CC BY
32
УДК 578.835:577.2
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРЭХОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ РАЗНООБРАЗИЕ
В.В. Зверев, Н.А. Новикова,
ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной»
Зверев Владимир Владимирович - е-mail - [email protected]
Оптимизирована методика ПЦР-обнаружения парэховирусов человека на основе универсальных праймеров K28 и К30. Разработана методика генотипирования трех типов ПЭВ в виде двухраундовой ПЦР. Определены типы парэховирусов, циркулирующих среди населения Нижегородской области. В 52 положительных на ПЭВ пробах парэховирусы 1-го типа были
обнаружены в 28 (53,8 %), 3-го типа в - 7 (13,5 %) и 6-го типа - в 15 (28,8 %) случаях. В двух случаях наблюдалась смешанная ПЭВ-инфекция. В 4 случаях тип вируса установлен не был.
Ключевые слова: парэховирус человека, полимеразная цепная реакция, праймер, нуклеотидная
последовательность, геном, тип.
The procedure of PCR-identification of parechoviruses of the person (PEV) on the basis of universal primers K28 and К30 is optimized. The procedure genotyping of three types PEV, as the version of 'nested' PCR is developed. The types of parechoviruses circulating among the population of the Nizhni Novgorod region have been determined. In 52 PEV-positive tests, PEV 1 type have been detected in 28 (53,8 %), 3 types in - 7 (13,5 %) and 6 types - in 15 (28,8 %) cases. In 2 cases the mixed infection ^ (PEV1+PEV6in common) is detected. In 4 cases the type of a virus has not been established.
Key words: human parechovirus, polymerase chain reaction (PCR), primer,
nucleotide sequence, genome, type.
Введение
Парэховирусы человека (ПЭВ) вместе c вирусами Ljungan входят в род Parechovirus семейства Picornaviridae. Открытые в 1956 г. прототипные штаммы парэховирусов первоначально были классифицированы как вирус ЕСНО 22 (штамм Harris) и ЕСНО 23 (штамм Williamson) в составе рода Enterovirus. По мере изучения открывались необычные, совершенно
отличные от типичных энтеровирусов, свойства новых вирусов, на основании которых эховирусы 22 и 23 были выделены в 1999 году в самостоятельный род Parechovirus и переименованы в парэховирус 1 и 2 человека, соответственно HPEV1 и HPEV2. На данный момент открыто 14 типов парэховирусов человека, большинство из которых еще только характеризуются (http://www.picornastudygroup.com/types /parechovirus/hpev.htm).
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Парэховирусы человека - широко распространенный агент множества инфекционных заболеваний. Однако диагностика данной инфекции до сих пор является прерогативой нескольких исследовательских лабораторий во всем мире. Парэховирусы трудно реплицируются на культурах тканей, а наиболее подходящие для этого виды тканей редко используются в диагностических лабораториях. Поэтому неудивительно, что долгое время с момента своего открытия парэховирусы человека совершенно не диагностировались, что в полной мере относится к НРЕУ3 и НРЕУб. Эти два часто встречающихся типа ПЭВ были открыты только в конце XX, начале XXI века (т. е. спустя почти полвека после открытия прототипных штаммов), в связи с применением новых методов идентификации ПЭВ. Создание и совершенствование молекулярно-биологических методов диагностики позволило совершить рывок в деле идентификации инфекционных агентов, которые с большим трудом определяются традиционными методами исследований. Применение ПЦР в обнаружении и типировании ПЭВ позволило в короткий срок получить большое количество информации, касаемой природы данных вирусов.
В России до последнего времени исследования ПЭВ не проводилось, соответственно отсутствовали данные об их циркуляции на территории нашей страны. На основании имеющихся данных зарубежных авторов о роли ПЭВ в кишечной патологии и методах их обнаружения нами были предприняты усилия по поиску ПЭВ у детей с острым гастроэнтеритом на территории Нижегородской области, закончившиеся обнаружением ПЭВ в 2006 (впервые в России). Дальнейшие исследования потребовали как усовершен-^ ствования существующих методик, так и создания новых методик идентификации и типирования ПЭВ, позволивших получить новейшие молекулярно-биологические и эпидемиологические данные об этих вирусах.
Цель работы: разработка методов обнаружения и гено-типирования парэховирусов человека.
Материалы и методы
Для оценки и разработки олигонуклеотидных праймеров были использованы полные нуклеотидные последовательности парэховирусов человека 1-8-го типов. Для оптимизации метода идентификации ПЭВ были использованы 140 образцов от больных гастроэнтеритом с отрицательным результатом ПЦР-тестирования на кишечные вирусы. При апробации исследовано 1972 пробы копроматериала от больных, госпитализированных с ОКИ инфекцией в инфекционные стационары Нижнего Новгорода. Экстракцию вирусных РНК и обратную транскрипцию проводили с использованием наборов «Рибосорб» и «Реверта» фирма ^ «Интерлабсервис» (Москва), согласно инструкции по применению. Продукты амплификации выявляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.
На первом этапе работы был проведен анализ праймеров, представленных в методиках иностранных источников. Устанавливались места посадки пар праймеров, проведена оценка их комплементарности, консервативности соответствующих им участков, размера фланкируемого фрагмента, а также возможные замены нуклеотидных оснований в них, возникновение которых объясняется появлением новых нуклеотидных последовательностей. На основании подобного анализа была выявлена универсальная пара прайме-
ров K28, R30 (Oberste, 1998), примечательная абсолютным консерватизмом места посадки праймеров (применительно и к самым новым последовательностям всех типов ПЭВ) и, как следствие, отсутствием необходимости внесения изменений в исходные праймеры. Эта пара фланкирует участок генома в 5'-нетранслируемом регионе (5НТР). С использованием этих праймеров впервые были обнаружены ПЭВ на территории Нижегородской области; в настоящее время эта пара праймеров также применяется для идентификации ПЭВ в клиническом материале. Специфичность данного способа детекции ПЭВ была подтверждена путем секвенирования кДНК из случайно выбранных проб. Во всех пробах присутствовали последовательности, идентифицированные в BLAST [http://blast. ncbi.nlm.nih.gov] как 5'НТР генома ПЭВ.
Генотипирование парэховирусов проводят путем анализа области генома, кодирующей капсидный белок VP1, который содержит детерминанты, определяющие серотип вируса. Амплификация данного участка генома имеет более низкую чувствительность в сравнении с амплификацией 5'НТР вследствие более высокой вариабельности и вырожденно-сти генетического кода. В связи с этим для определения типа ПЭВ потребовалось создание варианта двухраундовой ПЦР. Постановку первого раунда ПЦР осуществляли использованием универсальных праймеров, предложенных в 2005 году Benschop K. c соавторами.
Для проведения второго раунда ПЦР нами были созданы праймеры, специфичные в отношении 1-го, 3-го и 6-го типов ПЭВ, которые являются наиболее распространенными и часто встречающимися типами ПЭВ. С помощью разработанного метода были исследованы 52 положительных на парэховирусы образца. Парэховирусы 1-го типа были идентифицированы в 28, 3-го типа в - 7 и 6-го типа - в 15 случаях. В 4 случаях тип вируса установлен не был, что может быть объяснено присутствием парэховирусов других типов. У двух больных была выявлена смешанная парэховирусная инфекция (1-го и 6-го типа в обоих случаях) (рис.).
(13,5%)
"ПЭВ1 °ПЭВЗ □ПЭВ 6 с ПЭВ 1+6 а ПЭВ неизв.
РИС.
Долевое распределение типов парэховирусов человека, обнаруженных у детей с острой кишечной инфекцией.
Полученные данные показывают наличие циркуляции ПЭВ на территории нашей страны, подтверждают сведения зарубежных источников о широком распространении ПЭВ, разнообразии типов и их значимости в качестве инфекционного агента острых кишечных инфекций, свидетельствуют о необходимости включения ПЭВ в список диагностируемых возбудителей и создания необходимых эффективных тест-систем обнаружения и типовой идентификации парэховирусов человека.
Выводы
1. Оптимизирована методика идентификации ПЭВ человека.
2. Разработана методика генотипирования ПЭВ.
3. Определены типы ПЭВ, циркулирующие на территории Нижегородской области.
ЛИТЕРАТУРА
1. Coller B., Chapman N., Beck M., Pallansch M. Echovirus 22 is an atypical enterovirus. J. Virol. 1999. № 64. Р. 2692-2701.
2.Stanway, G. and Hyypia T. Parechoviruses. J. Virol., 1999. Vol. 73. P. 52495254.
3.Landry M.L. The molecular diagnosis of parechoviruses: Has the time come? Clin Infect Dis. 2010. Vol. 50 (3). Р. 357-361.
4. Голицына Л.Н., Зверев В.В., Новикова Н.А. и др. Обнаружение парэхови-русов у детей с гастроэнтеритом. Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. 2007. Апрель 26-27. Москва: Санэпидмедиа, 2007. Т. 2. С. 224-225.
5.Oberste M.S., Maher K. and Pallansch M.A. Specific detection of echoviruses 22 and 23 in cell culture supernatants by RT-PCR . J. Med. Virol. 1999. № 58. Р. 178-18.
6. Benshop K., Thomas X., Serpenti C. et.al. High prevalence of human Parechovirus (HPeV) genotypes in the Amsterdam region and identification of specific HPeV variants by direct genotyping of stool samples. J. Clin. Microbiol. 2008. № 46. Р. 3965-3970.
El
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
