CC BY
63
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №1, 2016
The total of 54 patients with chronic periodontitis of different severity was tested using real-time PCR (Dentoflor kit). The group included 38 patients with chronic gastritis. For the first time, a higher prevalence of Treponema denticola in periodontium of males in comparison with females was demonstrated. The patients with chronic gastritis had more human genome DNA at their periodontium than healthy individuals. Non-parametric statistical analysis demonstrated high association of periodontium colonization with T. forsythensis and T. denticola (but not
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, and Prevotella intermedia) with the severity of the chronic periodontitis.
Key words: microbiome, periodontium, gastritis, real-time PCR, dentoflor, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tanerella forsythensis, Treponema denticola
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-26-30
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.873.21:579.253]:577.21.083
Вязовая А.А.1, Мокроусов И.В.1, Журавлев В.Ю.2, СоловьеваН.С.2, Оттен Т.Ф.2, Маничева О.А.2,
Вишневский Б.И.2, Нарвская О.В.1, 2
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУЛЬТИРЕзИСТЕНТНЫХ шТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ НА СЕВЕРО-зАПАДЕ РОССИИ
1ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 197101, Санкт-Петербург, Россия; 2ФГБУ НИИ фтизиопульмонологии Минздрава России, 191036, Санкт-Петербург, Россия
Целью исследования являлось получение генотипической характеристики мультирезистентных (т. е. устойчивых, по крайней мере, к рифампицину и изониазиду) штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных в 2011-2012 гг. от больных туберкулезом на северо-западе России. Сполиготипирование 195 штаммов M. tuberculosis выявило их принадлежность к генетическим семействам Beijing (n = 162), LAM (n = 15), H3/URAL (n = 14), а также T, Haarlem и X. Среди 14 сполиготипов преобладали SIT1 (Beijing), SIT42 (LAM) и SIT262 (H3/URAL). Независимо от генотипа все изученные штаммы M. tuberculosis были устойчивы к стрептомицину. Мультирезистентность включала устойчивость к этионамиду (56%), амикацину (31%), канамицину (40%) и капреомицину (33%). Доля устойчивых к этамбутолу штаммов Beijing и non-Beijing составляла 71% (n = 115) и 42% (n = 14) (p < 0,05) соответственно. Среди мультирезистентных штаммов M. tuberculosis на северо-западе России продолжают доминировать представители генетического семейства Beijing (83%).
Ключевые слова: M. tuberculosis; мультирезистентность; сполиготипирование; генотип Beijing.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-30-33
Одной из причин неблагоприятной глобальной эпидемической ситуации по туберкулезу является распространение так называемых мультирезистентных (англ. multidrug-resistant, MDR) штаммов Mycobacterium tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), которая характеризуется наличием одновременной устойчивости к наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) первого ряда - изониазиду и рифампицину. В 2013 г. в мире было выявлено около 480 000 случаев туберкулеза c МЛУ возбудителя [1]. По оценкам ВОЗ, примерно у 9% этих пациентов был диагностирован туберкулез c широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), т. е. МЛУ в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и одному из инъекционных препаратов второго ряда (ка-намицин, амикацин, капреомицин).
Несмотря на снижение заболеваемости туберкулезом в Северо-Западном Федеральном Округе (СЗФО) Российской Федерации (РФ) с 57,5 в 2010 г. до 52,2 на 100 тыс. населения в 2012 г., каждый четвертый новый случай был обусловлен МЛУ-штаммом возбудителя [2]. Так, в 2012 г. распространенность туберкулеза c множественной лекарственной устойчивостью возбудителя
Для корреспонденции: Вязовая Анна Александровна, annavyazovaya@gmail.com
составила 21,2 на 100 тыс. населения (РФ - 24,3), в том числе среди впервые зарегистрированных больных - 4,4 (РФ - 4,о) (mednet.ru).
Использование молекулярно-генетических методов позволяет оценить частоту определенных генотипов в структуре популяций M. tuberculosis, в частности среди МЛУ штаммов.
Цель исследования состояла в получении генотипической характеристики мультирезистентных штаммов M. tuberculosis, выделенных в 2011-2012 гг. от больных туберкулезом на северо-западе России.
Материалы и методы
Изучены штаммы M. tuberculosis, выделенные от больных легочным (n = 142) и внелегочным (n = 53) туберкулезом в Санкт-Петербурге и Ленинградской области в 2011-2012 гг. Культивирование микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена и определение лекарственной устойчивости изолятов к ПТП осуществляли стандартным непрямым методом абсолютных концентраций в соответствии с Инструкцией по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза [Приказ Министерства здравоохранения РФ № 109 от 21 марта 2003 г.] и c помощью автоматизированной системы BACTEC MGIT 960. Хромосомную ДНК выделяли из чистых культурM. tuberculosis [3]. Генотипирование изолятов M. tuberculosis осуществляли методом сполиготипиро-вания (spoligotyping - spacer oligotyping) [4]. Метод основан на анализе полиморфизма 43 нуклеотидных последовательностей (спейсеров), разделяющих прямые повторы (Direct Repeats, DR), линейно расположенные в DR области хромосомы M. tuberculosis. Амплификацию DR-области ДНК возбудителя, контрольных штаммов M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG P3 проводили со специфическими праймерами Dra (5'-биотин GGTTTTG-GGTCTGACGAC) и Drb (CCGAGAGGGGACGGAAAC) (Син-тол, Москва) [4]. Для постановки ПЦР в режиме: 96oC - 3 мин, 20 циклов: 96oC - 1 мин, 55oC - 1 мин, 72oC - 30 с; 72oC - 30 с использовали реагенты (Силекс, Москва) и 1,0 мкл ДНК. Продукты ПЦР-амлификации DR области хромосомы изолятов, меченные биотином, в соответствии с указаниями производителя гибридизовали с 43 спейсерными последовательностями ДНК, нанесенными на мембрану (Isogen Bioscience BV, Belgium), которую затем экспонировали на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL (GE Healthcare). Результаты сполиготипирования оценивали визуально, отмечая наличие (в виде темных пятен на пленке) каждого из 43 спейсеров, и представляли с помощью бинарного кода: 1 (наличие спейсера) и 0 (отсутствие спейсера) в формате Excel. Для классификации полученных профилей спо-лиготипирования использовали международную компьютерную базу данных SITVITWEB (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/
Сполигопрофили МЛУ штаммов M. tuberculosis
Генотип Сполиготип* Сполигопрофиль* * Число штаммов
Beijing 1 155
(n = 162) 265 3
269 4
LAM 42 8
i i 252 3
496 4
H3/ 262 9
URAL*** 777 1
(n = 14)
1134 3
3781 1
T (n = 2) 53 1
154 1
Haarlem 36 1
(n = 1)
X(n = 1) 1564 1
Примечание.* - международный код сполиготипа (SIT), согласно базе данных SITVITWEB
(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/); ** - порядок расположения спейсеров (1-43) на мембране; ■ - наличие сигнала гибридизации; □ - отсутствие сигнала гибридизации; *** - согласно базе данных МЖи-УЫТГр1^ (http://www.miru-vntrplus.org).
SITVIT_ONLINE/). Принадлежность изолятов к семейству LAM была определена методом ПЦР-ПДРФ на основе выявления мутации GAG ^ GAA в кодоне 103 гена Ag85C (Rv0129c), специфической для этого семейства [5]. Вывление кластера B0/W148 генотипа Beijing проводили с помощью мультиплексной ПЦР, определяя наличие специфической инсерции IS6110 в межгенном участке Rv2664-Rv2665 [6]. Обработку данных проводили с использованием программы EpiCalc2000, вычисляя значение OR (odds ratio). Различия между группами считали статистически значимыми при доверительном интервале 95% (p < 0,05).
Результаты и обсуждение
Генотипирование 195 МЛУ изолятов M. tuberculosis выявило их принадлежность к 6 генотипам (генетическим линиям/семействам): Beijing, Latin American-Mediterranean (LAM), H3/Ural, T, Haarlem и X (см. таблицу). Среди 14 сполиготипов преобладали SlT1 (Beijing), SIT42 (LAM) и SIT262 (H3/URAL). Из таблицы видно, что в изученной выборке доминировали штаммы генотипа Beijing (83%), доля которых в последние десятилетия варьировала от 35 до 60% в общей популяции возбудителя туберкулеза на территориях России [7-14]. При этом принадлежность к генотипу Beijing ассоциирована с МЛУ возбудителя, что приводит к более продолжительному периоду бактериовыделения, развитию тяжелых деструктивных форм туберкулеза легких, и требует специальных схем химиотерапии [7, 12, 15]. Выявленное нами превалирование Beijing в структуре генотипов МЛУ штаммов согласуется с данными, полученными в Приволжском (Самара и Самарская область) и Уральском регионах (Екатеринбург и Свердловская область) - 84,5 и 79,2% соответственно [9, 14].
Доля генотипа Beijing у МЛУ штаммов, выделенных от больных внелегочным туберкулезом, превышала таковую у штаммов, полученных от больных туберкулезом легких, и составляла 92% против 80% (OR = 0,32 [0,11; 0,95], p = 0,03]), соответственно.
В нашем исследовании с помощью мультиплексной ПЦР установлена принадлежность 62 (38%) из 162 штаммов Beijing к кластеру B0/W148 [6]. Так, от
больных туберкулезом легких и внелегочным туберкулезом было выделено 40 (35%) и 22 (45%) штаммов B0/W148 соответственно. При этом ШЛУ была выявлена у 17 (27%) из 62 мультирезистентных штаммов кластера Beijing B0/W148 и 27 (27%) из 100 мультирезистент-ных штаммов Beijing других вариантов. Согласно результатам недавних исследований штаммы кластера B0/W148 представляют «успешный» российский клон возбудителя туберкулеза [16]. Штаммы данного клона отличает повышенная вирулентность, которая проявляется высокой способностью к распространению (транс-миссивность), в том числе в стационарах, более быстрыми, по сравнению с другими вариантами Beijing, темпами роста популяции на территории России и ассоциацией с МЛУ [6, 7, 17-20].
У штаммов M. tuberculosis «non-Beijing» преобладал второй по распространенности в России генотип LAM, который был представлен сполиготипами SIT42, SIT252, SIT496 (см.таблицу). Из них SIT42 (53%) - сполиготип, наиболее выявляемый в европейской популяции LAM. Штаммы SIT496 (семейство T5-RUS1 согласно SITVITWEB) были отнесены к генотипу LAM с учетом данных определения однону-клеотидных полиморфизмов в гене Rv0129c [5]. Частота встречаемости штаммов M. tuberculosis семейства LAM в России колеблется от 3-21% на территориях СевероЗападного, Уральского, Сибирского, Дальневосточного регионов до 40% в Центральном и Приволжском регионах [10, 12-14, 21]. В ряде исследований показана ассоциация генотипа LAM с МЛУ штаммов, циркулирующих на территориях Центрального и Приволжском регионов России и в восточной Украине [12, 21].
Генотип Н3 (согласно SITVITWEB) или URAL (MIRU-VNTRplus) характеризуется сполигопрофилем, в котором отсутствуют спейсеры с 29 по 31 и с 33 по 36. H3/URAL представляли 14 штаммов (7%) четырех сполиготипов, причем наиболее многочисленным был SIT262 (см. таблицу), который преобладает также в структуре сполиготипов данного семейства и на территории Уральского региона [14].
Штаммы M. tuberculosis семейства T принадлежали к сполиготипам SIT53 и SIT154 (см. таблицу). При этом ранее нами установлено, что сполиготип SIT53, один из наиболее часто выявляемых на территории СЗФО, представлен преимущественно чувствительными к ПТП штаммами M. tuberculosis [7, 13], что может объяснять малую долю данного генотипа в изученной выборке МЛУ изолятов.
Доля МЛУ штаммов, устойчивых к любым трем ПТП (включая изониазид и рифампицин), составляла 6% (n = 12), к четырем-пяти - 26% (n = 52), шести-семи -42% (n = 81), восьми-девяти - 24% (n = 47). Три штамма были резистентны ко всем изученным ПТП (стрептомицин, этамбутол, пиразинамид, этионамид, офлоксоцин, амикацин, канамицин, капреомицин).
Все МЛУ штаммы независимо от принадлежности к
MOЛEKУЛЯPHAЯ ГЕШТИКА, MИKPOБИOЛOГИЯ И ВИPУСOЛOГИЯ №1, 201б
группам Beijing/«non-Beijing» проявляли устойчивость к стрептомицину, что в целом характерно для российских штаммов M. tuberculosis; около половины (99 из 195) изолятов были резистентны к пиразинамиду. MЛУ сочеталась с устойчивостью к ПТП второго ряда - этио-намиду (5б%), амикацину (31%), канамицину (40%) и капреомицину (33%). Сочетание MЛУ с устойчивостью к другим ПТП у штаммов различных генотипов, особенно Beijing, существенно снижает эффективность химиотерапии туберкулеза, что способствует формированию качественно нового резервуара возбудителя.
Доля устойчивых к этамбутолу штаммов Beijing и non-Beijing различалась и составляла 71% (n = 115) и 42% (n = 14) (OR = 3,32 [1,54; 7,17], p < 0,05) соответственно. Резистентностью ко всем ПТП первого ряда обладали 38% (n = б1) штаммов генотипа Beijing и 30% (n = 10) штаммов non-Beijing.
В группе «non-Beijing» б1% (20 из 33) штаммов обладали резистентностью к офлоксацину, что превышало данный показатель в группе Beijing - 42% (б8 из 1б2) штаммов (OR = 2,13 [0,99; 4,57], p = 0,05). ШЛУ обладали 59 (30%) из 195 мультирезистентных штаммов M. tuberculosis, причем 44 (75%) из них принадлежали к генотипу Beijing, 9 (15%) - LAM, 5 (8%) - H3/URAL и один - T.
Таким образом, показано, что среди MЛУ штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в России, в течение десятилетий доминируют штаммы генетического семейства Beijing, доля которых на Северо-Западе России в 2011-2012 гг. превысила 80%. В группе «non-Beijing» MЛУ штаммы M. tuberculosis генотипов LAM и H3/URAL присутствовали практически в равных долях (45,5% и 42,4% соответственно).
Благодарности
Авторы благодарят проф. H. Растоги (Nalin Rastogi) и Д. Кувэна (David Couvin) за обработку данных, присвоение обозначений SIT и генетических линий согласно базе данных Института Пастера Гваделупы (Institut Pasteur de la Guadeloupe) SITVIT2.
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (PHФ) (грантовое соглашение № 14-14-00292).
Сведения об авторах:
Вязовая Анна Александровна - канд.биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной микробиологии ФБУИ HHH эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, e-mail: annavyazovaya@gmail.com
Ыокроусов Игорь Владиславович - д-р биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории молекулярной микробиологии ФБУИ ИИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера;
Журавлев Вячеслав Юрьевич - канд. мед. наук, рук. отдела лабораторной диагностики ФГБУ Санкт-Петербургский КИИ фтизиопульмонологии;
Соловьева Шталья Сергеевна - зав. бактериологической лабораторией ФГБУ Санкт-Петербургский ПИИ фтизиопульмонологии;
Oттен Татьяна Фердинандовна - д-р мед. наук, науч. консультант лаборатории этиологической диагностики ФГБУ Санкт-Петербургский HИИ фтизиопульмонологии;
Ыаничева Oльга Алексеевна - д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаборатории этиологической диагностики ФГБУ Санкт-Петербургский HИИ фтизиопульмонологии;
Вишневский Борис Израилевич - д-р мед. наук, проф., главный специалист лаб. этиологической диагностики ФГБУ Санкт-Петербургский HИИ фтизио-пульмонологии;
Шрвская Oльга Викторовна - д-р мед. наук, проф.,
зав. лабораторией молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.
ЛИТЕРАТУРА
1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2014. WHO/ HTM/TB/2014.08. Geneva: WHO; 2014.
2. Инфекционная заболеваемость в субъектах Российской Федерации за 2011—2012 гг. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2013; ч. 3.
3. Van Embden J., Cave M., Crawford J., Dale J., Eisenach K., Gicquel B. et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 406-9.
4. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J. Clin. Microbiol. 1997; 35 (4): 907-14.
5. Gibson A., Huard R., Gey van Pittius N., Lazzarini L., Driscoll J., Kurepina N. et al. Application of sensitive and specific molecular methods to uncover global dissemination of the major RDRio Sublineage of the Latin American-Mediterranean Mycobacterium tuberculosis spoli-gotype family. J. Clin. Microbiol. 2008; 46 (4): 1259-67.
6. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Otten Т., Jiao W., Gomes L. et al. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (11): 3757-9.
7. Narvskaya O., Mokrousov I., Otten Т., Vishnevsky B. Molecular markers: application for studies of Mycobacterium tuberculosis population in Russia. In: Read M.M., Ed. Trends in DNA Fingerprinting Research. New York: Nova Science Publishers; 2005: 111-25.
8. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A., Nizovtseva N., Bjune G., Caugant D. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia. J. Clin. Microbiol. 2002; 40 (6): 1930-7.
9. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V., Ruddy M., Kuznetzov S., Zakharova S. et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia. J. A. M. A. 2005; 293 (22): 2726-31.
10. Baranov A., Mariandyshev A., Mannsaker Т., Dahle U., Bjune G. Molecular epidemiology and drug resistance of widespread genotypes of Mycobacterium tuberculosis in northwestern Russia. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2009; 13 (10): 1288-93.
11. Mokrousov I., Otten Т., Zozio Т., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A. et al. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009; 55: 13-22.
12. Dubiley S., Ignatova A., Mukhina Т., Nizova A., Blagodatskikh S., Ste-panshina V. et al. Molecular epidemiology of tuberculosis in the Hula area, Central Russia, before the introduction of the Directly Observed fherapy Strategy. Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16 (9): 1421-6.
13. Вязовая А.А., Журавлев В.Ю., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Павлова Е.П., Кришевич В.В. и др. Характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в Псковской области. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 6: 27-31.
14. Умпелева Т.В., Вязовая А.А., Кравченко М.А., Еремеева Н.И., Нарв-ская О.В. Генотипирование изолятов Mycobacterium tuberculosis группы non-Beijing, циркулирующих в Уральском регионе. Уральский медицинский журнал. 2013; 2: 150-4.
15. Mokrousov I., Otten T., Manicheva O., Potapova Y., Vishnevsky B., Narvskaya O. et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52 (8): 2937-9.
16. Mokrousov I. Insights into the origin, emergence, and current spread of a successful Russian clone of Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 2013; 26 (2): 342-60.
17. Marttila H., Soini H., Eerola E., Vyshnevskaya E., Vyshnevskiy B., Otten Т. et al. A Ser315fhr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St. Petersburg area in Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 1998; 42 (9): 2443-5.
18. Portaels F., Rigouts L., Bastian I. Addressing multidrug-resistant tuberculosis in penitentiary hospitals and in the general population of the former Soviet Union. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999; 3 (7): 582-8.
19. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных на Северо-Западе России. Проблемы туберкулеза. 1999; 3: 39-41.
20. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе: Дисс. ... д-ра мед. наук. СПб.; 2003.
21. Dymova M., Liashenko O., Poteiko P., Krutko V., Khrapov E., Filipen-ko M. Genetic variation of Mycobacterium tuberculosis circulating in Kharkiv Oblast, Ukraine. BMC Infect. Dis. 2011; 28 (11): 77.
Поступила 29.12.14
REFERENCES
1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2014. WHO/ HTM/TB/2014.08. Geneva: WHO; 2014.
2. Infectious Morbidity in the Subjects of Russian Federation in 2011—2012. Information Collection of Statistical and Analytical Materials. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2013; part 3. (in Russian)
3. Van Embden J., Cave M., Crawford J., Dale J., Eisenach K., Gicquel B. et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 406-9.
4. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J. Clin. Microbiol. 1997; 35 (4): 907-14.
5. Gibson A., Huard R., Gey van Pittius N., Lazzarini L., Driscoll J., Kurepina N. et al. Application of sensitive and specific molecular methods to uncover global dissemination of the major RDRio Sublineage of the Latin American-Mediterranean Mycobacterium tuberculosis spoli-gotype family. J. Clin. Microbiol. 2008; 46 (4): 1259-67.
6. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Otten T., Jiao W., Gomes L. et al. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (11): 3757-9.
7. Narvskaya O., Mokrousov I., Otten T., Vishnevsky B. Molecular markers: application for studies of Mycobacterium tuberculosis population in Russia. In: Read M.M., Ed. Trends in DNA Fingerprinting Research. New York: Nova Science Publishers; 2005: 111-25.
8. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A., Nizovtseva N., Bjune G., Caugant D. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia. J. Clin. Micro-biol. 2002; 40 (6): 1930-7.
9. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V., Ruddy M., Kuznetzov S., Zakharova S. et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia. J. A. M. A. 2005; 293 (22): 2726-31.
10. Baranov A., Mariandyshev A., Mannsäker T., Dahle U., Bjune G. Molecular epidemiology and drug resistance of widespread genotypes of Mycobacterium tuberculosis in northwestern Russia. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2009; 13 (10): 1288-93.
11. Mokrousov I., Otten T., Zozio T., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A. et al. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009; 55: 13-22.
12. Dubiley S., Ignatova A., Mukhina T., Nizova A., Blagodatskikh S., Ste-panshina V. et al. Molecular epidemiology of tuberculosis in the Tula area, Central Russia, before the introduction of the Directly Observed Therapy Strategy. Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16 (9): 1421-6.
13. Vyazovaya A.A., Zhuravlev V.Yu., Mokrousov I.V., Otten T.F., Pavlova E.P., Krishevich V.V. et al. Characteristics of Mycobacterium tuberculosis strains circulating in Pskov region. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 6: 27-31. (in Russian)
14. Umpeleva T.V., Vyazovaya A.A., Kravchenko M.A., Eremeeva N.I., Narvskaya O.V. Genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolate, non-Beijing group, circulating in Ural region. Ural'skiy meditsinskiy zhurnal. 2013; 2: 150-4. (in Russian)
15. Mokrousov I., Otten T., Manicheva O., Potapova Y., Vishnevsky B., Narvskaya O. et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobac-
terium tuberculosis strains from Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52 (8): 2937-9.
16. Mokrousov I. Insights into the origin, emergence, and current spread of a successful Russian clone of Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 2013; 26 (2): 342-60.
17. Marttila H., Soini H., Eerola E., Vyshnevskaya E., Vyshnevskiy B., Otten T. et al. A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St. Petersburg area in Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 1998; 42 (9): 2443-5.
18. Portaels F., Rigouts L., Bastian I. Addressing multidrug-resistant tuberculosis in penitentiary hospitals and in the general population of the former Soviet Union. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999; 3 (7): 582-8.
19. Narvskaya O.V., Mokrousov I.V., Otten T.F., Vishnevskiy B.I. Genetic marking of polyresistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in the north-west of Russia. Problemy tuberkuleza. 1999; 3: 39-41. (in Russian)
20. Narvskaya O.V. Genome Polymorphism of Mycobacterium Tuberculosis and its Significance in the Epidemic Process: Diss. St. Petersburg; 2003. (in Russian)
21. Dymova M., Liashenko O., Poteiko P., Krutko V., Khrapov E., Filipenko M. Genetic variation of Mycobacterium tuberculosis circulating in Kharkiv Oblast, Ukraine. BMC Infect. Dis. 2011; 28 (11): 77.
Received 29.12.14
MOLECULAR CHARACTERISTICS OF THE MULTIDRUG-RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS IN THE NORTHWEST RUSSIA
'Vyazovaya A. A., 'Mokrousov I. V., 2Zhuravlev V. Yu, 2Solovieva N. S, 2Otten T. F, 2Manicheva O. A., 2Vishnevsky B. I., '¿Narvskaya O. V.
'St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia; 2Research Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russia
The goal of this work was to study the genotypic characteristics of the multidrug-resistant (MDR, i.e., resistant to at least rifampicine and isoniazid) Mycobacterium tuberculosis strains isolated in 2011-2012 from tuberculosis (TB) patients in the Northwest Russia. Spoligotyping of 195 M. tuberculosis isolates identified 14 different spoligotypes and assigned isolates to the genetic families Beijing (n = 162, 83%), LAM (n = 15), H3/URAL (n = 14), as well as T, Haarlem and X. Spoligotypes SIT1 (Beijing), SIT42 (LAM) and SIT262 (H3/URAL) were the most prevalent. Irrespective to the genotype, all the isolates were resistant to streptomycin. The multidrug resistance was accompanied by the resistance to ethionamide (56%), amikacin (31%), kanamycin (40%), and capreomycin (33%). The ethambutol resistance was found in 71% (n = 115) and 42% (n = 14) of the Beijing and non-Beijing strains, respectively (p < 0.05). In conclusion, the multidrug resistant M. tuberculosis population circulating in the Northwest Russia continues to be dominated by the Beijing family strains.
Key words: M. tuberculosis, multidrug resistance, spoligotyping, Beijing genotype
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-30-33
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.871.1:579.253].083.1
Бондарева О.С., Савченко С.С., Ткаченко Г.А., Леденева М.Л., Лемасова Л.В., Антонов В.А. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ шТАММОВ BURKHOLDERIA MALLEI НА ОСНОВЕ МЕТОДА
амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 400131, Волгоград
Развитие методов генотипирования возбудителя сапа обусловлено его высокой патогенностью, отсутствием эффективных мер профилактики и угрозой использования Burkholderia mallei в качестве биологического оружия. В данной работе предложена схема типирования штаммов возбудителя сапа на основе метода амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК (Different Region Analysis, DFR). Выбор вариабельных локусов, дифференциально присутствующих у различных штаммов возбудителя сапа, осуществлен на основе анализа аннотированных полногеномных последовательностей штаммов B. mallei. К 9 выбранным локусам сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды, оптимизированы условия амплификации дифференцирующих фрагментов в двух вариантах: с электро-форетической детекцией результатов и с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в формате стрипа. Оценка возможности применения метода DFR для генетической характеристики штаммов выполнена на 14 штаммах B. mallei. Определение генетических профилей исследуемых штаммов возбудителя сапа позволило установить, что разработанная схема DFR-типирования характеризуется высокой дискриминирующей силой (значение индекса Хантера-Гастона составило 0,92), воспроизводимостью, быстротой проведения анализа, легкостью интерпретации и возможностью использования в эпидемиологическом мониторинге за возбудителем сапа.
Ключевые слова: сап; Burkholderia mallei; генотипирова-ние; дифференцирующий фрагмент ДНК.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-33-37
