CC BY
48
УДК 616.12-007.2-053.1/2-07:575.113(470.620)
АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ПОЛИМОРФИЗМОВ G590A ГЕНА NAT2 И С3435Т ГЕНА ABCB1 У ДЕТЕЙ С ИЗОЛИРОВАННЫМ ДЕФЕКТОМ МЕЖЖЕЛУДОЧКОВОЙ ПЕРЕГОРОДКИ
В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ
© Брайко О.П., Лазарев К.Ю., Щвецов Я.Д.1, Голубцов В.И., Полоников А.В.1
Кафедра биологии с курсом медицинской генетики Кубанского государственного медицинского университета, Краснодар; 1 кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: brayko [email protected]
Проведен анализ полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена ABCB1 с целью выявления возможных ассоциаций с повышенным риском возникновения изолированного дефекта межжелудочковой перегородки у детей в Краснодарском крае, в результате которого не удалось выявить отчетливую тенденцию к накоплению мутантных генотипов 590GG NAT2 и 3435ТТ ABCB1 предположительно ассоциированных с данной нозологией. При изучении частот аллелей и генотипов данных полиморфизмов между группами больных ДМЖП и контролем в зависимости от пола статистически значимых различий не обнаружено. Данные анализа парных сочетаний исследуемых полиморфизмов не позволили выявить статистически значимых различий, но наблюдалась отчетливая тенденция в накоплении комбинации генотипов 590GG/3435TT в группе детей с ДМЖП (OR=4,02, 95% CI=0,94-17,5; х2 =4,08, р=0,04). В целом, в ходе проведенного исследования генотипы, ассоциированные с риском развития данной нозологии, не выявлены.
Ключевые слова: врожденный дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП), полиморфизм, маркер предрасположенности, Краснодарский край, NAT2, ABCB1.
THE ASSOCIATION ANALYSIS OF POLYMORPHISMS G590A OF THE NAT2 GENE AND С3435Т OF THE ABCB1 GENE WITH ISOLATED OF VENTRICULAR SEPTAL DEFECT IN CHILDREN
FROM KRASNODAR REGION Brayko O.P., Lazarev K.Yu., Shvetsov YaD.1, Golubtsov V.I., Polonikov A.V.1 Department of Biology with a course of Medical Genetics of Kuban State Medical University, Krasnodar;
1 Department of Biology, Medical Genetics and Ecology of Kursk State Medical University, Kursk
The associations between polymorphisms of G590A of the NAT2 gene and C3435T of the ABCB1 gene and the risk of isolated ventricular septal defect in children from Krasnodar region were studied. It failed to find out the clear trend to accumulation of 590GG NAT2 and 3435TT ABCB1 mutant genotypes, supposedly associated with this nosology. In studying the allely frequencies and genotypes of these polymorphisms, it was not revealed the statistically significant differences between groups of the patients with ventricular septal defect and control group, depending on sex. The data analysis of the pair combinations of the tested polymorphisms did not allowed to reveal the statistically significant differences, but the clear trend was observed in accumulation of 590GG/3435TT genotypes in the group of children with ventricular septal defect (OR=4.02, 95% CI=0.94-17.5, х2 =4.08, р=0.04). No associations of the polymorphisms with isolated ventricular septal defect were found. Keywords: congenital defect of interventricular septum, DNA polymorphism, association study, NAT2, ABCB1.
Изолированный дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП) имеет многофакторную природу и встречается с частотой 7,96%о среди новорожденных и 51,8% - в структуре врожденных пороков развития системы кровообращения (ВПР СК) [4]. Важную роль в формировании данной патологии играют гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), экспрессия которых зависит от модулирующего влияния средовых факторов химической природы [7, 9, 16].
В научной литературе описано несколько исследований по изучению вклада полиморфизма генов ФБК в формирование риска развития ДМЖП. Так, не было обнаружено ассоциаций полиморфизма Т264С гена CYP1A1 с развитием
ДМЖП [9]. В то же время установлено, что генотип 734С/С CYP1A2 и сочетание генотипов 734С/А CYP1A2 и 0/0 GSTT1, а также сочетание генотипов 734С/А CYP1A2 и 0/0 GSTM1 ассоциированы с повышенным риском развития ДМЖП. В то же время генотип 734А/А CYP1A2 и сочетание генотипов 734А/А CYP1A2 и 0/0 GSTT1, 734А/А CYP1A2 и 0/0 GSTM1 были ассоциированы с пониженным риском развития данного ВПР [9]. Кроме того, установлено, что генотип 3435Т/Т АВСВ1 ассоциирован с повышенным риском развития ДМЖП [17].
В рамках данного исследования изучены ассоциации полиморфных вариантов двух генов ФБК G590A NAT2 и С3435Т АВСВ1 с риском развития ДМЖП у детей Краснодарского края.
Ген NAT2 кодирует цитозольный фермент ^ацетилтрансферазу II типа, относящуюся ко второй фазе детоксикации ксенобиотиков. Ген АВСВ1 (также известен как MDR1) кодирует трансмембранный гликопротеин, осуществляющий процесс выведения чужеродных токсичных метаболитов ксенобиотиков из клеток. Аллельные варианты генов NAT2 и АВСВ1 определяют различную степень активности ферментов в биотрансформации ксенобиотиков
[1, 3, 8, 10, 12].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования - дети с ДМЖП (100 человек) славянской национальности из 44 административных образований Краснодарского края, родившиеся в период 1998-2012 гг.; средний возраст - 3,11±0,81 года (46 мальчиков -46,0% и 64 девочки - 64,0%). Группой контроля послужили родители исследуемой группы детей (156 человек). Все родители были коренными жителями Краснодарского края, не имеющие врожденных пороков развития.
Информация о пробандах и их родителях была внесена в специально созданную электронную базу для последующей систематизации и статистической обработки. Верификация диагноза ДМЖП проводилась с использованием комплексного обследования, включающего клинические методы: объективное обследование; анкетирование и специальные (ЭКГ, УЗИ, рентгенография сердца и др.), а также клинико-генеалогическое и цитогенетическое исследования.
Выделение ДНК проводилось из размороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [6]. Анализ полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена ABCB1 осуществлялся методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени с использованием для дискриминации аллелей TaqMan-зонды. ПЦР осуществляли на амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad (США). Для амплификации интересуемых участков генов NAT2 и ABCB1 использовались праймеры и зонды, синтезированные в компании Синтол (Россия). Последовательности праймеров и зондов представлены в таблице 1.
Длительность денатурации ДНК составила 5 мин. при 95оС, после чего выполняли 39 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров -1 мин. при 45оС (для полиморфизма G590A гена NAT2) и 51,3оС (для полиморфизма С3435Т гена ABCB1); денатурация - 15 сек при 95оС.
Соответствие распределения генотипов ожидаемым значениям при равновесии уравнения Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборке больных и здоровых лиц использовали критерий %2 с поправкой Йетса на непрерывность значений [2, 5, 8]. Уровень статистической значимости различий между группами принимали р<0,05. Об ассоциации аллелей и генотипов с предрасположенностью к ДМЖП судили по величине отношения шансов (OR) [14]. Границы 95% доверительного интервала (CI) для OR вычисляли методом В. Woolf [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ распределения генотипов
полиморфизма С3435Т гена ABCB1 у больных ДМЖП детей (таблица 2) показал отклонение частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга (р<0,05) за счет увеличения уровня наблюдаемой гетерозиготности. Распределение генотипов полиморфизма G590A NAT2 в группе родительского контроля (%2=0,18; d.f.=1; р>0,05) находилось в соответствии с распределением
Таблица 1
Структура праймеров и зондов
Ген Полиморфизм Структура праймеров и зондов Литература
NAT2 G590A F: 5'- ctgccaaagaagaaacaccaaaa -3' R: 5'- tggagacgtctgcaggtatgtatt -3' 5' -FAM- acctc(g-LNA)aacaattg-RTQ 1 -3' 5' -ROX-tgaacctc(a-LNA)aacaatt-BHQ2-3' [11,10,12,18]
ABCB1 C3435T F: 5'- ctgtttgactgcagcattgct -3' R: 5'- atgtatgttggcctcctttgct -3' 5'-FAM-ccctcac(a - LNA)atctctt-RTQ 1 -3' 5' -ROX-ccctcac(g-LNA)atctctt-BHQ2-3' [15,13]
Таблица 2
Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекс фиксации для полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков среди больных с ДМЖП
и родительского контроля
Локусы, показатели Больные ДМЖП Контрольная группа
EN 100 156
590АА 48 (42,90) 72 (69,33)
G590A No(Ne) 590AG 35 (45,19) 64 (69,33)
NAT2 590GG 17 (11,90) 20 (17,33)
X2(HWE)(p) 5,09 (р<0,05) 0,92 (р>0,05)
Ho (He) 0,35 (0,45) 0,41 (0,44)
D (t) -0,23 (1,96) -0,08 (0,79)
EN 100 155
3435СС 28 (25,50) 42(44,16)
С3435Т ABCB1 No(Ne) 3435СТ 45 (49,99) 82(77,68)
3435ТТ 26 (24,50) 32(34,16)
X2(HWE)(P) 1,00 (р>0,05) 0,48 (р>0,05)
Ho (He) 0,45 (0,50) 0,53 (0,50)
D (t) -0,10 (1,00) +0,06(0,69)
Примечание: - объем выборки; N - наблюдаемое распределение фенотипов; N. - ожидаемое распределение фенотипов; %2(отЕ) - показатель соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга; р - достигнутый уровень значимости для %2 (нге) ; Н0 - наблюдаемая гетерозиготность; Не - ожидаемая гетерозиготность; D - индекс фиксации Райта; t - критерий Стьюдента, характеризующий индекс фиксации.
Таблица 3
Частоты аллелей полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена АВСВ1 в группах больных ДМЖП и здоровых индивидов, %
Исследуемая группа G590A NAT2 C3435T ABCB1
590 А 590 G 3435С 3435Т
Больные ДМЖП (п=100) 65,5 34,5 50,5 49,5
Контроль(п=156) 66,8 33,2 54,3 45,7
X2 (р) =1 0,1 (0,74) 0,81 (0,37)
Харди-Вайнберга. Уровень аллельного разнообразия по изученным локусам составил Н0=0,35 (для G590A ШТ2) и Н0 =0,45 (для С3435Т гена АВСВ1) среди индивидуумов с ДМЖП и Н0=0,41 (для локуса G590 гена ШТ2), Н0 =0,53 (для локуса С3435Т гена АВСВ1) в выборке родительского контроля. Распределение генотипов С3435Т АВСВ1, как у индивидов с ДМЖП (х2=1,00; ¿£=1; р>0,05), так и в контрольной группе (х2=0,48; d.f.=1; р>0,05) соответствовали ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга.
Частоты аллелей полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена АВСВ1 в группах больных ДМЖП и их родителей представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, статистически значимых различий в частотах аллелей полиморфизмов G590A гена ШТ2 и С3435Т гена АВСВ1 между группами больных ДМЖП и контроля не установлено (р>0,05).
При сравнительном анализе частот генотипов (таблица 4) исследуемых полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена АВСВ1 между группами больных ДМЖП и родительского контроля также не было установлено статистически значимых различий (р>0,05). Частоты вариантных генотипов 590GG ШТ2 (17,0%) и 3435ТТ АВСВ1 (27,0%) в группе больных ДМЖП оказались несколько выше, чем в контрольной группе (11,6%) и (19,8%) соответственно.
В таблице 5 и 6 представлен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов изучаемых полиморфизмов, проводившийся в группах: девочки сравнивались с матерями, мальчики с отцами. Стратифицированный анализ по полу частот исследуемых полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена АВСВ1 не позволил выявить протективную значимость ассоциаций с риском развития ДМЖП в зависимости от пола (таблица 5 и 6).
Таблица 4
Частоты генотипов полиморфизмов G590A гена NAT2 и C3435T гена ABCB1 между группами больных ДМЖП и здоровых индивидов (абс., %)
Исследуемая группа G590A NAT2 С3435Т ABCB1
590 АА 590 АG 590 GG 3435GG 3435GA 3435АА
Больные ДМЖП (п=100) 48 (48,0) 35 (35,0) 17 (17,0) 28 (28,0) 45 (45,0) 27 (27,0)
Контроль (п=232) 105 (45,3) 100 (43,1) 27 (11,6) 64 (27,6) 122 (52,6) 46 (19,8)
X2 (р) =1 0,21 (0,65) 1,90 (0,17) 1,75(0,19) 0,01(0,94) 1,61(0,20) 2,10 (0,15)
Таблица 5
Распределение частот аллелей полиморфных генов ФБК у больных ДМЖП и здоровых в зависимости от пола
Ген Аллели Частоты аллелей р
Больные ДМЖП Контрольная группа ДМЖП
Девочки (п=61) (п=103 - матери)
G590A 590 А 0,631 0,689 0,28
NAT2 590 G 0,369 0,311
С3435Т АВСВ1 3435С 0,492 0,515 0,69
3435Т 0,508 0,485
Мальчики (п=41) (п=53 - отцы)
G590A 590 А 0,631 0,623 0,89
NAT2 590 G 0,369 0,377
С3435Т АВСВ1 3435С 0,512 0,545 0,65
3435Т 0,488 0,455
Таблица 6
Распределение частот генотипов полиморфизмов G590A гена NAT2, С3435Т гена АВСВ1 между группами больных ДМЖП и здоровых индивидов абс., %, в зависимости от пола
Полиморфизм Аллели Частоты генотипов х2 (р) ДМЖП
Больные ДМЖП (п=100) Здоровые
Девочки (п=61) (п=103 - матери)
G590A NAT2 590 АА 29 (47,5) 53 (51,5) 0,23 (0,63)
590АG 19 (31,2) 36 (35,0) 0,25 (0,62)
590GG 13 (21,3) 14 (13,4) 1,66 (0,20)
С3435Т АВСВ1 3435СС 15(25,4) 26 (25,3) 0,001 (0,97)
3435СТ 29 (47,6) 54 (52,4) 0,25 (0,61)
3435ТТ 16 (27,0) 23 (22,3) 0,39 (0,53)
Мальчики п=40 (п=53 - отцы)
G590A NAT2 590 AA 20 (50,0) 19 (35,8) 1,86 (0,17)
590AG 17 (42,5) 28 (52,8) 0,97 (0,32)
590GG 3 (7,5) 6 (11,4) 0,38 (0,54)
С3435Т АВСВ1 3435СС 13 (30,0) 16 (30,2) 0,08 (0,78)
3435СТ 16 (40,0) 28 (49,8) 1,34 (0,25)
3435ТТ 12 (30,0) 11 (20,0) 1,11 (0,29)
Таблица 7
Распределение частот комбинаций генотипов генов G590A NAT2 и С3435Т АВСВ1 в группах больных
ДМЖП и здоровых индивидов абс, %
Комбинации генотипов Частоты комбинаций генотипов Критерий различия х2 (р) OR (95% CI)
Больные ДМЖП (n=100) Контрольная группа (n=232)
NAT2 590 АА/ ABCB1 3435СС 15 (15,0) 21 (9,1) 2,56 (0,11) 1,77 (0,87-3,60)
NAT2 590 АА/ ABCB1 3435СТ 19 (19,0) 59 (25,4) 1,61 (0,20) 0,69 (0,38-1,23)
NAT2 590 АА/ ABCB1 3435СС 14 (14,0) 26 (11,2) 0,51 (0,47) 1,29 (0,64-2,59)
NAT2 590 АО/ ABCB1 3435ТТ 10 (10,0) 35 (15,1) 1,54 (0,21) 0,63 (0,30-1,32)
NAT2 590 АО/ ABCB1 3435СТ 18 (18,0) 49 (21,1) 0,42 (0,52) 0,82 (0,45-1,49)
NAT2 590А0/ ABCB1 3435СС 8 (8,0) 16 (6,9) 0,13 (0,72) 1,17 (0,49-2,84)
NAT2 590 ОО/ ABCB1 3435СС 4 (4,0) 7 (3,0) 0,21 (0,65) 1,34 (0,38-4,68)
NAT2 590 ОО/ ABCB1 3435СТ 7 (7,0) 16 (6,9) 0,001 (0,97) 1,02 (0,40-2,55)
NAT2 590 ОО/ ABCB1 3435ТТ 5 (5,0) 3 (1,3) 4,08 (0,04) 4,02 (0,94-17,5)
Данные анализа парных сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов приведены в таблице 7. Статистически значимых различий в частотах комбинаций генотипов обнаружено не было. Однако наблюдалась отчетливая тенденция в накоплении комбинации генотипов 590GG/3435ТТ в группе больных детей ДМЖП (X2 =4,08, р=0,04; OR=4,02, 95% С1=0,94-17,5).
В рамках проведенного исследования на этнически гомогенной выборке детей славянской национальности Краснодарского края впервые изучена связь двух распространенных полиморфизмов G590A гена NAT2, С3435Т гена АВСВ1 с предрасположенностью к ДМЖП, в результате которого не удалось выявить отчетливую тенденцию к накоплению мутантных генотипов 590GG ШТ2 и 3435ТТ АВСВ1 предположительно ассоциированных с данной нозологией. При изучении частот аллелей и генотипов полиморфизмов G590A гена NAT2 и С3435Т гена АВСВ1 между группами больных ДМЖП и контроля в зависимости от пола статистически значимых различий не обнаружено. Данные анализа парных сочетаний исследуемых полиморфизмов не позволили выявить статистически значимых различий, но наблюдалась отчетливая тенденция в накоплении комбинации генотипов 590GG/3435ТТ в группе больных детей ДМЖП ДО=4,02, 95%
CI=0,94-17,5; х2 =4,08, р=0,04), что в принципе согласуется с результатами полученными Chuan Wang с соавт: риск развития врожденных пороков системы кровообращения у детей ассоциирован с генотипом 3435TT ABCB1 (OR= 3,5, 95% CI=1,5-7,9, р=0,003), в том числе и ДМЖП (OR=4,4, 95% CI=1,8-10,9, р=0,001) [17].
По всей видимости, исследованные полиморфизмы G590A гена NAT2 и С3435Т гена ABCB1 не оказывают существенного влияния на риск развития ДМЖП у детей Краснодарского края. Принимая во внимание возможность генетической гетерогенности изолированного врожденного ДМЖП, представляется
целесообразным дальнейшее исследование роли других полиморфных вариантов генов ФБК в развитии данного порока.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов В.С., Асеев М.В., Баранова Е.В. Гены предрасположенности и генетический паспорт // Природа. - 1999. - № 3. - С. 17-37.
2. Вейр Б. Анализ генетических данных. Дискретные генетические признаки. - М. : Мир, 1995. -С. 85-104.
3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия // Taschenatlas der Biochemie. - М. : Мир, 2000. -470 с.
4. Лазарев К.Ю., Голубцов В.И., Полоников А.В., Брайко О.П., Панкова Е.Е., Матулевич С.А. Анализ структуры и распространенности изолированных врожденных пороков развития системы кровообращения среди новорожденных Краснодарского края (по результатам мониторинга 1998-2009 гг.). // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 2. - С. 95-100.
5. Лванга С.К., Чжо-Ек Тыэ. Обучение медицинской статистике: Двадцать конспектов лекций и семинаров. ВОЗ. - М. : Медицина, 1989 . - 216 с.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М. : Мир, 1984. - 480 с.
7. Полоников А.В., Иванов В.П., Солодилова М.А. Эколого-токсикогенетическая концепция мульти-факториальных заболеваний: от понимания этиологии до клинического применения // Медицинская генетика - 2008. - № 11. - С. 3-19.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М. : Медиа Сфера, 2002. - 312 с.
9. Шабалдин А.В., Глушкова О.А., Макарченко О.С., Симонова Т.А., Крюков П.М., Глушков А.Н., Филипенко М.Л., Казакова Л.М. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков у женщин, родивших детей с врожденными пороками развития // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. - 2007. - Т. 86, № 1. - С. 15-19.
10. Gross M., Kruisselbrink T., Anderson K., Lang N., McGovern P., Delongchamp R., Kadlubar F. Distribution and concordance of N-acetyltransferase genotype and phenotype in an American population // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 1999.- Vol. 8, N. 8. - P.683-692.
11. Hein D.W., Doll M.A. Accuracy of various human NAT2 SNP genotyping panels to infer rapid, intermediate and slow acetylator phenotypes. // Pharmacogenomies. - 2012. - Vol. 13, N 1. -P. 31-41.
12. Hein D.W., Doll M.A., Fretland A.J., Leff MA., Webb S.J., Xiao G.H., Devanaboyina U.S., Nangju N.A., Feng Y. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 2000. - Vol. 9, N 1. - P. 29-42.
13. Op den Buijsch R.A., Christiaans M.H., Stolk L.M., de Vries J.E., Cheung C.Y., Undre N.A., van Hooff J.P., van Dieijen-Visser M.P., Bekers O. Tacrolimus pharmacokinetics and pharmacogenetics: influence of adenosine triphosphate-binding cassette B1 (ABCB1) and cytochrome (CYP) 3A polymorphisms. // Fundam Clin Pharmacol. - 2007. - Vol. 21, N 4. - P. 427-435.
14. Pearce N. What does the odds ratio estimate in a case-control study? // International Journal of Epidemiology. - 1993. - Vol. 22, N 6. - P.1189-1192.
15. Provenzani A., Notarbartolo M., Labbozzetta M., Poma P., Biondi F., Sanguedolce R., Vizzini G., Palazzo U., Polidori P., Triolo F., Gridelli B., D'Alessandro N. The effect of CYP3A5 and ABCB1 single nucleotide polymorphisms on tacrolimus dose requirements in Caucasian liver transplant patients. // Ann transplant. - 2009. - Vol. 14, N 1. - P. 23-31.
16. Puga A. Perspectives on the potential involvement of the AH receptor-dioxin axis in cardiovascular disease // Toxicological sciences. - 2011. - Vol. 120, N 2. - P. 256-261.
17. Wang C., Xie L., Zhou K., Zhan Y., Li Y., Li H., Qiao L., Wang F., Hua Y. Increased risk for congenital heart defects in children carrying the ABCB1 Gene C3435T polymorphism and maternal periconceptional toxicants exposure // PLoS One . -2013. - Vol. 8, N 7. - e68807. - doi: 10.1371/journal.pone.0068807.
18. Zschieschang P., Hiepe F., Gromnica-Ihle E., Roots I., Cascorbi I. Lack of association between arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) polymorphism and systemic lupus erythematosus. // Pharmacogenetics. -2002. - Vol. 12, N 7. - P. 559-563.
