CC BY
24
Серия «Биология. Экология»
2011. Т. 4, № 4. С. 58-62 Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
И З В Е С Т И Я
Иркутского
государственного
университета
УДК 579.873.21:579.253.2
Лекарственная устойчивость различных генотипов Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулёзом в Иркутской области
111 2 А. А. Лац , С. Н. Жданова , О. Б. Огарков , С. И. Алексеева
1Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН, Иркутск 2Областной противотуберкулезный диспансер, Иркутск
Аннотация. Среди 140 штаммов М. tuberculosis (МБТ), полученных от больных лёгочным туберкулёзом в Иркутской области, проведён поиск взаимосвязей между генотипом МБТ, клиническим течением болезни и антибиотикоустойчивостью штамма. По итогам генотипирования методом MIRU-VNTR и определения де-леционного полиморфизма по 207-му региону в геноме микобактерий идентифицированы 88 % изолятов, значительная доля которых отнесена к эпидемически значимому семейству Beijing и ассоциирована с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Среди штаммов этого семейства выявлены 11 субтипов, две трети из них составляют наиболее распространённые субпопуляции M2 и M11. Среди Beijing-штаммов отмечен более высокий уровень первичной лекарственной устойчивости, чем среди представителей других генетических семейств.
Ключевые слова: микобактерии туберкулёза, генотипы, множественная лекарственная устойчивость, клиническое течение болезни.
Введение
Иркутская область относится к регионам с неблагоприятной обстановкой по уровню распространенности туберкулёза - согласно данным Роспотребнадзора, болен каждый 300-й житель Приангарья [2]. Росту заболеваемости в определённой степени способствуют снижение эффективности лечения вследствие распространения штаммов микобактерии туберкулёза М. tuberculosis (МБТ), обладающих множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Так, число больных с МЛУ МБТ в России с 1999 по 2008 гг. выросло вдвое [1; 7]. Последствиями развития лекарственно устойчивых форм туберкулёза являются утяжеление инфекционного процесса, увеличение сроков госпитализации больных, усиление побочных эффектов химиотерапии [5; 6]. Также известно, что доминирующий в России генотип «Пекин» (Beijing) [7] отличается от остальных выраженными патогенными свойствами, проявляющимися в виде повышенной вирулентности, ассоциации с лекарственной устойчивостью и высокой трансмиссивности [11]. Поэтому научный и практический интерес представляет изучение взаимосвязи антибиотикорезистентности и генотипов штаммов МБТ у больных туберкулёзом с разным клиническим течением болезни, что и явилось целью настоящей работы.
Материалы и методы
Для исследования были отобраны 140 штаммов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулёзом, постоянных жителей Иркутской области, преимущественно славянской национальности, находившихся на лечении в Иркутском противотуберкулёзном диспансере. Среди когорты больных впервые выявленными являлись 105 пациентов, a 35 человек с хроническим течением болезни и рецидивами.
В ходе исследования было проведено гено-типирование выборки клинических штаммов М. tuberculosis с использованием двух подходов: методом MIRU-VNTR [8], основанным на ПЦР-амплификации тандемных повторов 12 локусов ДНК микобактерий и путём определения делеционного полиморфизма (large sequence polymorphisms - LSPs) в геноме микобактерий. Последним методом исследованы различия по 207-му региону (RD 207), делеция в котором однозначно указывает на пекинский генотип М. tuberculosis [9]. Для идентификации генетических семейств использовались открытая база данных и пакет программ MIRU-VNTRplus [10]. Субтипы пекинского семейства были определены согласно предложенной Мокроусовым классификации MIRU-VNTR-профилей [11]. Для оценки антибиотикорези-стентности штаммов использованы результаты
теста на лекарственную чувствительность методом абсолютных концентраций на противотуберкулёзные препараты (ПТП) 1-го и 2-го ряда на плотной среде Левенштейна - Йенсена у больных с бактериовыделением по результатам посева мокроты и с помощью автоматизированной системы на бактериологическом анализаторе BACTEC MGIT 960. Статистическая обработка данных проведена с использованием программы Excel из пакета MS Office 2003.
Наиболее часто встречающимися оказались субпопуляции Beijing М2 и Beijing М11: 41 (29,3 %) и 25 (17,8 %) соответственно, что отражает общую картину их распространения и роль в эпидемическом процессе в России [2; 4; 11]. Остальные члены этого генетического семейства (29 штаммов) представлены гетерогенной группой подтипов: Beijing М4 -
3 штамма (2,1 %), субтипы М7, М18 и М19 - по
2 (1,4 %), М7, М8, М11,2, М21, М33, М40, М44, М75, М87, М122 - по 1 (0,7 %) (рис. 2). Методом делеционного анализа также были обнаружены 17 (12,1 %) неклассифицированных штаммов Beijing.
Результаты и обсуждение
С помощью упомянутых методов геноти-пирования до уровня генетического семейства и субтипов нами были идентифицированы 87,1 % изолятов (рис. 1). Среди них 101 представитель семейства Beijing (72 %), 8 - Ural (5,7 %), 4 - LAM (2,9 %), 5 - X (3,6 %), 2 -Haarlem (1,4 %), а также по 1 (0,7 %) штамму из семейств Uganda I и S. К группе неклассифицированных штаммов Orphan были отнесены 18 (12,9 %) изолятов.
Антибиотикорезистентность изучена среди больных с впервые выявленным диагнозом туберкулёза и с хроническим его течением. У больных отмечено преобладание (76 %) антибиотикорезистентных форм туберкулёза над чувствительными, большая часть устойчивых штаммов выделена от впервые выявленных больных (51 %), т. е. в исследуемой нами выборке клинических изолятов велика доля возбудителей с первичной лекарственной устойчивостью (рис. 3, табл. 1). Наиболее распространёнными комбинациями при МЛУ были: изониазид + рифампицин + стрептомицин (32 %), изониазид + рифампицин + этамбутол (25 %) и изониазид + рифампицин + канамицин (12 %).
В группе штаммов наиболее часто встречающегося генотипа BeijingМ2 были выявлены как устойчивые, так и чувствительные штам-
мы: в 11 случаях они сохранили чувствительность (9 из них (6,4 %) обнаружены у впервые выявленных больных), в остальных 30 имели лекарственную устойчивость. Среди моноус-тойчивых чаще регистрировалась устойчивость к канамицину (4,3 %), этабутолу (2,8 %) и пара-аминосалициловой кислоте (2,8 %), а в единичных случаях к стрептомицину и рифампицину (0,7 %). В 10 случаях (7 %) установлена МЛУ.
. 120 -|
Beijing Orphan Ural X LAM Haarlem Uganda 1 S
I впервые выявленные | хронические
Рис. 1. Генотипы МБТ, выделенные от больных, находящихся на лечении в Иркутском противотуберкулёзном диспансере в 2010-2011 гг.
неклассифицированные
Рис. 2. Соотношение разных субпопуляций генотипа МБТ Beijing
Рис. 3. Распределение чувствительности и анти-биотикорезистентности МБТ
Среди второй по численности группы штаммов M11 чувствительность к антибиотикам сохранена лишь в одном случае впервые выявленного туберкулёза. Единичные штаммы обладали моноустойчивостью к изониазиду, рифампицину, парааминосалициловой кислоте (по 0,7 %). В отличие от остальных субпопуляций семейства Beijing доля хронических больных, от которых выделены штаммы с МЛУ, на треть выше, чем впервые выявленных - (6,4 % против 4,3 %).
Таблица 1
Распределение чувствительности и устойчивости к антибиотикам среди различных генотипов
М. tuberculosis
чувстви- тельные моно-и полирези-стентные МЛ У общее коли- чество
Beijing 20 39 42 101
non- Beijing 13 20 6 39
По результатам анализа по RD 207 к группе неклассифицированных штаммов Beijing были отнесены 17 изолятов. У пациентов с впервые выявленными случаями туберкулёза более трети штаммов (5 %) сохранили чувствительность, часть обладала МЛУ (4,3 %), у остальных (2,8 %) отмечались моно- и полирезистентность.
Для когорты малочисленных представителей подтипов М4, М7, М8, М11,2, М18, М19, М21, М33, М40, М44, М75, М87 за исключением М122 характерна ЛУ вне зависимости от клинического течения болезни, доля МЛУ-штаммов составила 7 % от общей выборки и 20 % от штаммов с МЛУ (10). Также для штаммов с полирезистентностью характерны комбинации стрептомицин + изониазид и стрептомицин + этамбутол.
В совокупности среди штаммов генотипа Beijing чувствительность сохранена в 20 случаях (14,3 %), преимущественно у впервые выявленных больных. Превалирующим оказалось число пациентов с моно/полирезистентностью и МЛУ - 39 (27,8 %) и 42 (30 %) соответственно, большую часть из них также составили впервые выявленные больные. По результатам данного исследования подтверждена важная роль семейства Beijing в распространении устойчивых форм туберкулёза, ассоциированных с МЛУ (х2 = 4,760, p = 0,029).
В семействах Ural, LAM, X, представленных меньшим количеством, отмечается равномерное распределение штаммов по антибиоти-коустойчивости.
Единичные штаммы S и Uganda I, выделенные от впервые выявленных больных, сохраняли чувствительность к антибиотикам, а представитель Haarlem имел устойчивость к изо-ниазиду со стрептомицином.
Среди неклассифицированных штаммов Orphan шесть штаммов (4,3 %) сохранили чувствительность, у двух изолятов (1,4 %) отмечена МЛУ, остальные обладали моно- и полирезистентностью.
Выводы
По результатам данного исследования клинические штаммы, отнесённые к превалирующему семейству Beijing (72,0 %), более часто были ассоциированы с лекарственной устойчивостью, нежели представители других генетических семейств. Эта связь была установлена как среди всей выборки больных (%2 = 7,82, p = 0,020), так и среди впервые выявленных (х2 = 8,24, p = 0,016). Вместе с тем внутри семейства Beijing представлены чувствительные формы, ассоциированные с группами M2 и неклассифицированными штаммами.
Выявлено разнообразие генотипов семейства Beijing. Вся когорта малочисленных представителей подтипов М4, М7, М8, М11,2, М18, М19, М21, М33, М40, М44, М75, М87 отличается полирезистентностью и множественной лекарственной устойчивостью.
Таким образом, генотипирование штаммов МБТ обеспечивает выявление эпидемически значимых семейств M. tuberculosis, что способствует совершенствованию мониторинга за туберкулезом путём изучения молекулярных особенностей распространения возбудителя туберкулёза.
Литература
1. Генотипическая характеристика M. tuberculosis - возбудителей остропрогрессирующего деструктивного туберкулёза легких / О. В. Воронкова [и др.] // Бюл. сибирской медицины. - 2011. - № 1. -С. 12-18.
2. Пресс-релиз ко дню борьбы с туберкулёзом
[Электронный ресурс] // УФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Иркут. обл. : сайт. - URL:
http://38.rospotrebnadzor.ru/ press/ release/54902
3. Применение делеционного анализа по RD 105 для выявления генотипа Пекин Mycobacterium tuberculosis / С. Н. Жданова [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 2 (78). - С. 194-197.
4. Савилов Е. Д. Пекинский генотип M. tuberculosis / В. В. Синьков, О. Б. Огарков // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2010. - № 4. -С. 50-53.
5. Современные тенденции эпидемиологической ситуации по туберкулёзу в России / Т. П. Филиппова [и др.] // Сиб. медиц. журн. - 2009. - № 7. -С. 13-16.
6. Характеристика множественной лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам в Республике Беларусь / Е. М. Скрягина [и др.] // Междунар. Евро-Азиатский конгресс по инфекционным болезням. - Витебск, 2008. - Т. 1. -С. 28-29.
7. Шилова М. В. Туберкулёз в России в 2008 году / М. В. Шилова. - М, 2009. - 144 с.
8. Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive
units / P. Supply [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2001. -Vol. 39, N 10. - P. 3563-3571.
9. Major Mycobacterium tuberculosis Lineages Associate with Patient Country of Origin / B. Reed Michael [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, N 7. - P. 1119-1128.
10. MIRU-VNTRplus a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria / T. Weniger [et al.] // Nucleic Acids Res. -2010. - Vol. 38, Suppl. - P. 326-331.
11. Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in Russia: in Search of Informative Variable-Number Tandem-Repeat Loci / I. Mokrousov [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46, N 11. - P. 3576-3584.
Multidrug resistance of different genetic families of M. tuberculosis in patients with tuberculosis of the Irkutsk region (Eastern Siberia)
A. A. Lats1, S. N. Zhdanova1, O. B. Ogarkov1, S. I. Alekseeva2
Scientific Centre of the Family Health and Human Reproduction Problems SB RAMS, Irkutsk 2Regional antitubercular dispensary, Irkutsk
Abstract. We investigated 140 strains of M. tuberculosis, isolated from patients with pulmonary tuberculosis in the Irkutsk region. The association of mycobacterial genotype, the clinical course of disease and antibiotic resistance of strains were studied. As a result of MIRU-VNTR-analysis, based on PCR amplification of tandem repeats of 12 micobacteria DNA loci and by identifying the deletion polymorphism in the genome of Mycobacterium (large sequence polymorphisms - LSPs) in 207 region 88 % of the isolates were identified, a significant proportion of which is classified as epidemiologically significant Beijing family and is associated with multidrug resistance (MDR). 11 subtypes of this family were founded; two thirds of founded subtypes were common M2 and M11 strains of Beijing genotype. The primary drug resistance patterns varied significantly between Beijing and non-Beijing strains. High level of drug resistance was revealed among Beijing strains.
Keywords: tuberculosis mycobacteria, genotypes, multi-drug-resistant, the clinical course of disease
Лац Анна Александровна
Институт эпидемиологии и микробиологии
НЦ ПЗСРЧ СО РАМН
664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3 младший научный сотрудник тел. (3952)33-34-25 Е-шаП: hh0413@yandex.ru
Lats Anna Aleksandrovna
Institute of Epidemiology and Microbiology,
Scientific Centre of Family Health and Human
Reproduction Problems SB RAMS
3 K. Marx St., Irkutsk, 664025
junior research scientist,
phone: (3952)33-34-25
Е-mail: hh0413@yandex.ru
Жданова Светлана Николаевна
Институт эпидемиологии и микробиологии
НЦ ПЗСРЧ СО РАМН
664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3
кандидат медицинских наук,
старший научный сотрудник
тел. (3952)33-34-25
Е-таіІ: svetnii@mail.ru
Zdanova Svetlana Nikolaevna
Institute of Epidemiology and Microbiology,
Scientific Centre of Family Health and Human
Reproduction Problems SB RAMS
3 K. Marx St., Irkutsk, 664025
Ph. D. in Medicine, senior research scientist,
phone: (3952)33-34-25
Е-mail: svetnii@mail.ru
Огарков Олег Борисович
Институт эпидемиологии и микробиологии
НЦ ПЗСРЧ СО РАМН
664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3 кандидат медицинских наук, заведующий
Ogarkov Oleg Borisovich
Institute of Epidemiology and Microbiology,
Scientific Centre of Family Health and Human
Reproduction Problems SB RAMS
3 K. Marx St., Irkutsk, 664025
Ph. D. in Medicine, Head of laboratory
лабораторией эпидемиологически и социально-значимых инфекций тел. (3952)33-34-25 Е-шаП: obogarkov@yandex.ru
Алексеева Светлана Ивановна
Иркутский областной противотуберкулёзный
диспансер
664047, г. Иркутск, ул. Терешковой, 59 врач-фтизиатр тел. (3952)38-72-61 Е-шаП: SIA372@yandex.ru
phone: (3952)33-34-25 Е-mail: obogarkov@yandex.ru
Alexeeva Svetlana Ivanovna
Irkutsk regional antitubercular dispensary
59 Tereshkova St., Irkutsk, 664047 tuberculotherapist phone: (3952)38-72-61 Е-mail: SIA372@yandex.ru
