CC BY
246
УДК 616.24-002.5; 577.23; 575.191 Ж.Т. Исакова
E-mail: jainagul@mail.ru
МУТАЦИИ В ГЕНАХ rpoB, katG, inhA И ahpC В ШТАММАХ М. TUBERCULOSIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ
Институт молекулярной биологии и медицины при Национальном центре кардиологии и терапии, Бишкек, Кыргызстан
ВВЕДЕНИЕ
Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (Multidrug-resistant - MDR TB) - это наиболее опасная форма туберкулеза, при которой туберкулезные микобактерии (МБТ) становятся устойчивыми как минимум к двум наиболее важным противотуберкулезным препаратам - изо-ниазиду и рифампицину [1].
Установлено, что устойчивость МБТ к рифампи-цину (RIF) и изониазиду (INH) обусловлена мутациями в генах rpoB, katG, inhA и ahpC [2].
В настоящее время в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва, Россия) создан олигонуклеотидный «ТБ-Биочип», позволяющий выявить дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) МБТ и параллельно регистрировать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC, ассоциированные с устойчивостью МБТ к RIF и INH, в течение двух дней [3].
Тип и частота встречаемости определенных мутаций в генах rpoB, katG, inhA и ahpC достаточно стабильны среди микобактериальных штаммов, распространенных в различных географических районах. В то же время, в ряде исследований была отмечена и определенная географическая вариабельность таких мутаций [4].
Целью настоящей работы было охарактеризовать мутации в генах rpoB, katG, inhA и ahpC в штаммах М. tuberculosis, циркулирующих в Кыргызской Республике.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Всего обследовано 445 впервые выявленных больных с клинически подтвержденным диагнозом легочного туберкулеза. Среди обследованных мужчин было 249 (60%), женщин - 196 (44%).
Всем больным помимо традиционных методов диагностики туберкулеза (рентгенография органов грудной клетки, микроскопии мазка мокроты, посев мокроты на выделение МБТ) на базе Института молекулярной биологии и медицины проводилась биочип-диагностика лекарственной устойчивости
МБТ к рифампицину и изониазиду. Образцы мокроты для исследования собраны согласно общепринятым методикам [5].
Микобактерии туберкулёза были обнаружены методом микроскопии при поступлении в клинику у всех 445 пациентов. Бактериологические исследования культур МБТ на чувствительность к противотуберкулёзным препаратам первого ряда проводили методом абсолютных концентраций [6]. В 445 случаях определение устойчивости МБТ к ШБ и ЩИ проводили тест-системой «ТБ-Биочип МОК», разработанной в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) [2]. Исследование на биочипах заключалось в выделении ДНК МБТ из мокроты, проведении двух последовательных мультиплексных ПЦР со специфическими для 186110, гроБ, ка1С, тЬА и аЬрС праймерами, гибридизации продуктов амплификации второй стадии ПЦР с оли-гонуклеотидными зондами, установленными в ячейках биочипа. Результаты гибридизации регистрировали на портативном анализаторе биочипов «Чипде-тектор-03» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) с соответствующим программным обеспечением «Imagewaгe». Сопоставляя полученный флуоресцентный образец со схемой расположения олигонуклеотидов на микрочипе, определяли мутации, присутствующие в изучаемой последовательности ДНК, и делали заключение об устойчивости или чувствительности исследуемого образца к рифампицину или к изониазиду.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мутации в генах гроБ, ка1С, тЬА, аЬрС выявляли на биочипах и при отсутствии мутаций относили к чувствительным к ШБ и ШИ, при наличии мутаций - к устойчивым к ШБ или ЩИ.
По результатам биочип-анализа у 47,4% (211 из 445) больных выявлены чувствительные к МБ и ЩИ штаммы МБТ. Мутации в генах гроБ, ка1С, тЬА и аЬрС были выявлены у 53,2% больных. Первичная устойчивость только к изониазиду определена в 20% (88 из 445), 2,5% (11 из 445) больных имели первичную устойчивость только к рифампици-ну. МБТ с множественной лекарственной устойчивостью выявлены у 30,3% (135 из 445) больных.
Таким образом, по результатам биочип-анализа в структуре лекарственной устойчивости отмечался высокий удельный вес штаммов МБТ с МЛУ.
Устойчивость к рифампицину в 95% случаев связана с мутациями в гене гроБ. Известно более 40 типов мутаций в этом гене, обусловливающих резистентность к рифампицину. В основном они сосредоточены в коротком сегменте гена гроБ, состоящем из 81 пар основания и кодирующем аминокислоты 507-533 позиций.
Анализ спектра мутаций гена в гроБ 146 рифам-пицин-резистентных образцов МБТ показал, что чаще всего точечные мутации встречались в 531 (58%), в 526 (18%), в 516 (9%), 511 (6,8%) и в 533 (6%)
ОПЫТ РЕГИОНОВ
кодонах. Мутации в 522-м и 512-м кодонах встречались с частотой от 0,7% до 1,4% (табл. 1).
Таким образом, у больных туберкулезом, проживающих в Кыргызской Республике, устойчивость МБТ к рифампицину чаще всего обусловлена мутациями в 531-м, 526-м и 516-м кодонах гена rpoB. Основной причиной устойчивости МБТ к рифампицину является мутация Ser531^Leu.
Таблица 1
Мутации гена rpoB M. tuberculosis, обусловливающие устойчивость к рифампицину
Анализ литературных данных показывает, что во всем мире наиболее распространены штаммы МБТ с мутацией в трех кодонах (531, 526 и 516). Однако частота их встречаемости в разных странах разная. В странах бывшего Советского Союза, Ближнего Востока и Юго-Восточной Азии штаммы МБТ с мутацией в 531-м кодоне (Ser531^Leu) встречаются гораздо чаще и составляют 50-70% [6, 7]. В Европейских странах частота встречаемости штаммов МБТ с мутацией Ser531^Leu ниже и составляет 30-50% [8, 9].
Устойчивость МБТ к изониазиду ассоциирована с мутациями в нескольких генах, основными из которых являются: ка1С, тЬА, и аЬрС.
Среди 223 изониазид-резистентных штаммов мутации гена ка1С встречались в 90,5% случаев, тЬА - в 9,05% и аЬрС - в 0,45% случаев (табл. 2). В гене ка1С выявлено 4 различных типа мутаций: Ser315^Thr встречалась в 88,7% случаев, Ser315^ Аэп, Ser315^Arg и Ser315^Asn встречались в 0,45% случаев.
Мутации в генах тЬА и аЬрС выявлены в 9,05% и 0,45% случаев соответственно. В гене тЬА обнаружены нуклеотидные замены в положении -15 и - 8 относительно сайта инициации трансляции (тЬА Т_15, тЬА Т_8). В промоторном участке гена аЬрС мутации идентифицированы в положениях -9 относительно сайта инициации транскрипции (аЬрС_9).
По литературным данным, штаммы МБТ с мутацией в 315-м кодоне гена ка1С обладают высокой устойчивостью к изониазиду и чаще регистрируются в странах с высокой распространенностью туберкулеза, таких как Латвия [10], Россия, Украина и Казахстан [11].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Кодоны гена rpoB Аминокислотные замены Нуклеотид-ные замены Число образцов с мутациями
абс. (%)
531 Ser ^ Leu TCG^ TTG 81 56
Ser ^ Trp TCG^ TGG 3 2
526 His ^ Arg CAC ^ CGC 6 4
His ^ Asp CAC ^ GAC 6 4
His ^ Tyr CAC ^ TAC 6 4
His ^ Leu CAC ^ CTC 6 4
His ^ Pro CAC ^ CCC 1 0,7
His ^ Asn CAC^AAC 2 1,4
516 Asp ^ Tyr GAC ^ TAC 11 7,6
Asp ^ Val GAC ^ GTC 2 1,4
511 Leu ^ Pro CTG ^ CCG 10 6,8
533 Leu ^ Pro CTG ^ CCG 9 6
512 Ser ^ Thr AGC^ACC 2 1,4
522 Ser ^ Leu TCG ^ TTG 1 0,7
Всего 146 100
Таблица 2
Мутации в генах katG, inhA и ahpC M. tuberculosis, обусловливающие устойчивость к изониазиду
Гены Кодоны Аминокис- Нуклеотид- Число
лотные ные замены образцов с
замены мутациями
абс. (%)
Ser ^ Thr AGC^ACC 198 88,7
katG 315 Ser ^ Asn AGC^AAC 1 0,45
Ser ^ Arg AGC^ACA 1 0,45
Ser ^ Gly AGC ^ GGC 1 0,45
328 Thr ^ Cys TGG ^ TTG 1 0,45
inhA 15 - C ^ T 19 8,6
8 T ^ G 1 0,45
ahpC 9 - G ^ A 1 0,45
Всего 223 100
Тест-система «ТБ-Биочип» позволяет проводить экспресс-диагностику Mycobacterium tuberculosis complex с одновременным определением мутаций в генах rpoB, katG, inhA, и oxyR-ahpC, обусловливающих устойчивость МБТ к рифампицину и изониазиду. Основной причиной устойчивости МБТ к рифампицину является мутация Ser531^Leu. Мутация Ser315^Thr гена katG является одной из основных причин устойчивости к изониазиду у штаммов МБТ, циркулирующих на территории Кыргызской Республики. Множественная лекарственная устойчивость МБТ обусловлена комбинированной мутацией Ser531^Leu (ген rpoB) и Ser315^Thr (ген katG).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ramaswamy S., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis //Tubercle and Lung Disease. - 1998. -Vol. 79, № 1. - P. 3-29.
2. Mikhailovich V., Lapa S., Grydunov D. et al. Identification of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains by Hybridization, PCR, and Ligase Detection reaction on Oligonucleotide Microchips // J. of Clinical Microbiology.
- 2001. - Vol. 39, № 7. - P. 2531-2540.
3. Михайлович В.М., Лапа С.А., Грядунов Д.А., и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микрочипе для обнаружения рифампицин резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - № 1. - С. 112-117.
4. Bartfai Z., Soomoskovi A., Kodmon C., et al. Molecular Characterization of Rifampin-Resistant Isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA Sequencing and the Line Probe Assay.// J.Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39, № 10. - P. 3736-3739.
5. Crofton J., Chaulet P., Maher D. Guidelines for the Management of Drug-Resistant Tuberculosis. Jeneva. -1997. - 55 с.
6. Лабораторная диагностика туберкулеза. // Под ред. Литвинова В.И., Мороза А.М. МНТПЦ борьбы с туберкулезом. - Москва: Медицина и жизнь, - 2006. - 170 с.
7. Kiepiela P., Bishop K., Smith A., et al. Genomic mutations in the katG, inhA, and ahpC genes are useful for the prediction of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from Kwazulu Natal, south Africa. Tuber. Lung Dis.
- 2000. - V. 80, № 1. - P. 47-56.
8. Matsiota-Bernard P., Vrioni G., Marinis E. Characterization of rpoB Mutations in Rifampin-resistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates from Greece. J.Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, № 1. - Р. 20-23.
9. Marttila H. J., Soini H., huovinen P., and Viljanen M.K. katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients. // Antimicrob. Agents chemother. - 1996. - Vol. 40, № 10. -Р. 2187-2189.
10. Bakonyte D., Baranauskaite A., Cicenaite J., et al. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical Isolates in Lithuania. Mycobacterium tuberculosis. - 2003. - Vol. 47, № 6. - P. 2009-2011.
11. Воронина Е.Н., Вихрова М.А., Храпов Е.А., и др. Мутация Ser315Thr - основная причина устойчивости к изониазиду у изолятов Mycobacterium tuberculosis, распространенных в Новосибирской и Кемеровской областях. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология - 2004. - № 3. - С. 8-11.
MUTATIONS IN RPOB, KATG, INHA M AHPC GENES OF RIFAMPICIN- AND ISONIAZID- RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS WHICH CIRCULATE IN KYRGYZ REPUBLIC
Zh.T. Isakova
SUMMARY
Analysis results of mutations in rpoB, katG, inhA h ahpC genes associated with rifampicin- and isoni-
azid- resistant Mycobacterium tuberculosis strains which circulate in the Kyrgyz Republic are given in the article. A total of 445 specimens were obtained from patients with pulmonary tuberculosis. Mutations of rpoB, katG, inhA and ahpC gene associated with rifampicin and isoniazid resistance were detected by biological chip test. 211 of 445 samples (47%) were found to be wild type MBT strains, while 135 (30%) samples contained mutations associated with RIF or INH resistance. The single primary drug resistance only to RIF was in 2,5% (11/445) patients and to INH was in 20% (88/445)patients multiple drug resistance was revealed in 30% (135/445) patients. Rifam-picin and isoniasid resistance of M. Tb strains isolated in Kyrgyzstan are concluded to be associated mostly with Ser531^Leu mutation of rpoB gene, Ser315^Thr mutation of katG gene.
Key words: M. tuberculosis, gene rpoB, katG, inhA, ahpC, drug resistivity.
УВАЖАЕМЫЕ АВТОРЫ СТАТЕЙ!
Убедительная просьба соблюдать требования к рукописям, представляемым в «СМЖ». Обращаем Ваше внимание, что работы, оформленные с нарушением требований к рукописям, представляемым в «СМЖ», не будут приниматься к рассмотрению. Единые требования к рукописям, представляемым в «Сибирский медицинский журнал», публикуются ежегодно в первом номере журнала и могут быть запрошены авторами по e-mail: medicina@tomsk.ru Редакционная коллегия «СМЖ»
