CC BY
128
УДК 577.21:616.1
ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗИ ПОЛИМОРФИЗМА VAL432LEU ГЕНА CYP1B1 C РАЗВИТИЕМ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ В ПОПУЛЯЦИИ РУССКИХ ЖИТЕЛЕЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ
© Булгакова И.В., Бушуева О.Ю., Швецов А.Д., Солодилова М.А., Биличенко М.В., Молашенко Н.В., Чернышёва О.И., Звягина М.В., Жердев Н.И., Жердева Н.М., Рыжков Н.С., Кущев Д.В.,
Иванов В.П., Полоников А.В.
Кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: irochka07@inbox. ru
Целью исследования было изучение ассоциации полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 с предрасположенностью к гипертонической болезни (ГБ) в популяции русских жителей Центрально-Черноземного региона России. Генотипи-рование полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов у 560 больных ГБ и 480 здоровых добровольцев. Статистический анализ показал отсутствие различий в частотах аллелей и генотипов полиморфизма Val432Leu гена CYP1B между группами здоровых и больных ГБ. По всей видимости, исследованный полиморфизм не вносит вклада в предрасположенность к ГБ у русских жителей Центрального Черноземья.
Ключевые слова: гипертоническая болезнь, цитохром P450 1B1, биотрансформация, генетический полиморфизм.
ASSOCIATION STUDY OF VAL432LEU POLYMORPHISM OF THE CYP1B1 GENE WITH THE RISK OF ESSENTIAL HYPERTENSION IN A POPULATION OF CENTRAL RUSSIA Bulgakova I. V., Bushueva O. Yu., Shvetsov Ya.D., Solodilova M.A., Bilichenko M. V., Molashenko N. V., Chernyshova O.I., Zvaygina M. V., Zherdev N.I., Zherdeva N.M., Ryzhkov N.S., Kuschev D. V., Ivanov V.P., Polonikov A. V.
Department of Biology, Medical Genetics & Ecology of Kursk State Medical University, Kursk The open randomization study was performed on the 120 patients (45-60 years old) with acute coronary syndrome (ACS). The purpose of this study was to investigate if the common Val432Leu polymorphism of CYP1B1 is associated with susceptibility to essential hypertension (EH) in Russian population of Central Chernozem region of Russia. The blood samples of 560 patients with EH and 480 sex- and age-matched healthy individuals were used to determine the Val432Leu polymorphism of CYP1B1 using real-time polymerase chain reaction (PCR) -TaqMan allele discrimination assay. No differences in both allele and genotype distributions of Val432Leu polymorphism of the CYP1B1 gene were found between EH patients and healthy individuals. According to the results of the study, common Val432Leu polymorphism of CYP1B1 is not associated with susceptibility to essential hypertension in Russian population of Central Chernozem region.
Keywords: essential hypertension, cytochrome P450 1B1, biotransformation, genetic polymorphism.
Актуальность изучения этиологии гипертонической болезни (ГБ) обусловлена не только повсеместной распространенностью заболевания, но и высокими показателями смертности и инвали-дизации трудоспособного населения. С точки зрения медицинской генетики гипертоническая болезнь представляет собой мультифакториаль-ное полигенное заболевание, развитие которого определяется сложным характером взаимодействия множества генов с разнообразными факторами окружающей среды [1, 2]. Доказательством важнейшей роли средовых, и в первую очередь, экологических факторов в развитии многих болезней, в том числе и ГБ, является быстрый рост их распространенности в последние годы, который невозможно объяснить изменением генетической составляющей за такой короткий промежуток времени с эволюционной точки зрения [2, 3]. В этой связи наиболее подходящими генетическими маркерами для эколого-генетических
исследований этиологии и патогенеза ГБ являются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), экспрессия которых, в отличие от других классов генов, непосредственно регулируется влияниями средо-вых факторов химической природы. Биотрансформация ксенобиотиков представляет собой трехэтапный процесс, включающий фазу активации (1 фаза), собственно детоксикацию (2 фаза) и выведение чужеродных веществ из организма (3 фаза) [4-6]. Именно генетические варианты ФБК могут определять индивидуальную чувствительность к токсическому действию химических веществ и могут составлять генетическую основу подверженности многим экозависимым заболеваниям, в том числе и гипертонической болезни [5]. Ранее нами были изучены взаимосвязи полиморфизмов генов параоксоназ с риском развития гипертонической болезни в популяции русских жителей Центрального Черноземья [6]. В рамках
настоящего исследования была изучена связь полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 c формированием предрасположенности к ГБ в данной популяции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования послужила выборка неродственных индивидов жителей Центрально-Черноземного региона России. Все обследованные, включая здоровых и больных ГБ, были русской национальности. Всего было обследовано 560 больных гипертонической болезнью и 480 здоровых лиц (контрольная группа). Формирование выборки больных ГБ осуществлялось сплошным методом на базе кардиологических отделений областной клинической больницы и больницы скорой медицинской помощи г. Курска. Пациенты включались в соответствующую группу больных после установления окончательного диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторноинструментальных методов обследования. Контрольная выборка формировалась как из здоровых добровольцев, так и при массовых обследованиях населения во время экспедиций, профессиональных осмотров на промышленных предприятиях, лечебно-профилактических и учебных заведениях г. Курска и Курской области. Критерием включения индивидов в контрольную группу было отсутствие у них хронических заболеваний. По полу и возрасту больные ГБ не отличались от контрольной группы (р<0.05). В исследовании использовались методы клинического и лабораторно-инструментального обследования пациентов, молекулярно-генетические и генетико-статистические методы.
У обследуемых проводился забор крови из кубитальной вены в пластиковые пробирки с 0,5 М раствором ЭДТА (рН=7,8) в количестве 5 мл. Потом кровь замораживали и хранили при - 20°С. ДНК было выделено методом стандартной фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) с использованием праймеров и зондов, синтезированных в компании «Синтол» (Москва).
Для оценки соответствия распределений генотипов CYP1B1 ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных и здоровых использовали критерий %2 Пирсона. Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами исполь-
зовали критерий у2 с поправкой Йетса на непрерывность. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 8.0 (StatSoft) и MS Excel 2002. Значения p<0,05 рассматривались как статистически значимые.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Распределение частот генотипов полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 и их соответствие популяционному равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) проводилось раздельно в контрольной группе и в группе больных с гипертонической болезнью. В табл. 1 представлены частоты генотипов в выборках здоровых и больных с гипертонической болезнью. Распределение генотипов соответствовало РХВ только в группе больных ГБ, тогда как у здоровых индивидов наблюдалось отклонение частот генотипов от равновесия Хар-ди-Вайнберга (р=0,02). То есть обнаружено увеличение уровня наблюдаемой гетерозиготности, в сравнении с их ожидаемым значением.
Следующим этапом исследования было изучение ассоциаций аллелей и генотипов CYP1B1 с риском развития гипертонической болезни. В табл. 2 представлены частоты аллелей и результаты их сравнительного анализа между группами. Из табл. 2 следует, что статистически значимых различий между выборками больных ГБ и контроля по частотам аллелей полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 выявлено не было.
Так как анализ ассоциации аллелей не дает полной картины о характере взаимосвязи рассматриваемых полиморфизмов с предрасположенностью к гипертонической болезни, было проведено исследование влияния генотипов исследуемого полиморфизма гена CYP1B1 на риск развития гипертонической болезни. В табл. 3 представлены результаты сравнительного анализа частот генотипов CYP1B1 между анализируемыми группами. Как видно из представленных данных, статистически значимых различий в частотах генотипов между группами не установлено. Однако у больных ГБ наблюдалась незначительная тенденция в увеличении частоты вариантных гомозигот 432LL в сравнении с контрольной группой.
Далее было проведено исследование ассоциаций полиморфизма Val432Leu гена CYP1B1 раздельно у мужчин и женщин. В табл. 4 и 5 представлены распределения частот аллелей и генотипов у женщин в группах больных гипертонической болезнью и контроля.
Как видно из представленных в табл. 4 и 5 данных, статистически значимых различий между
Таблица 1
Распределение частот генотипов и значения гетерозиготности по полиморфизму У432Ь гена СУР1Б1 в группах здоровых и больных ГБ
Выборки Генотип У432Ь СУР1Б1 Распределение генотипов Уровень гетерози-готности 2 X, (р)
п % Но Не
Больные ГБ УУ 98 17,6 0,514 0,513 1,17 (0,18)
Уь 286 51,4
ьь 173 31
Здоровые индивиды УУ 86 18 0,549 0,495 5,53 (0,02)*
УЬ 263 54,9
ьь 130 27,1
Примечание: Н0 - наблюдаемая гетерозиготность;
Не - ожидаемая гетерозиготность,
X2 Пирсона и достигнутый уровень значимости для теста на РХВ (&=1)
Таблица 2
Сравнительный анализ частот аллелей полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 у больных с гипертонической болезнью и людей контрольной группы
Ген Поли- морфизм Аллели Частоты аллелей Критерий различий х2, (р) ОЯ (С1 95%)
п Больные п Контрольная
СУР1Б1 У432Ь У 557 0,433 479 0,454 0,96 (0,33) 1,09 (0,921,3)
ь 0,567 0,546
Таблица 3
Сравнительный анализ частот полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 у больных с гипертонической болезнью и людей контрольной группы
Ген Поли- мор- физм Гено- типы Частоты генотипов Критерий различий х2, (р) ОЯ (С1 95%)
п Боль- ные п Конт- рольная
СУР1Б1 У432ь УУ 557 0,176 479 0,180 0,02 (0,88) 1,02 (0,74-1,41)
уь 0,514 0,549 1,31 (0,25) 0,87 (0,68-1,11)
ьь 0,310 0,271 1,91 (0,17) 1,21 (0,92-1,58)
группами больных ГБ и контрольной группы среди женщин по исследуемому полиморфизму выявлено не было. Далее был проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 между группами больных ГБ и здоровых мужчин.
В табл. 6 и 7 представлены результаты распределения частот аллелей и генотипов у мужчин
в группах больных гипертонической болезнью и контроля. Однако статистически значимых различий между группами больных ГБ и контрольной группы мужчин по исследуемому полиморфизму не наблюдалось. Таким образом, проведенный анализ ассоциации полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 не позволил нам устано-
Таблица 4
Сравнительный анализ частот аллелей полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 у больных с гипертонической болезнью и людей контрольной группы среди женщин
Ген Поли- морфизм Аллели Частоты аллелей Критерий различий х2, (Р) ОЯ (СІ 95%)
п Больные п Контроль- ная
СУР1Ы1 У432Ь V 315 0,43 295 0,35 1,9 (0,17) 1,17 (0,93-1,47)
L 0,57 0,65
Таблица 5
Сравнительный анализ частот генотипов полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 у больных с гипертонической болезнью и людей контрольной группы среди женщин
Ген Поли- морфизм Генотипы Частоты генотипов Критерий различий х2, (р) ОЯ (СІ 95%)
п Больные п Контроль- ная
СУР1Ы1 V432L VV 315 0,174 295 0,197 0,49 (0,48) 0,86 (0,57-1,3)
VL 0,508 0,543 0,72 (0,39) 0,81 (0,63-1,2)
LL 0,318 0,260 2,36 (0,12) 1,32 (0,93-1,87)
Таблица 6
Сравнительный анализ частот аллелей полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 у больных с гипертонической болезнью и людей контрольной группы среди мужчин______________
Ген Поли- морфизм Аллели Частоты аллелей Критерий различий х2, (Р) ОЯ (СІ 95%)
п Боль- ные п Контроль- ная
СУР1Ы1 V432L V 242 0,44 184 0,43 0,03 (0,86) 0,98 (0,74-1,28)
L 0,56 0,57
Таблица 7
Сравнительный анализ частот генотипов полиморфизма Val432Leu гена СУР1Б1 у больных с гипертонической болезнью и людей контрольной группы среди мужчин
Ген Поли- мор- физм Генотипы Частоты генотипов Критерий различий х2, (р) ОЯ (СІ 95%)
п Боль- ные п Контроль- ная
СУР1Ы1 V432L VV 242 0,178 184 0,152 0,49 (0,48) 1,2 (0,72-2,03)
VL 0,52 0,56 0,64 (0,42) 0,85 (0,58-1,26)
LL 0,302 0,288 0,09 (0,76) 1,07 (0,7-1,63)
вить взаимосвязи данного локуса с риском развития гипертонической болезни в популяции русских жителей Центрального Черноземья.
Известно, что ген СУР1Ы1 (ОМІМ 601771) экспрессируется в различных тканях организма, в том числе в сердечно-сосудистой системе [17]. Ферменту принадлежит ведущая роль в активации 17р-эстрадиола, дигидродиолов полицикли-ческих ароматических углеводородов (ПАУ), ароматических аминов и ариламинов, а также в метаболизме кофеина и многих лекарственных
препаратов. Ген СУР1Б1 картирован на хромосоме 2р22-р21 [17]. Идентифицировано порядка 23 аллельных вариантов гена СУР1Б1. Для отдельных аллельных вариантов гена установлено влияние на скорость превращения эстрадиола в про-канцерогенный 4-гидроксиэстрадиол. Полиморфизм в 3 экзоне Leu432Val является объектом наибольшего внимания исследователей в связи с его существенным влиянием как на каталитические свойства, так и на субстратную специфичность фермента [9]. Из литературы известно, что
полиморфизмы гена СУР1Б1 ассоциированы с предрасположенностью к раку молочной железы, раку легкого, раку предстательной железы, раку эндометрия, врожденной глаукоме [10] и легочной гипертензии. Таким образом, в литературе на данный момент существует больше данных о влиянии полиморфизмов гена СУР1Б1 на развитие канцерогенеза и формирование онкологических заболеваний, наиболее часто гормонзависи-мых неоплазий [11,16]. При развитии легочной гипертензии 17р-эстрадиол, метаболизм которого регулируется ферментом СУР1Б1, оказывает влияние на серотонин-сигнальную систему и индуцирует пролиферацию мышечных клеток легочной артерии [14,12]. Однако, учитывая тот факт, что цитохром Р450- СУР1Б1 относится к ферментам 1 -й фазы биотрансформации ксенобиотиков, при доминировании которой в организме накапливаются токсические продукты, в том числе и свободные радикалы, можно предположить следующую патогенетическую связь его с развитием различной мультифакториальной патологии. Так как белковый продукт цитохром-оксидаза Р450 является компонентом системы детоксикации клетки [13,15], следствием накопления свободных радикалов в тканях является оксидативный стресс, который лежит в основе патогенеза многих болезней. Образовавшиеся реактивные формы кислорода воздействуют на фосфолипиды, точнее, на ненасыщенные жирные кислоты, входящие в их состав и высвобождающиеся при распаде фосфолипидов, и подвергают их перекисно-му окислению, выделяя свободнорадикальные формы с повреждающими свойствами. В результате происходит деструкция клеточных структур вплоть до гибели клеток. В итоге инициируется мутагенное, канцерогенное, цитотоксическое действие токсикантов - продуктов СУР1Б1 [11]. Более того, белковые продукты цитохрома Р450-монооксигеназы катализируют многие реакции синтеза холестерина, стероидов и других липидов, при нарушении метаболизма которых могут развиваться непосредственно изменения сосудистой стенки, ведущие к развитию сердечно-сосудистой патологии [12]
Однако, анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, полиморфизм Уа1432ьеи гена СУР1Б1 не оказывает существенного влияния на риск развития ГБ у русских жителей Центральной России. Учитывая генетическую гетерогенность гипертонической болезни и межпопуля-ционные различия в спектре полиморфных аллелей гена СУР1Б1 и их частот необходимо продолжить исследование вовлеченности данного гена в формирование предрасположенности к ГБ в других популяциях, в том числе и с проведени-
ем функциональной оценки ДНК-полиморфизмов.
Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (соглашение № 8097).
ЛИТЕРАТУРА
1. Диагностика и лечение артериальной гипертензии. Рекомендации Российского медицинского общества по артериальной гипертонии и Всероссийского научного общества кардиологов // Кардиоваскулярная терапия и профилактика, прил. 2. - 2008. - № 6. - С. 32.
2. Карнолеки И.Н. Влияние наследственной отяго-щенности на заболеваемость гипертонической болезнью в молодом возрасте // Терапевтический архив. - 1981. - № 2. - С. 108-111.
3. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Гуткина Н.И., Лактионова И.П., Макарова С.И., Митрофанов Д.В., Осташевский В.А., Часовникова О.Б. Гены и ферменты системы метаболизма ксенобиотиков в онкопатологии // Вопросы медхимии. - 1997. - Т. 43, № 5. - С. 330-338.
4. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 7. Диагностика болезней сердца и сосудов.: - М.: Мед. лит-ра., 2003. - 416 с.
5. Полоников А.В., Иванов В.П., Солодилова М.А. Эколого-токсикогенетическая концепция мульти-факториальных заболеваний: от понимания этиологии до клинического применения // Медицинская генетика. - 2008. - Т. 7. - № 11. - С. 3-20.
6. Полоников А.В., Солодилова М.А., Хорошая И.В., Катаргина Л.Н., Кожухов М.А., Колесникова О.Е. Анализ связи двух точновых мутаций генов пара-оксоназ Q192R PON1 и S311C PON2 с предрасположенностью к гипертонической болезни в популяции русских жителей Центрального Черноземья // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2006. - № 4. - С. 57-61.
7. Профилактика, диагностика и лечение артериальной гипертензии // Российские рекомендации (второй пересмотр). Секция артериальной гипертонии ВНОК. - М.: 2004. - С. 1-4.
8. Профилактика и лечение артериальной гипертонии в Российской Федерации (2002-2008 гг.) // Федеральная целевая программа. - М.: 2005. - С. 2-6.
9. Bailey L.R., Roodi N., Dupont W., Pari F.F. Association of cytochrome P450 1B1 (CYP IB I) polymorphism with steroid receptor status in breast cancer // Cancer Res. - 1998. - Vol. 58. - P.5038-5041.
10. Belmouden A., Melki R., Hamdani M., Zaghloul K., Amraoui A., Nadifi S., Akhayat O., Garchon H.J. A novel frameshift founder mutation in the cytochrome P4501B1 (CYP1B1) gene is associated with primary congenital glaucoma in Morocco // Clin. Genet. - 2002. - Vol. 62. - Р. 334-339
11. Chen B., Qiu L.X., Li Y., Xu W., Wang X.L., Zhao W.H., Wu J.Q. The CYP1B1 Leu432Val polymorphism contributes to lung cancer risk: Evidence
from 6501 subjects // Lung Cancer. - 2010. - N 70. -P. 247-252.
12. Dempsie Y., MacRitchie N.A., White K., Morecroft I., Wright A.F., Nilsen M., Loughlin L., Mair K.M., MacLean M.R. Dexfenfluramine and the oestrogen-metabolizing enzyme CYP1B1 in the development of pulmonary arterial hypertension // Cardiovascular Research. - 2013. - N 99. - P. 24-34.
13. Lewis D.F., Gillam E.M., Everett S.A., Shimada T. Molecular modelling of human CYP1B1 substrate interactions and investigation of allelic variant effects on metabolism // Chemico-Biological Interactions. -2003. - № 145. - P. 281-295.
14. Roos P.H., Bolt H.M. Cytochrome P450 interactions in human cancers: new aspects considering CYP1B1 // Expert Opin Drug Metab Toxicol. - 2005. - N 1. -P. 187-202.
15. Schwarz D., Kisselev P., Chernogolov A., Schunck W.H., Roots I. Human CYP1A1 variants lead to differential eicosapentaenoic acid metabolite patterns // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2005. - N 336. - P. 779-783.
16. Sowers M.R., Wilson A.L., Kardia S.R., Chu J., McConnell D.S. CYP1A1 and CYP1B1 Polymorphisms and Their Associationwith Estradiol and Estrogen Metabolites in Women Who Are Premenopausal and Perimenopausal // The American Journal of Medicine. - 2006. - Vol. 119 (9 Suppl 1). -P. 44-51.
17. Sutter T.R. The cancer preventative agent resveratrol is converted to the anticancer agent piceatannol by the cytochrome P450 enzyme CYP1B1 // British Journal of Cancer. - 2002. - N 86, - P. 774-778
