CC BY
42
БИОЛОГИЯ
УДК 577
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРЭХОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2010 г. В.В. Зверев 1 2, Л.Н. Голицына 1, Н.В. Епифанова 1, С.Г. Фомина 1,
Л.Б. Луковникова 1, Н.А. Новикова 1
1 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной 2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
3bb84@mail.ru
Поступила в редакцию 30.05.2009
Разработана методика обнаружения парэховирусов и определения их типов. Впервые показана частота обнаружения парэховирусов среди детей с острым гастроэнтеритом в нашей стране. Определены типы парэховирусов, циркулирующие среди населения Нижегородской области.
Ключевые слова: парэховирус человека, полимеразная цепная реакция, праймер, нуклеотидная последовательность, геном, тип.
Парэховирусы человека (ПЭВ) входят в семейство Picornaviridae, род Parechovirus. В 1956 году во время изучения случаев летней диареи Wigand R. и Sabin A. выделили из ректальных тампонов больных детей два ранее неизвестных вируса. Эти два вируса первоначально были классифицированы как эховирус 22 (штамм Harris) и эховирус 23 (штамм Williamson) [1]. Однако исследователи сразу обратили внимание на особые ростовые свойства новых вирусов (например, трудности пассажа и адаптации к культуре клеток детеныша обезьяны и ограниченный цитопатогенный эффект к периферической части монослоя клеток), отличающиеся от таковых у других энтеровирусов. Еще одно отличие от типичных энтеровирусов - это явное отсутствие подавления синтеза протеинов в клетке хозяина. Также уникальные свойства присущи капсиду вириона и вторичной структуре генома парэховирусов [2]. На основании отличительных молекулярно-биологических свойств эховирусы 22 и 23 были выделены в 1999 году в самостоятельный род Parechovirus и переименованы в парэховирус 1 и 2 человека, соответственно HPEV1 и HPEV2 [3]. На данный момент охарактеризовано 14 типов парэховиру-сов.
Парэховирусы человека - безоболочечные вирусы размером 30 нм, обладающие икосаэд-ральной симметрией с T = 3. Геном представлен однонитевой РНК положительной полярности,
кодирующей 12 протеинов. Репликация генома и сборка вирионов происходят в цитоплазме, высвобождение вирусных частиц происходит при лизисе клетки. Вирусы политропны, наиболее частыми формами парэховирусной инфекции являются гастроэнтериты и респираторные заболевания. Основной группой риска по заболеванию парэховирусной инфекцией являются дети до 1-1.5 лет [4].
На возросший интерес к проблеме парэхови-русной инфекции в мире указывает то, с какой стремительностью открываются новые типы парэховирусов - только за последние шесть лет было открыто 12 типов вируса. В нашей стране изучение этих вирусов не проводилось, собственно, как и не было сведений о циркуляции парэховирусов на территории России. Обнаружение нами в 2006 году на территории Нижегородской области парэховирусов человека показало актуальность проведения всестороннего изучения для получения подробной характеристики российских изолятов парэховирусов человека.
Цель данной работы - разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения парэховирусов и установления их типовой принадлежности.
Разработка ПЦР для обнаружения ПЭВ
Важным элементом, определяющим эффективность реакции, являются праймеры. В связи
с этим изначально был осуществлен сравнительный анализ пар праймеров, представленных в литературе: проведено выравнивание праймеров с нуклеотидными последовательностями геномов парэховирусов 6-ти типов (1-6 типы) (всего 13 последовательностей), имеющихся в GenBank/EMBL/DDBJ; оценены их специфичность, места посадки, размер фрагмента; изучены условия постановки ПЦР с данными праймерами. Всего были проанализированы 5 пар праймеров (табл. 1).
Таблица 1
Праймеры, используемые для идентификации парэховирусов человека
Название нраймеров Регион посадки праймеров Автор, год
E1, E2 5'UTR Coller B-A., 1990
ev22+, ev22- 5'UTR Joki-Korpela P., 1998
0L250, OL251 VP1 Ghazi F., 1998
C1+, C2- 5'UTR Joki-Korpela P., 2000
K28, R30 5'UTR Oberste M., 1998
Критическим показателем, на котором основывался выбор, была идентичность праймеров местам их посадки, в том числе с последовательностями новых типов ПЭВ, открытых после разработки праймеров. На основании этого нами была выбрана пара праймеров К28 и R30, предложенных Оберстом [5]. Эта пара фланкирует участок генома в 5'-нетранслируемом регионе (5'иТР). Уникальность участков генома, комплементарных выбранным праймерам, заключается в абсолютном консерватизме нук-
леотидньгс последовательностей у 6-ти типов ПЭВ (табл. 2).
Размер фрагмента, получаемого с использованием праймеров К28 и R30, равен 257 н.о. (по HPEV1 Harris) (рис. 1).
Праймеры были апробированы в ПЦР на пробаx кДНК ПЭВ. В реакции, для повышения специфичности, использовали «hot»Taq-поли-меразу, для активации которой требуется большее время нагрева, чем для обычной Taq-полимеразы. В окончательном варианте программа имела вид: 94оС - 15 мин; (94оС -10 сек, 48оС - 10 сек, 72оС - 10 сек) х 42 цикла. При визуализировании результатов в агарозном геле (рис. 2) в несколькж пробаx был отчетливо виден фрагмент кДНК, соизмеримый с маркером (М) установленной длины в 260 н.о. Это и был искомый фрагмент в 257 н.о.
Проведены контрольные постановки ПЦР для проверки специфичности праймеров c целью исключения иx самопроизвольного отжига на геномаx другж вирусов. Использовали кДНК различные кишечные вирусов: ротавирусов, норовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А. Результаты ПЦР во всеx слyчаяx были отрицательны.
На втором этапе работы, используя ПЦР с подобранными праймерами, проведены скрининговые исследования по обнаружению ПЭВ в фекалияx населения Нижнего Новгорода в период с 2006 по 2008 гг. Было исследовано 1972 пробы, парэxовирyсы человека были выявлены в 8.9% случаев. В 70% проб, содержащиx парэ-xовирyсы, одновременно обнаружены и другие кишечные вирусы. Наиболее часто (60.3% парэ-xовирyс-вирyсныx ассоциаций) парэxовирyсы
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности 5'UTR генома ПЭВ различных типов в местах посадки родовых праймеров И28 и Ю0
Штамм K28 R30к
HPEV1 Harris CATCCTCTAGTAAGTTTG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV1 Bahrain CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV2 CT86-6760 CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV2 Gregory CA TCCTCTAGTAAGTTTG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV2 Williamson CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV3 A308-99 CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV3 Can82853-01 CA TCC TC TAGTAAGTTTG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV4 Fuk2005-123 CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV4 K2 51176-02 CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV4 T92-15 CA TCC TC TAGTAAGTTTG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV5 T75-4077 CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV6 2005-823 CA TCC TC TAGTAAGT T TG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
HPEV6 BNI-788St CATCCTCTAGTAAGTTTG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
K28 R30^ CATCCTCTAGTAAGTTTG GAAGGATGCCCAGAAGGTACC
*к - последовательность олигонуклеотида, обратно комплементарная нраймеру R30.
257 н.о.
Рис. 1. Схема посадки олигонуклеотидных праймеров на 5'-UTP генома ПЭВ (позиции отмечены по геному НРБVI Harris) ’ ’
Рис. 2 Электрофореграмма фрагментов 5'UTR генома парэховирусов человека: М - маркер размерности ДНК, выраженный в нуклеотидах (н.о.), 1-4 - пробы, содержащие РНК ПЭВ
обнаруживались совместно с ротавирусами, реже - с энтеро- и калицивирусами (20.6 и 13.5% соответственно), в единичных случаях -с адено-, кобу-, астро-, бокавирусами, вирусом гепатита А. Установленная нами частота обнаружения парэховирусной инфекции у детей с острым гастроэнтеритом (ОГЭ) согласуется с данными зарубежных исследователей. Так, в Голландии при проведении трехлетнего обследования детей с различными заболеваниями в возрасте до 5 лет была установлена средняя частота обнаружения парэховирусов, равная 16.3% [6]. У детей с энтеритом в возрасте до 2 лет парэховирусы обнаруживались с частотой 11.6% [4].
Полученные результаты свидетельствуют о достаточно широком распространении вирусов среди местного населения. Впервые показана частота обнаружения ПЭВ у детей с ОГЭ в нашей стране.
Разработка и применение методики ПЦР для типирования изолятов ПЭВ
В данном случае для повышения спецефич-ности и чувствительности реакции нами был применен метод «nested»-ПЦР, состоящий из двух раундов. На первом этапе проводилась ПЦР с использованием универсальных праймеров, ограничивающих участок генома в регионе VP1. За основу нами были взяты оригинальные праймеры VP1-parEchoF1 и VP1-parEchoR1,
предложенные в 2005 году К. Беншопом с сотрудниками [7]. При компьютерном анализе этих праймеров мы использовали нуклеотидные последовательности 6-ти типов ПЭВ, известных во время проведения исследования. В связи с наличием нуклеотидных последовательностей новых типов ПЭВ потребовалось внести замены в исходные праймеры (табл. 3).
Размер фрагмента кДНК, получаемого с использованием как исходных, так и модифицированных праймеров, равен 759 н.о. (по геному HPEV1 Harris). Модифицированные праймеры проанализировали в программе «Oligo 4.0» (США) с целью установления температуры плавления и температуры отжига. На основе проведенного анализа температура отжига праймеров составила 42°С. Эта температура была использована в реакции амплификации. В ходе постановочных реакций на пробах, содержащих кДНК ПЭВ, был получен фрагмент установленной длины.
Для проведения второго раунда ПЦР нами были подобраны праймеры (табл. 4), специфичные в отношении 1, 3 и 6 типов ПЭВ, которые являются наиболее распространеными и часто встречаемыми типами ПЭВ. Температуры отжига пар праймеров, определенные с помощью программы «Oligo 4.0» (США) и подтвержденные в ходе постановочных реакций, имеют следующие значения: для пары 1F, 1R -42°C, для пары 3F, 3R - 50°C и для пары 6F, 6R - 55°C.
Таблица 3
Нуклеотидные последовательности VP1 генома ПЭВ различных типов в местах посадки универсальных праймеров УР№ и УРШ
Штамм VP1-parEchoF1 VP1-parEchoR1к
CCAAAATTCTTGGGGTTC GCATATTTAGATAGAGGTTT
HPEV1 Harris HPEV1 Bahrain HPEV2 CT86-6760 HPEV2 Gregory HPEV2 Williamson HPEV3 A308-99 HPEV3 Can82853-01 HPEV4 Fuk2005-123 HPEV4 K2 51176-02 HPEV4 T92-15 HPEV5 T75-4077 HPEV6 2005-823 HPEV6 BNI-788St G G
G G
T
G T
G T
G C -G--- ---G -- G G-- -- G G-- G-- -- G -- G -C- --- --- --- --- --- --- --- A- A -- G G-- -- G -C- -C- -C- -C- -T- -T- -- T -T- -T- -T- -T-
C
VP1F CCARAAYT CWT GGGGYTC
УР№к* GCWTAYTTRRATAGRGGKTT
*к - последовательности олигонуклеотидов, обратно комплементарные праймерам VP1-parEchoR1 и УРШ.
Таблица 4
Праймеры для типирования парэховирусов человека
Тип ПЭВ Прямой праймер Обратный праймер
1 TTTYAARTCYATGAATGTR 1F CTGTW GTY GTTCCAGT G 1R
3 TTTTAAYAATGGAGACACC 3F AACTTCTGCAGTAGTTCG 3R
6 ACAATGGCCCTTAAATTTGAC 6F CGACTTTSCGARCGTGG 6R
759:
VP1F
VP1R
2332 - 2349
3071 -3090
422 и.о.
2491 -2509
342 н.о.
2896 -2912 3R
2581 -2599
2908 -2923
405н.о.
2521-2541
2909-2925
Рис. 3. Унифицированная комплексная схема типовой идентификации ПЭВ (позиции праймеров отмечены по геному НРЕУ6 2005-823)
Размер фрагментов, получаемых на этих парах праймеров, места посадки указаны на рис. 3.
С помощью данного метода было типировано 55 положительных на ПЭВ проб. Парэховирусы 1-го типа были обнаружены в 18 образцах (32.7%), 3-го типа в 2 образцах (3.6%) и 6-го типа - в 15 образцах (27.2%). В 6 пробах (10.9%) бы-
ли определены ПЭВ 1-го и 6-го типов одновременно. Часть проб (36.4%) оказалась нетипи-руемой, что может быть объяснено присутствием парэховирусов других типов. Обнаружение на территории Нижнего Новгорода трех типов ПЭВ свидетельствует о их генетическом разнообразии. Преобладание ПЭВ 1-го и 6-го типов
согласуется с данными о широком распространении этж типов ПЭB в мире [4].
Таким образом, нами разработана методика постановки ПЦP для обнаружения и типирова-ния парэxoвирусoв человека, с использованием которой проведено обнаружение ПЭB, впервые показавшее циркуляцию ПЭB на территории нашей страны; определена частота обнаружения ПЭB у детей с гастроэнтеритом (8.9% случаев), проведено типирование изолятов, показавшее циркуляцию на территории Нижнего Новгорода как минимум 3-x типов ПЭB.
Список литературы
1. Wigand R., Sabin A. Properties of ECHO types 22, 23 and 24 viruses // Arch. Gesamte Virus forsch. 1961. V. 11. P. 224-247.
2. Coller B., Chapman N., Beck M., Pallansch M.
Echovirns 22 is an atypical enterovirus // J. Virol. 1990. V. 64. P. 2692-2701.
3. King A., Brown F., Hyypia T., Stanway G. et al. // Seven Report of the International Committee for the Taxonimy of Viruses, 1999. P. 657-683.
4. Hyypia T., Stanway G. Minirewiev. Parecho-viruses // J. Virol. 1999. V. 73. N. 7. P. 5249-5254.
5. Oberste M., Maher K. Complete sequence of echovirus 23 and its relationship to echovirus 22 and other human enteroviruses // Virus Res. 1998. V. 56. P. 217-223.
6. Benschop K., Thomas X., Serpenti C. et al. High prevalence of human Parechovirus (HPeV) genotypes in the Amsterdam region and identification of specific HPeV variants by direct genotyping of stool samples // J. Clin. Microbiol. 2008. 46. P. 3965-3970.
7. Benschop K.S. et al. Human pfrechovirus infections in dutch children and the association between serotype and disease severity// Clinical Infectious Diseases. 2006. V. 24. P. 204-210.
POLYMERASE CHAIN REACTION FOR IDENTIFICATION OF HUMAN PARECHOVIRUSES
V. V. Zverev, L.N. Golitsyna, N. V. Epifanova, S.G. Fomina,
L.B. Lukovnikova, N.A. Novikova
A technique to detect human parechoviruses and identify their types has been developed. The detection rate of parechoviruses among children with acute gastroenteritis has been revealed for the first time in Russia. The types of parechoviruses circulating among the population of the Nizhni Novgorod region have been determined.
Keywords: human parechovirus, polymerase chain reaction (PCR), primer, nucleotide sequence, genome, type.
