а в контрольной группе - 0,279 (%2=1,74, P=0,19). Проведенный стратифицированный анализ по полу также не показал различий между группами.
Сравнительный анализ частот генотипов полиморфизма G590A гена NAT2 представлен в таблице 2.
Таблица 1
Распределение аллелей полиморфизма G590A гена NAT2 у пациентов с врождённой расщелиной
губы и/или нёба и здоровых лиц
Ген Аллели Частоты аллелей, обобщенная группа 2 1 (Р) OR (95% CI)
Пациенты с ВРГ и/или Н (n =105) Родительский контроль (n =154)
NAT2 590G 0,667 0,721 1,74 (0,19) 1,29 (0,88-1,89)
590А 0,333 0,279
мужчины с ВРГ и/или Н (n=57), контрольная группа мужчин(п= 54 )
NAT2 590G 0,634 0,708 1,33 (0,25) 1,40 (0,79-2,47)
590А 0,366 0,292
женщины с ВРГ и/или Н (n=45), контрольная группа женщин (n=100)
NAT2 590G 0,689 0,725 0,40 (0,53) 1,19 (0,69-2,05)
590А 0,311 0,275
Таблица 2
Распределение генотипов полиморфизма G590A гена NAT2 у пациентов с врождённой расщелиной губы
и/или нёба и здоровых лиц
Ген Генотипы Частоты генотипов, обобщенная группа 2 1 (Р)2 OR (95% CI)3
Пациенты с ВРГ и/или Н (n =105) Родительский контроль (n =154)
n (%У n (%У
NAT2 590GG 49 (46,7) 78 (50,6) 0,40 (0,53) 1,17 (0,71-1,93)
590GA 42 (40,0) 66 (42,9) 0,21(0,65) 0,89 (0,54-1,47)
590АА 14 (13,3) 10 (6,5) 3,47(0,06) 2,22 (0,94-5,20)
мужчины с ВРГ и/или Н (n=57), контрольная группа мужчин(п= 54)
NAT2 590GG 23 (41,1) 28 (52,8) 1,51(0,22) 1,61 (0,75-3,43)
590GA 25 (44,6) 19 (35,8) 0,87(0,35) 1,44 (0,67-3,12)
590АА 8(14,3) 6(11,3) 0,21(0,64) 1,31 (0,42-4,05)
женщины с ВРГ и/или Н (n=45), контрольная группа женщин (n=100)
NAT2 590GG 23 (51,1) 49 (49,0) 0,06(0,81) 0,92 (0,45-1,86)
590GA 16 (35,6) 47 (47,0) 1,65(0,20) 0,62 (0,30-1,29)
590АА 6(13,3) 4 (4,0) 4,21(0,04)* 3,53(1,00-12,41)
Примечания:
1 - Абсолютное число и процент лиц с исследуемым генотипом.
2 - Хи-квадрат с коррекцией Yates' и p-значения (f=1).
3 - Отношение шансов с учетом возраста, пола с 95% доверительными интервалами.
* - Вариантные аллели представлены в нижних ячейках соответствующих ДНК-маркеров.
При сравнении частот генотипов между группами мы обнаружили тенденцию к накоплению вариантных гомозигот в группе больных ВРГ и/или Н по сравнению с родительским контролем (Р=0,06, OR=2,22, 95%CI=0,94-5,20), однако различия не достигали уровня статистически значимых. С целью анализа полового диморфизма в проявлении ассоциаций изучаемого полиморфизма с ВРГ и/или Н мы провели стратифицированный анализ по полу. Сравнительный анализ частот генотипов в группе мужчин статистически значимых различий не выявил, однако мы наблюдали значительное увеличение частоты мутант-ных гомозигот в группе больных женщин (13,3%) по сравнению с контролем (4,0%), что увеличивало риск развития ВРГ и/или Н в 3,5 раза (Р=0,04, OR=3,53, 95%CI=1,00-12,41).
Ген N-ацетилтрансферазы кодирует фермент, функцией которого является активация и дезактивация ариламина и гидразина различных ксенобиотиков (лекарств и канцерогенов). Полиморфизм этого гена влияет на реакции N-ацетилирования, которые фенотипически делят человеческую популяцию на медленных, быстрых и промежуточных ацетиляторов. Во многих работах показано, что полиморфизм этого гена ассоциирован повышенным риском развития рака и токсическим действием лекарственных препаратов [6, 19]. Так, многочисленные исследования по изучению ассоциаций полиморфизмов гена N-ацетилтрансферазы обнаружили его связь с рядом заболеваний: рак мочевого пузыря [18], толстой кишки и молочной железы [5].
Одним из направлений в области исследования фенотипических эффектов полиморфных вариантов гена NAT2 является поиск ассоциаций с риском формирования врожденных пороков развития [11, 13]. Некоторые исследования показали связь мутации в гене N-ацетилтрансферазы с риском развития таких врожденных дефектов, как spina bifida, расщелина губы и неба [11, 13], другие исследователи не обнаружили ассоциации генов NAT1 и NAT2 с риском развития ВРГ и/или Н [16]. Согласно полученным в нашем исследовании результатам, G590A полиморфизм гена NAT2 ассоциирован с риском развития ВПР челюстно-лицевой области и проявляет половой диморфизм в ассоциации с риском развития ВРГ и/или Н: у женщин носительство вариантного генотипа 590АА увеличивает риск развития ВПР.
Индивидуальные различия в темпах биотрансформации ксенобиотиков могут играть роль в индивидуальной чувствительности организма к тератогенным соединениям (лекарственным препаратам, компонентам сигаретного дыма и другим экзогенным соединениям).
N-ацетилтрансферазы, ферменты II фазы БК, выполняют важную функцию в биотрансформации главным образом экзогенных соединений: экзогенных ариламинсодержащих веществ, компонентов некоторых лекарственных препаратов, кофеина [19, 20]. Можно предположить, что в условиях медленного ацетилирования повышается токсичность метаболитов NAT2, которые могут иметь тератогенные свойства. Проведенное нами исследование демонстрирует возможную вовлеченность гена NAT2 в патогенез ВРГ и/или Н и обосновывает необходимость проведения исследований, направленных на поиск механизмов, посредством которых происходит реализация тератогенных эффектов факторов окружающей среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Демикова Н.С. Мониторинг врожденных пороков развития и его значение в изучении их эпидемиологии // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. -2003. - № 4. - С. 13-17.
2. Иванов В.П., Солодилова М.А., Полоников А.В., Панфилов В.И. Ферменты антиоксидантной системы и мультифакториальные заболевания: роль гена селен-зависимой глутатионпероксидазы в формировании предрасположенности к аллергической форме бронхиальной астмы // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». -2006. - № 4. - С. 38-44.
3. Полоников А.В., Иванов В.П., Солодилова М.А. Эколого-токсикогенетическая концепция мульти-факториальных заболеваний: от понимания этиологии до клинического применения. // Медицинская генетика. - 2008. - Т. 7, № 11. - С. 3-20.
4. Шульженко В.И., Митропанова М.Н., Чечула Н.И. Вариант изучения и анализа протоколов реабилитации детей с несращением губы и нёба, применяемых в мире // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 2. - С. 196-199.
5. Ambrosone C.B., Kropp S., Yang J., Yao S., Shields P.G., Chang-Claude J. Cigarette smoking, N-acetyltransferase 2 genotypes, and breast cancer risk: pooled analysis and meta-analysis // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2008. - Vol. 17, N 1. -P. 15-26.
6. Brockmoller J., Cascorbi I., Kerb R., Sachse C., Roots I. Polymorphism in xenobiotic conjugation and disease predisposition. // Toxicol Lett. - 1998. -Vol. 102-103. - P. 173-183.
7. Dixon M.J., Marazita M.L., Beaty T.H., Murray J.C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences // Nat Rev Genet. - 2011. -Vol. 12, N 3. - P. 167-178.
8. Grant D.M., Blum M., Demierre A., Meyer U.A. Nu-cleotide sequence of an intronless gene for a human arylamine N-acetyltransferase related to polymorphic drug acetylation // Nucleic Acids Res. - 1989. -Vol. 17, N 10. - P. 3978.
9. Grant D.M., Hughes N.C., Janezic S.A., Good-fellow G.H., Chen H.J., Gaedigk A., Yu V.L., Grewal R. Human acetyltransferase polymorphisms // Mutat Res. - 1997. - Vol. 376, N 1-2. - P. 61-70.
10. Grant D.M., Morike K., Eichelbaum M., Meyer U.A. Acetylation pharmacogenetics. The slow acetylator phenotype is caused by decreased or absent arylamine N-acetyltransferase in human liver // J Clin Invest. -1990. - Vol. 85, N 3. - P. 968-972.
11. Jensen L.E., Hoess K., Mitchell L.E., Whitehead A.S. Loss of function polymorphisms in NAT1 protect against spina bifida // Hum Genet. - 2006. - Vol. 120, N 1. - P. 52-57.
12. Hein D.W., Grant D.M., Sim E. Update on consensus arylamine N-acetyltransferase gene nomenclature // Pharmacogenetics. - 2000. - Vol. 10, N 4. -P. 291-292.
13. Lammer E.J., Shaw G.M., Iovannisci D.M., van Waes J., Finnell R.H. Maternal smoking and the risk of orofacial clefts: Susceptibility with NAT1 and NAT2 polymorphisms // Epidemiology. - 2004. - Vol. 15, N 2. - P. 150-156.
14. Lie R.T., Wilcox A.J., Taylor J., Gjes-sing H.K., Saugstad O.D., Aabyholm F., Vindenes H. Maternal smoking and oral clefts: The role of detoxification pathway genes // Epidemiology. - 2008. -Vol. 19, N 4. - P. 606-615. - doi: 10.1097/EDE.0b013e3181690731.
15. Smelt V.A., Upton A., Adjaye J., Payton M.A., Bou-kouvala S., Johnson N., Mardon H.J., Sim E. Expression of arylamine N-acetyltransferases in pre-term placentas and in human pre-implantation embryos // Hum Mol Genet. - 2000. - Vol. 9, N 7. - P. 11011107.
16. Song T., Wu D, Wang Y, Li H, Yin N., Zhao Z. Association of NAT1 and NAT2 genes with nonsyndromic cleft lip and palate // Mol Med Rep. - 2013. - Vol. 8, N 1. - P. 211-216.
17. Vatsis K.P., Weber W.W., Bell D.A., Dupret J.M., Evans D.A., Grant D.M., Hein D.W., Lin H.J., Meyer U.A., Relling M.V. Nomenclature for N-acetyltransferases // Pharmacogenetics. - 1995. -Vol. 5, N 1 - P. 1-17.
18. Rothman N., Garcia-Closas M., Hein D.W. Commentary: reflections on G. M. Lower and colleagues' 1979 study associating slow acetylator phenotype with urinary bladder cancer:meta-analysis, historical refinements of the hypothesis, and lessons learned // Int. J. Epidemiol. - 2007. - Vol. 36. - P. 23-28.
19. Weber W.W., Hein D.W. N-acetylation pharmacogenetics // Pharmacol Rev. - 1985. - Vol. 37, N 1. -P. 25-79.
20. Wormhoudt L.W., Commandeur J.N., Vermeulen N.P. Genetic polymorphisms of human N-acetyltransferase, cytochrome P450, glutathione-S-transferase, and epoxide hydrolase enzymes: relevance to xenobiotic metabolism and toxicity // Crit Rev Toxicol. - 1999. -Vol. 29, N 1. - P. 59-124.
