CC BY
91
ГЕНЕТИКА
УДК 616.12- 667.2 - 653.1/2 - 67:575.1131476.626)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМОВ ЇДИ 321Е0 ГЕНА СУРМІ, С590А ГЕНА ИАТ2 И С3435Т ГЕНА АВСВ1У ДЕТЕЙ С ИЗОЛИРОВАННЫМ ДЕФЕКТОМ ПРЕДСЕРДНОЙ ПЕРЕГОРОДКИ В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ
В статье изучена ассоциация полиморфизмов УаІ4,‘)2І,еи гена СУРіВ, 059<эА гена ЫАТ2 и С3435Т гена АІЗС'ІЗ І (МІЖ і) с предрасположенностью к дефекту предсердной перегородки у детей в Краснодарском крае. Установлены прогностически неблагоприятные сочетания генотипов
СУРіВі43200/тТ2590ІІ, СУРіВі43200/АВСВі343500 и
N ЛТ2 Г) 9 011 / Л В СІ! 13 4 3 Г) ЛЛ, для которых выявлены статистически значимые ассоциации с риском развития изолированного дефекта предсердной перегородки у детей.
Ключевые слова: врожденный дефект предсердной
перегородки, ДНК-полиморфизм, наследственная
предрасположенность, Краснодарский край, УаІ432І,еи СУРіВі, 0590А ЫАТ2, С3435Т АВСВі(МБИі).
К.Ю. ЛАЗАРЕВ1 О.П. БРАЙКО1 В.И. ГОЛУБЦОВ1 Я.Д. ЩВЕЦОВ2 А.В. П0Л0НИК0В2
1} Кубанский государственный медицинский университет
s)Курский государственный медицинский университет
e-mail: [email protected]
Дефект предсердной перегородки (ДПП) - занимает одно из лидирующих мест в структуре врожденных пороков развития системы кровообращения (ВПР СК) в Краснодарском крае (16,7%) с частотой среди новорожденных у,дб%о и имеет мультифакториальный генез [1]. Известны различные полиморфные гены, вовлеченные в формирование предрасположенности к мультифакториальной патологии, одними из которых являются гены ферментов детоксикации ксенобиотиков. Данная система генов биотрансформации ксенобиотиков представляют собой значительный интерес для исследований этиологии и патогенеза различных мультифакториальных заболеваний у человека [2].
В рамках настоящей работы нами изучены полиморфизмы трех генов системы детоксикации: СУР1В1 - фермент первой фазы, относящийся к группе семейства цитохромов Р450 [3], МАТ-2 - цитозольный фермент второй фазы, ]Ч-ацетилтрансфераза-2 и АВСВ1 (МЭЯт) - фермент третьей фазы, участвующий в экскреции из клеток организма различных классов ксенобиотиков. Аллельные варианты указанных генов характеризуются различной активностью или экспрессией ферментов, от которых зависит эффективность детоксикации чужеродных химических веществ, что может играть важную роль в этиопатогенезе различных заболеваний.
Настоящее исследование было проведено с целью изучения ассоциаций полиморфизмов Уа1432Ьеи гена СУР1В1, С,59<эА гена ЫАТ2 и С3435Т гена АВСВ1 с с риском развития ДПП у детей Краснодарского края.
Материалы и методы. Объектом исследования явились дети с ДПП (45 человек), родившиеся в 1998-2012ГГ., из 44 административных образований Краснодарского края. Средний возраст детей с ДПП составил з,ю±ОД4 лет (13 мальчиков - 27% и 32 девочки - 73%). Группой контроля (232 человека) явились родители детей, не имеющие врожденных пороков развития, славянской национальности, уроженцев Краснодарского края.
У всех пробандов диагноз был верифицирован комплексом дополнительных методов обследования, включающих клинические методы с использованием физикального обследования, анкетирования, и специальные (ЭКГ, УЗИ, рентгенографии сердца и др.), а также клинико-генеалогического, цитогенетического методов исследования.
Экстракция ДНК из замороженной крови проведена фенольно-хлороформным методом. Генотипирование полиморфизмов проводили методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с использованием TaqMan-зондов на приборе CFX96 Bio-Rad. По окончании денатурации (5 мин. при 95°С) выполняли 39 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин. при 48°С (для полиморфизма Val432beu гена CYP1B1), 45 °С (для полиморфизма G590A гена NAT2) и 51,3°С (для полиморфизма С3435Т гена ABCBi; денатурация - 15 сек при 95°С (последовательности праймеров и зондов представлены в таблице l).
Таблица 1
Использованные праймеры и зонды (Синтол, Россия)
Ген Полимор- физм Структура праймеров и зондов Литература
CYPlBl Val4;j2l,eu F: 5’- tgt саа сса gtg gtc tgt gaa tc -3’ R: 5’- tea ctc tgc tgg tea ggt cct t -3’ 5’-FAM-accca(g-LNA)tgaagtgg-RTQl-3’ 5’-ROX-atgaccca(c-LNA)tgaagtg-BHQ2-3’ [6]
NAT2 G590A F: 5’- ctgccaaagaagaaacaccaaaa -3’ R: 5’- tggagacgtctgcaggtatgtatt -3’ 5’-FAM- acctc(g-LNA)aacaattg-RTQl-3’ 5’-ROX-tgaacctc(a-LNA)aaeaatt-BHQ2-3’ [5]
ABCBl (MDRl) С3435Т F: 5’- ctgtttgactgcagcattgct -3’ R: 5’- atgtatgttggcctcctttgct -3’ 5’-FAM-ccctcac(a - LNA)atctctt-RTQl-3’ 5’-ROX-ccctcac(g-LNA)atctctt-BHQ2-3’ [4,7]
Соответствие распределения генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных и здоровых лиц использовали критерий х2- Уровень статистической значимости различий между группами принимали р<0,05. Об ассоциации аллелей и генотипов с предрасположенностью к ДПП судили по величине отношения шансов (OR). Границы 95%-го доверительного интервала (CI) для OR вычисляли методом В. Woolf.
Обсуждение результатов. Анализ распределения генотипов изучаемых полиморфных генов Val432beu CYP1B1, G590A NAT2 и С3435Т ABCBi(MDRi) показал, что распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (р>0,05). Уровень аллельного разнообразия по данным локусам составил Н0 =0,42 (для локуса Val432be и CYP1B1), Н0=о,42 (для локуса G590A NAT2), Н0=о,5б (для локуса С3435Т ABCBi(MDRi)) среди индивидуумов с ДПП и Н0 =0,49 (для локуса Val432beu CYP1B1),
Н0=о,43 (для локуса G590A NAT2), Н0=о,53 (для локуса С3435Т ABCBi(MDRi)) в популяционной выборке. Распределение генотипов Val432beu CYP1B1, как у индивидов с ДПП (X2=i,09; d.f.=i; р>0,05), так и в контрольной группе (х2=0ДЗ; d.f.=i; р>0,05) соответствовали ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга, распределение генотипов G590A NAT2 (Х2=одз; d.f.=i; р<0,05) и С3435Т ABCBi(MDRi) (x2=i,28; d.f.=i; р<0,05) у детей с ДПП соответствовало ожидаемым частотам по сравнению с родительским контролем (x2=o,i8; d.f.=i; р>0,05) и (х2=о,78; d.f.=i; р>0,05) (табл. 2).
В табл. з представлены частоты аллелей полиморфизмов Val432beu гена CYP1B1, G590A гена NAT2 и С3435Т ABCBi(MDRi) в группах больных ДПП и их родителей. Установлено статистически значимое различие в частотах аллелей полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 между группой больных ДПП и контроля (х2=3,77; р=о,05; OR=i,s6, 95%С1=0,99-2,4б).
Таблица 2
Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекс фиксации айта для генов системы детоксикации ксенобиотиков
в исследованных группах
Локусы, показатели Больные ДПП Контрольная группа
Уа1432Ьеи СУР1В1 EN 45 232
N„(N,0 432АА 13 (11,25) 85(86,30)
432АО 19 (22,50) 113 (1Ю,39)
43200 13 (11,25) 34 (35,30)
X2(HWE)(p) 1,09 (>0,05) 0,13 (>0,05)
Но (Не) 0,42 (0,50) 0,49 (0,48)
о а) -0,16 (1,05) +0,02 (0,33)
С590А ЫАТ2 ZN 45 232
КГо№) 59011 19 (18,05) 105 (Ю3,5б)
590Ю 19 (20,90) юо (102,89)
59000 7(6,05) 2 7 (25,56)
X2(HWE)(p) 0,13 (>0,05) 0,18 (>0,05)
Но (Не) 0,42 (0,46) 0,43 (0,44)
о а) -0,09 (о,54) -0,03 (0,35)
С3435Т АВСВ1 ZN 45 232
КГо№) 343500 15 (16,81) 64(67,35)
34350А 25 (21,39) 122(115,30)
3435АА 5 (6,81) 46(49,35)
Х2(н\уе)(р) 1,28 (>0,05) 0,78(>0,05)
Но (Не) 0,56 (0,48) о,53 (0,50)
о а) +0,17 (1,03) +0,06(0,87)
Примечание: - объем выборки; N0 - наблюдаемое распределение фенотипов; - ожидаемое
распределение фенотипов; х2(™е) - показатель соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга; р - достигнутый уровень значимости для х2 <™е) ; Н0 -наблюдаемая гетерозиготность; Не - ожидаемая гетерозиготность; Б - индекс фиксации Райта; 1 -критерий Стьюдента, характеризующий индекс фиксации
Таблица 3
Распределение частот аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков в группах больных ДПП и их родителей (%)
Исследуемая группа Уа1432Ьеи СУР1В1 0590А гена ЫАТ2 С3435Т АВСВ1
432А 4320 590 1 590 0 34350 3435А
Больные ДПП (11=45) 50,0 50,0 63,3 36,7 61,1 38,9
Контрольная группа (п—232) 61,0 39,0 66,8 33,2 54,3 45,7
X2 (р) с1.Г.= 1 3,77 (0,05) 0,41 (0,52) 1,41 (0,23)
Сравнительный анализ частот генотипов исследуемых полиморфизмов между группами больных ДПП и контроля установил статистически значимое различие в распределении генотипов полиморфизма Уа1432Ьеи гена СУРтЕП (х2=5,42; р=0,02; СЖ=2,37, 95%С1=1ДЗ-4,9б) (табл. 4).
Данные анализа парных сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов приведены в табл. 5. Установлено, что в качестве прогностически неблагоприятных комбинаций следует отметить варианты 43260/59011, для которых выявлены статистически значимые различия ЫАТ2 между группами больных ДПП и контроля в частотах генотипов полиморфизма Уа1432Ьеи СУР1В1 и полиморфизма 6590А гена (х2 =5,64, р=0,02; (Ж=2,92, 95%С1=1Д7-7,31), а
также С¥Р1В143200/АВСВ1343500 (х2=4, 83, р=о,оз;(Ж=з, 09,95%С1=1,08-8,84), и
МАТ2590П/АВСВ13435АА(х2=5Дб,р=0,02;(Ж=0,13,95%С1=0,02-1,01).
Таблица 4
Распределение частот генотипов полиморфизмов УаЦзгЬеи гена СУР1В1, С.590А гена NAT2 и С3435Т гена АВСВ1 (МБК1) между группами больных ДПП
и здоровых индивидов (абс., %)
Исследуем Уа1432Ьеи СУР1В1 0590АЫАТ2 С3435Т АВСВ1 (М1Ж1)
ая группа 432АА 43 2 АО 43200 590 II 590 Ю 590 ОО 343500 34350А 3435АА
Больные 13 19 13 19 19 7 15 25 5
ДПП (11=45) (28,9) (42,2) (28,9) (42,2) (42,2) (15,6) (33,3) (55,6) (п,1)
Здоровые 85 ИЗ 34 105 100 27 64 122 46
(11=232) (36,6) (48,7) (14,7) (45,3) (43Д) (п,6) (27,6) (52,6) (19,8)
х2(р) 0,99 0,64 5,42 0,14 0,01 0,54 0,61 0,13 1,91
а.£ =1 (0,32) (0,43) (0,02) (0,71) (0,91) (0,46) (о,43) (0,71) (0,17)
Таким образом, при изучении полиморфного варианта 432СС полиморфизма Уа1432Ьеи гена С¥Р1В1 установлено статистически значимое различие в частотах аллелей и генотипов между группами больных ДПП и контроля (х2=5,42; р=0,02; (Ж=2,37, 95%С1=1ДЗ-4,9б). В то же время полиморфные варианты С,59<эА ЫАТ2 и С3435Т АВСВ1 не показали статистически значимых различий между группами по частотам аллелей и генотипов трех исследованных локусов. Однако полученные данные по изучению сочетаний генотипов системы детоксикации ксенобиотиков показали, что варианты СТР1В1432СС/МАТ2,59оП),
С\'Р1В1432СС/АВСВ13435СС и МАТ259о11/АВСВ13435АА являются вероятными прогностическими маркерами для выявления предрасположенности к врожденному изолированному ДПП. По всей видимости, указанные сочетания генов ферментов детоксикации вносят определенный вклад роль в нарушения процессов обезвреживания чужеродных химических веществ, метаболизируемых данными ферментами, что может иметь важное значение для развития данной формы порока сердца. Учитывая сложность патогенеза изучаемой нозологии необходимо продолжить поиск молекулярно-генетических маркеров и комбинаций генотипов предрасположенности к развитию врожденного изолированного ДПП.
Таблица 5
Распределение частот комбинаций генотипов генов системы детоксикации ксенобиотиков в группах больных ДПП и здоровых индивидов абс, %
Комбинации генотипов Частоты комбинаций генотипов Критерий ОИ
Больные ДПП (п=45) Контрольная группа (11=232) различия х2(р) (95% С1)
С\Т|В1432ЛЛ/МЛТ2 590 11 4(8,9) 37 (15,9) 1,49 (0,22) 0,51 (0,17-1,52)
С\Т|В1432ЛЛ/МЛТ2 590 Ю 6 (13,3) 36 (15,5) 0,14 (0,71) 0,84 (0,33-2,12)
СТР1В1432АА/тТ2 590 ОО 3 (6,7) 13 (5,6) 0,08 (0,78) 1,20 (0,33-4,41)
С\Т 1В 1432ЛО/^\Т2 590 11 8 (17,8) 53 (22,8) 0,56 (0,45) 0,73 (0,32-1,66)
С\ТП!1432ЛО/МЛТ2 590 Ю 9 (20,0) 49(21Д) 0,03 (0,87) о,93 (0,42-2,07)
С\ТП!1432ЛО/МЛТ2 59000 2 (4,4) и (4,7) 0,01 (0,93) о,93 (0,20-4,37)
СУР1В143200/тТ2 590 11 8 (17,8) 16(6,9) 5,64 (0,02) 2,92 (1,17-7,31)
СУР1В143200/МАТ2 590 Ю 4 (8,9) 13 (5,6) 0,71 (0,40) 1,64 (0,51-5,29)
СУР1В143200/МАТ2 590 ОО 1 (2,2) 4 (1,7) 0,05 (0,82) 1,30 (0,14-11,87)
СУР1В1432АА/АВСВ1343500 3 (6,7) 2 7 (11,6) 0,96 (0,33) о,54 (0,16-1,87)
CYP1B1432AA/ ABCBl 3435GA 7(15,6) 38 (16,4) 0,02 (0,89) 0,94 (0,39-2,26)
CYP1B1432AA/ ABCBl 3435AA 2 (4,4) 19 (8,19) 0,75 (0,39) 0,52 (0,12-2,32)
CYP1B1432AG/ABCB1 3435GG 6 (13,3) 25 (10,8) 0,25 (0,62) 1,27 (0,49-3,31)
CYP1B1432AG/ABCB1 3435GA 12 (26,7) 66 (28,4) 0,06 (0,81) 0,91 (0,45-1,88)
CYP1B1432AG/ABCB1 3435AA 2 (4,4) 21 (9,1) 1,05 (0,31) 0,47 (0,11-2,07)
CYP1B1432GG/ABCB1 3435GG 6 (13,3) 11 (4,7) 4,83 (0,03) 3,09 (1,08-8,84)
CYP1B1432GG/ ABCBl 3435GA 6 (13,3) 21 (9,1) 0,79 (0,38) 1,55 (0,59-4,08)
CYP1B1432GG/ABCB1 3435AA 1 (2,2) 4 (1,7) 0,05 (0,82) 1,30 (0,14-11,87)
NAT2 590 II/ABCBl 3435GG 8 (17,8) 21 (9,1) 0,54 (0,46) 1,38 (0,58-3,26)
NAT2 590 II/ABCBl 3435GA 8 (17,8) 59 (25,4) 0,24 (0,62) 0,81 (0,35-1,87)
NAT2 590 II/ABCBl 3435AA 1 (2,2) 26 (11,2) 5,16 (0,02) 0,13 (0,02-1,01)
NAT2 590 IG/ABCBl 3435GG 6 (13,3) 35 (15,1) 0,002 (0,96) 1,02 (0,40-2,63)
NAT2 590 IG/ ABCBl 3435GA 11 (24,4) 49 (21,1) 0,26 (0,61) 1,22 (0,57-2,59)
NAT2 590Ю/ ABCBl 3435AA 3 (6,7) 16 (6,9) 0,04 (0,85) 0,88 (0,25-3,17)
NAT2 590 GG/ ABCBl 3435GG 1 (2,2) 7 (3,0) 0,02 (0,88) 1Д9 (0,13-10,93)
NAT2 590 GG/ ABCBl 3435GA 6 (13,3) 16 (6,9) 2,41 (0,12) 2,20 (0,80-6,07)
NAT2 590 GG/ ABCBl 3435AA 1 (2,2) 3 (1,3) 0,54 (0,46) 2,41 (0,21-27,16)
Литература
1.Лазарев К.Ю., Голубцов В.И., Полоников А.В., Брайко О.П., Панкова Е.Е., Матулевич С.А. Анализ структуры и распространенности изолированных врожденных пороков развития системы кровообращения среди новорожденных Краснодарского края (по результатам мониторинга 1998-2009ГГ). // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - №2(125). - С.95-ЮО.
2. Полоников А.В., Иванов В.П., Солодилова М.А. Эколого-токсикогенетическая концепция мультифакториальных заболеваний: от понимания этиологии до клинического применения. // Медицинская генетика - 2008. №11. - С.3-19.
3. Пономаренко Т.С., Сычев Д.А., Чикало А.О., Бердникова Н.Г., Кукес В.Г. Система цитохрома Р450 в легких: роль в патогенезе заболеваний и фармакокинетике лекарственных средств // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2012. - №1. С. 25-28.
4. Alessio Provenzani, Monica Notarbartolo, Manuela Labbozzetta, Paola Poma, Fillipo Biondi, Rosario Sanguedolce, Giovani Vizzini, Ugo Palazzo, Piera Polidori, Fabio Triolo, Bruno Gridelli, Natale D'Alessanoro The effect of CYP3A5 and ABCBl single nucleotide polymorphisms on tacrolimus dose requirements in Caucasian liver transplant patients. // Ann transplant. - 2009. - Vol. 14(1). - P. 23-31.
5. David W. Hein, Mark ADoll. Accuracy of various human NAT2 SNP genotyping panels to infer rapid, intermediate and slow acetylator phenotypes. // Pharmacogenomies. - 2012. - Vol. - 13(1). - P. 31-41.
6. Gehan A, El-Shennawy, Abd-Alla A. Elbialy, Anwar E. Isamil, Manal M. Elbehery. Is Genetic Polymorphism of ESRl, CyPlAl and CYPlBl Risk Factor for Development of Uterine Leiomyoma? // Egyptian Journal of Medical Microbiology. - 2010. - Vol. - 19 (l). - P. 19-26.
7.Robert AM. Op den Buijsch, Maarten H.L. Christiaans, Leo M.L. Stolk, Johan E. De Vries, Chi Yuen Cheung, Nas A. Undre, Johannes P. Van Hooff, Marja P. Van Dieijen-Visser, Otto Bekers. Tacrolimus pharmacokinetics and pharmacogenetics: influence of adenosine triphosphate-binding cassette Bl (ABCBl) and cytochrome (CYP) 3A polymorphisms // Fundamental & Clinical Pharmacology. - 2007. - Vol. 21(4) -P- 427-435-
Ц1Щ
THE MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF POLYMORPHISMS Val432Leu GENE CYP1B1, G590A GENE NAT2 AND C3435T GENE ABCBKMDR11 IN CHILDREN WITH THE ISOLATED ATRIAL DEFECT IN KRASNODAR REGION
K.U. LAZAREV1 O.P. BRAYKO1 V.I. GOLURCOV1 Y.R.SHVETSOV2 A.V. P0L0NIK0V2
^ Kuban States Medical University
The associations of polymorphisms Val432Leu of the CYPlBl gene, G590A of the NAT2 gene and C3435T of the ABCBl gene with atrial defect in children from Krasnodar region were studied. It is established that as the genotype combinations CYPlBl432GG/NAT2590lI,CYPlBl432GG/ABCBl3435GG and NAT2590II/ABCB13435AA were found to be associated with the risk of the disease.
-> Kursk States Medical University e-mail: [email protected]
Keywords: congenital atrial septal defect, DNA
polymorphism, Krasnodar region, children, Val432Leu CYPlBl, G590ANAT2, C3435T ABCBl(MDRl).
