CC BY
82
Инфекция и иммунитет 2013, Т. 3, № 1, с. 21-28
Оригинальные статьи
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ УРАЛЬСКОГО РЕГИОНА РОССИИ
Т.В. Умпелева1, М.А. Кравченко1, Н.И. Еремеева1, А.А. Вязовая2, О.В. Нарвская2
1ФГБУ Уральский НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, г. Екатеринбург 2 ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург
Резюме. Изучено 178 изолятов M. tuberculosis, выделенных в 2009—2011 гг. от впервые выявленных эпидемиологически несвязанных больных в Уральском регионе. Лекарственную чувствительность изолятов определяли культуральным методом и с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП» для выявления мутаций, ассоциированных с резистентностью к изониазиду (гены katG, inhA) и рифампицину (ген rpoB). Ге-нотипирование изолятов проведено с помощью тест-системы «Амплитуб-Beijing» и метода MIRU-VNTR (15 локусов), согласно «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru-vntrplus.org). Доля изолятов группы Beijing составила 55,1% (98 из 178): из них более половины обладали множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) преимущественно за счет мутаций rpoB Ser531^Leu и katG Ser315^Thr1. У изолятов Beijing выявлено 50 профилей VNTR. Самый крупный из 9 кластеров VNTR включал 23 (23,5%) изолята Beijing. У 80 изолятов nonBeijing выявлено 64 VNTR-профиля шести генетических групп: LAM, Ural, Haarlem и др. Доля мультирезистентных изолятов LAM и Ural составила 30,4 и 28,6% соответственно. Для 5 из 7 МЛУ изолятов LAM было характерно сочетание мутаций rpoBAsp516^-Val и katGSer315^Thr1, inhA_T15. МЛУ изоляты Ural были наиболее гетерогенными по спектру мутаций в гене rpoB. Полученные данные свидетельствуют о неблагоприятной эпидемической ситуации по туберкулезу, которая характеризуется распространением мультирезистентных штаммов возбудителя различных генотипов в Уральском регионе. При этом в структуре популяции M. tuberculosis преобладают штаммы генетического семейства Beijing.
Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, генотипирование, VNTR, ТБ-Биочип.
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS CIRCULATING IN THE URAL REGION, RUSSIA
Umpeleva T.V., Kravchenko M.A., Eremeeva N.I., Vyazovaya A.A., Narvskaya O.V.
Abstract. Overall 178 Mycobacterium tuberculosis isolates recovered in 2009—2011 from newly diagnosed epidemio-logically unlinked to TB patients in the Ural region of Russia have been studied. The absolute concentration method was used for drug susceptibility testing. Mutations katG, inhA and rpoB associated with resistance to isoniazid and rifampicin were detected by microchip technology («TB-Biochip»). The isolates were genotyped by real-time PCR for the detection of Beijing/non-Beijing genotypes and 15-locus MIRU-VNTR typing according to «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru-vntrplus.org). More than half (55.1%) of 178 isolates belonged to the Beijing family, 58.7% of them were multiple drug resistant (MDR) mostly due to rpoBSer531^Leu and katGSer315^Thr! sub-
поступила в редакцию 19.02.2013 отправлена на доработку 20.02.2013 принята к печати 19.03.2013
© Умпелева Т.В. и соавт., 2013
Адрес для переписки:
Умпелева Татьяна Валерьевна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальных и диагностических методов исследования ФГБУ УНИИФ МЗ РФ
620039, г. Екатеринбург,
ул. 22 Партсъезда, 50, ФГБУ УНИИФ МЗ РФ.
Тел.: (343) 333-44-66 (раб.).
E-mail: [email protected]
stitutions. Fifty VNTR profiles were found in 98 Beijing isolates; 57 of them grouped into 9 clusters. The largest VNTR cluster included 23 (23.5%) Beijing isolates and 21 of them were MDR. The 80 non-Beijing isolates showed 64 distinct VNTR patterns which belonged to 6 genetic families: LAM, Ural, Haarlem, etc. Among LAM and Ural isolates 30.4% and 28.6% were MDR, respectively. The 5 of 7 MDR LAM isolates had specific mutation profile: rpoBAsp516^-Val substitution and mutations katGSer315^Thr1 and inhA_T15. The MDR Ural isolates showed the heterogeneity of mutations in rpoB gene compared to other genotypes. Taken together, these findings suggest the emergence and spread of MDR-TB in the Ural region which is characterized by circulation of MDR strains of different genotypes with the Beijing family genotype to be predominant. (Infekc. immun., 2013, vol. 3, N1, p. 21-28)
Key words: Mycobacterium tuberculosis, genotyping, VNTR, TB-Biochip.
Введение
Согласно данным статистики за 2011 г., в Уральском регионе заболеваемость туберкулезом на 100 тыс. населения составила 81,6 против 84, 7 в 2010 г. На фоне снижения этого показателя увеличилась доля случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) возбудителя, которая составила 13,8% среди вновь выявленных больных туберкулезом органов дыхания против 11,6% в 2010 г. [6, 7].
В научной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные характеристике популяции возбудителя туберкулеза в регионе. Так, еще в 2001—2002 гг. в Свердловской области было проведено MIRU-VNTR-генотипиро-вание культур Mycobacterium tuberculosis, выделенных от 92 больных туберкулезом [8]. С тех пор были предложены новые схемы MIRU-VNTR-типирования и разработаны тест-системы и технологии для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) M. tuberculosis с использованием молекулярно-генетических методов.
Цель данной работы — изучить генетическую структуру популяции возбудителя туберкулеза на территории Уральского региона и определить спектр мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину и изо-ниазиду у штаммов M. tuberculosis различных генотипов.
Материалы и методы
Изучено 178 изолятов M. tuberculosis, полученных в период с июня 2009 г. по ноябрь 2011 г. от 63 (35,3%) женщин и 115 (64,7%) мужчин в возрасте 18—86 лет, находившихся на лечении в УНИИФ и СОГУЗ ПТД по поводу туберкулеза легких. Все пациенты принадлежали к группе вновь выявленных больных, из них 16 (8,9%) были ВИЧ-позитивны. От 150 пациентов культуры микроорганизмов выделены до начала курса антибиотикотерапии.
Культивирование M. tuberculosis проводили на среде Левенштейна—Йенсена. Определение ЛЧ к противотуберкулезным препаратам (ПТП) осуществляли стандартным методом абсолютных концентраций. Изоляты считали мультирезистентными (МЛУ) при выявлении лекарственной устойчивости (ЛУ) к рифампи-цину и изониазиду одновременно.
Образцы ДНК получали из суспензии чистых культур M. tuberculosis в растворе, содержащем 9% NaCl и 20% глицерина, путем инкубации при 98°С в течении 30 мин.
Определение мутаций в генах rpoB, katG и inhA, обусловливающих лекарственную устойчивость к основным ПТП — рифампици-ну и изониазиду проводили с использованием тест-систем ТБ-Биочип (MDR), производства ООО «Биочип-ИМБ», Москва. Для первоначальной дифференциации изолятов на группы Beijing и non-Beijing методом ПЦР в режиме реального времени использовали тест-систему «Амплитуб-Beijing», ООО «Синтол», Москва. Изоляты M. tuberculosis типировали методом MIRU-VNTR, используя схемы на основе 15 локусов [12]. Принадлежность к генетической линии (lineage) проводили путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru-vntrplus.org). Для оценки вариабельности генетических ло-кусов использовали индекс Хантера—Гастона (HGDI), который рассчитывали с использованием алгоритма http://www.hpa-bioinform. Связи между изолятами графически отображали с помощью филогенетического древа, построенного с учетом полиморфизма локусов MIRU-VNTR («MIRU-VNTRplus»).
Результаты
С помощью тест-системы «Амплитуб-Bei-jing» была определена принадлежность 178 культур M. tuberculosis к группам Beijing и non-Beijing, включавшим 98 (55,1%) и 75 изолятов соответственно. В пяти случаях результаты ПЦР
ТАБЛИЦА 1. ОТНОШЕНИЕ ИЗОЛЯТОВ M. TUBERCULOSIS К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ ПЕРВОГО РЯДА (КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ)
Генотип Число штаммов Отношение к ПТП*
ЛЧ МЛУ S H R H, S H, E, S R, E, S
Beijing 98 30 46 4 1 11 3 3
non-Beijing 80 46 15 3 4 1 10 1
Примечание. * устойчивость к стрептомицину — S, к изониазиду — H, к рифампицину — R, к этамбутолу — Е.
были неоднозначны, однако MIRU-VNTR-типирование по 15 локусам позволило отнести все пять изолятов к группе non-Beijing. Таким образом, группа non-Beijing включала 80 (44,9%) изолятов.
По результатам культурального исследования лекарственно-чувствительными были 76 (42,7%) изолятов; ЛУ хотя бы к одному препарату проявляли 102 (57,3%) из 178 изолятов (табл. 1). Полирезистентными (устойчивыми одновременно к двум и более препаратам, за исключением рифампицина) были 28 (15,7%) изолятов. Как видно из табл. 1, МЛУ обладал 61 (34,3%) штамм, из них 75% принадлежали к группе Beijing.
Молекулярно-генетическое выявление мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду с помощью тест-системы «ТБ-Биочип» проведено у 174 изолятов (табл. 2). Из них 77 (44,3%) не имели мутаций, ассоциированных с резистентностью к рифампицину и изо-ниазиду. Мутации в генах rpoB, katG и/или inhA, обусловливающих МЛУ, выявлены у 72 (41,4%) мультирезистентных штаммов, причем 57 (79,2%) из них принадлежали к группе Beijing. Как видно из табл. 2, у подавляющего большинства изолятов данной группы (n = 54) МЛУ была связана с наличием замен Ser531^Leu и Ser315^Thr в генах rpoB и katG соответственно, в отличие от изолятов группы non-Beijing.
По результатам MIRU-VNTR типирования у 80 изолятов M. tuberculosis группы non-Beijing было определено 64 варианта VNTR профиля, которые, согласно «MIRU-VNTRplus», представляли шесть генетических линий: LAM, Ural, Haarlem, Tur, S и неклассифицируемые (Unknown).
Двадцать восемь изолятов, в том числе LAM, Ural и Unknown с одинаковыми числовыми профилями VNTR, были сгруппированы в 12 кластеров, содержавших по 2—4 изоля-та в каждом (рис. 1).
Анализ аллельного полиморфизма 15 MIRU-VNTR локусов показал, что все они, за исключением MIRU4 и QUB4156, являлись высокополиморфными у штаммов non-Beijing (табл. 3).
При сопоставлении данных генотипирова-ния и результатов определения мутаций ЛУ было установлено, что из 23 изолятов LAM 7 (30,4%) проявляли МЛУ (табл. 2), причем пять из них имели замену rpoBAsp516^-Val (устойчивость к рифампицину) и сочетание мутаций устойчивости к изониазиду: katGSer315^Thr1 и inhA_T15. При этом MIRU-VNTR профили трех изолятов были идентичны (кластер 6), но отличались по числу копий в локусах MIRU40, MIRU10 и MIRU26 от двух других изолятов (рис. 1).
В группе Ural (n = 21) МЛУ обладали 6 (28,6%) изолятов (табл. 2; рис. 1). 9 из 10 изолятов, чувствительных к рифампицину и изониазиду,
ТАБЛИЦА 2. ОПЕКТР МУТАЦИЙ В ГЕНАХ rpoB, katG И inhA У ИЗОЛЯТОВ M. TUBERCULOSIS
Мутации в генах
Генетическое Число rpoB katG inhA
семейство штаммов Ser531-Leu Leu511-Pro Met515-Ile Asp516-Val His526-Tyr Ser315-Thr1 Ser315-Thr2 T15 A8 G8
Beiiing 97 54 1 3 67 1 1 1
non-Beiiing 77 6 2 1 6 23 2 11 1
LAM 23 2 5 7 1 5 1
Ural 21 2 2 1 1 10 1 2
Haarlem 14 1 1
Tur 1 1 1
S 1 1
Unknown 17 3 4
Рисунок 1. Филогенетическое древо изолятов M. tuberculosis группы non-Beijing
Слева: мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду приведены в скобках после номера изолята; «?» — нет данных; оттенками серого выделены изоляты с одинаковым спектром мутаций; кластеры обозначены порядковыми номерами. Справа: цифрами показано число повторов в локусах (Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUB11b, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156); пробел в цифровом профиле обозначает отсутствие продукта амплификации.
Рисунок 2. Филогенетическое древо изолятов M. tuberculosis группы Beijing
Слева: мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду приведены в скобках после номера изолята; «?» — нет данных; оттенками серого выделены изоляты с одинаковым спектром мутаций; кластеры обозначены порядковыми номерами. Справа: цифрами показано число повторов в локусах (Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUB11b, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156); пробел в цифровом профиле обозначает отсутствие продукта амплификации.
ТАБЛИЦА 3. ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ЛОКУСОВ MIRU-VNTR ИЗОЛЯТОВ M. TUBERCULOSIS
Локус non-Beijing Beijing
HGI число повторов HGI число повторов
QUB26 0,808 2-9 0,653 (2)5-8
MIRU 10 0,807 2-11 0,190 2-3
MIRU40 0,78 1-7 0,155 1-6
ETRC 0,745 2-5 0 4
ETR A 0,701 1-5 0,135 3-4
QUB 11b 0,692 1-7 0,173 3-7
MIRU26 0,691 1-7 0,653 1-7 (11)
MIRU16 0,688 1-5 0,134 2-3
Mtub 39 0,686 2-8 0 3
Mtub04 0,683 1-4 0,079 3-5
Mtub30 0,669 1-4(19) 0 4
MIRU31 0,606 1-5 0,409 2-6
Mtub21 0,574 1-4 0,241 3-7
QUB4156 0,26 2-3 0 2
MIRU4 0,097 1-3 0 2
содержали по восемь повторов в локусе QUB26, в то время как у изолятов, несущих мутации устойчивости к этим препаратам, число повторов в данном локусе отличалось от восьми. У двух изолятов, принадлежащих к группе Ural, локус MIRU10 содержал пять повторов.
Все изоляты группы Haarlem (n = 14), за исключением одного, не содержали мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду.
У 98 изолятов группы Beijing, выявлено 50 VNTR профилей; 57 из них входили в состав 9 кластеров, включавших от двух до нескольких десятков изолятов (рис. 2). Из рис. 2 видно, что самый многочисленный кластер 6 (числовой профиль 4,4,2,3,3,3,5,6,4,4,7,5,3,7,2) объединял 23 (23,5%) изолята. Локусы MIRU26, QUB26, MIRU31 имели наибольшие значения HGI — 0,654, 0,597, 0,409 соответственно; остальные локусы были мономорфными (табл. 3). Доля МЛУ изолятов Beijing составила 58,7% (57 из 97), причем 54 (91,2%) из них имели сочетание мутаций rpoB Ser531^Leu и katG Ser315^Thr1 (табл. 2).
Обсуждение
В популяции M. tuberculosis Уральского региона на протяжении 10 лет доминируют штаммы генетического семейства Beijing, причем их доля остается практически неизменной: 54,3% — в 2001-2002 гг. [8] и 55,1% — в 20092011 гг. Частота МЛУ среди штаммов Beijing достигает 58,7%, преимущественно за счет соче-
тания замен rpoBSer531^Leu и katGSer315^Thr, что согласуется с данными, полученными в других регионах России [1, 2, 4, 5]. Показано, что эти хромосомные мутации формирующие МЛУ, обеспечивают устойчивость к высоким концентрациям рифампицина и изониазида in vitm, не снижая жизнеспособности и вирулентности микроорганизма [4]. Широкая циркуляция мультирезистентных штаммов возбудителя туберкулеза диктует необходимость быстрого определения их принадлежности к эпидемиологически значимым генотипам (Beijing). В настоящем исследовании первичная дифференциация изолятов на группы Beijing и non-Beijing была успешно осуществлена с помощью тест-системы «Амплитуб-Beijing».
При генотипировании изолятов M. tuberculosis группы Beijing Уральского региона методом MIRU-VNTR, наиболее информативными оказались локусы MIRU26 и QUB26, что наблюдалось и в Северо-Западном регионе России [3, 10]
Из девяти MIRU-VNTR кластеров группы Beijing наиболее крупный (кластер 6) включал 23,5% изолятов, для которых было характерно наличие семи повторов в локусах MIRU26 и QUB26 и пяти повторов в локусе MIRU31 (рис. 2). Изоляты этого кластера, за исключением двух, обладали МЛУ за счет сочетания замен rpoBSer531^Leu и katGSer315^Thr. Для доказательства генетической однородности изолятов, принадлежавших к данному кластеру, необходимы дополнительные исследования c использованием гипервариабельных локусов QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120 [10], а также генотипирование методом IS6110-RFLP.
Локусы Mtub39, Mtub30, MIRU4, ETRC, QUB4156 были мономорфными (табл. 3), поэтому их применение для генотипирования изолятов группы Beijing в Уральском регионе представляется не информативным.
Сравнение значений HGI при оценке вариабельности генетических локусов, изученных нами и опубликованных ранее данных для группы Beijing по Северо-Западному региону России [6], выявило более высокую (0,409 против 0,160) степень полиморфизма в локусе MIRU31 у изолятов из Уральского региона, что, по-видимому, отражает региональные особенности популяций возбудителя туберкулеза.
Для дифференциации изолятов группы non-Beijing было достаточно набора 13 из 15 MIRU-VNTR локусов. Поскольку база данных «MIRU-VNTRplus» не является обновляемой
и содержит информацию о MIRU-VNTR профилях только 186 изолятов, определить принадлежность к генетической линии 18 изолятов non-Beijing не удалось. Для более полной характеристики вариабельности этой группы изолятов необходимо дополнительно использовать другой метод генотипирования — спо-лиготипирование.
Наибольшее число изолятов группы non-Beijing принадлежало генетической линии LAM (31,3%). Из них, 30,4% были мультире-зистентными за счет характерного сочетания мутаций katG Ser315^Thr1, inhA_T15 (устойчивость к изониазиду) и rpoB Asp516^Val (устойчивость к рифампицину). Недавно такой спектр мутаций был выявлен у штаммов LAM в Псковской области [1].
Еще в 2005 г. С.Ю. Ковалев с соавт., используя 12-локусную схему MIRU-VNTR-типи-рования 92 изолятов, продемонстрировали обособленность ветви, формируемой штаммами Ural, от ветвей других генетических семейств на филогенетическом древе [8]. Изначально критериями принадлежности к данному генотипу считали наличие одного повтора в локусе MIRU26 и не менее шести повторов в локусе MIRU10 [8], однако недавно описано присутствие трех и четырех повторов в локусе MIRU10 у штаммов, циркулирующих на территории Сибири [5] и в Киргизии [11]. В настоящем исследовании были выявлены изоляты, содержащие пять повторов в локусе MIRU10. Таким образом, по нашему мнению, существенный полиморфизм данного локуса не позволяет использовать его в качестве критерия принадлежности изолята к генотипу Ural [9]. Интересно отметить, что для изолятов Ural, чувствительных к рифампицину и изониази-ду, было характерно наличие восьми повторов в локусе QUB26. В нашем исследовании, включавшем 178 культур M. tuberculosis, доля изолятов генотипа Ural составила 11,8%, причем 28,6% из них обладали МЛУ за счет различных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину и изониазиду. При этом генотип Ural по сравнению с другими генотипами был наиболее гетерогенным по спектру мутаций в гене rpoB у мультирезистентных изоля-тов (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют о неблагоприятной эпидемической ситуации по туберкулезу, которая характеризуется распространением мультирезистентных штаммов возбудителя различных генотипов в Уральском регионе. При этом в структуре популяции M. tuberculosis преобладают штаммы генетического семейства Beijing.
Список литературы
1. Вязовая А.А., Журавлев В.Ю., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Павлова Е.П., Кришевич В.В., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в Псковской области // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2011. — № 6. — С. 27-31.
2. Медведева Т.В., Огарков О.Б., Некипелов О.М., Ушаков И.В., Козьякова Е.С., Скворцова Р.Г. MIRU-VNTR-генотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis в Восточной Сибири: семейство Beijing против Kilimanjaro // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2004. — № 4. — С. 33—37.
3. Мокроусов И.В., Вязовая А.А., Старкова Д.А., Нарвская О.В. Высокоразрешающее типирова-ние штаммов генотипа Beijing российской популяции Mycobacterium tuberculosis // Туберкулез и болезни легких. — № 7. — С. 46-53.
4. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobac-terium tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — СПб., 2003. — 35 с.
5. Огарков О.Б., Медведева Т.В., Zozio Т., Погоре-лов В.И., Некипелов О.М., Гутникова М.Ю., Куп-цевич Н.Ю., Ушаков И.В., Sola C. Молекулярное типирование штаммов микобактерий туберкулеза в Иркутской области (Восточная Сибирь) в 2000-2005 гг. // Молекулярная медицина. — 2008. — № 2. — С. 33-38.
6. Туберкулез в Российской Федерации, 2010 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации. — М., 2011. — 280 с.
7. Эпидемиологическая ситуация и деятельность противотуберкулезной службы на Урале в 2011 г. / под ред. С.Н. Скорнякова. — Екатеринбург: Локомотив, 2012. — 249 с.
8. Kovalev S.Y., Kamaev E.Y., Kravchenko M.A., Kure-pina N.E., Skorniakov S.N. Genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping // Int. J. Tuberc. Lung Dis. — 2005. — Vol. 9 (7). -P. 746-752.
9. Mokrousov I. The quiet and controversial: Ural family of Mycobacterium tuberculosis // Infect. Genet. Evol. — 2012. — N 12. — P. 619-629.
10. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Millet J., Otten T., Vishnevsky B., Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: in search of informative variable-number tandem-repe at loci // J. Clin. Microbiol. — 2008. — Vol. 46 (11). — P. 35763584.
11. Mokrousov I., Valcheva V., Sovhozova N., Aldashev A., Rastogi N., Isakova J. Penitentiary population of Mycobacterium tuberculosis in Kyrgyzstan: exceptionally high prevalence of the Beijing genotype and its Rus-
sia-specificsubtype // Infect. Genet. Evol. — 2009. — Vol. 9. — P. 1400-1405.
12. Supply P., Allix C., Lesjean S, Cardoso-Oelemann M., Rusch-Gerdes S., Willery E., Savine E., Haas P., van Deutekom H., Roring S, Bifani P., Kurepina N., Kreis-wirth B., Sola C., Rastogi N., Vatin V., Gutierrez M.,
Fauville M., Niemann S., Skuce R., Kremer K., Locht C., van Soolingen D. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. — 2006. — Vol. 44 (12). — P. 4498-4510.
