CC BY
131
УДК 616.34-616.988-02-053.2(470.341-25)
этиологическая структура вирусных кишечных инфекций у детей в нижнем Новгороде
Н.в. Епифанова1, л.Б. Ауковникова1, л.Н. Голицына1, С.г. фомина1, Б.Б. Зверев1,
Н.в. Пономарева1, о.в. Парфенова1, Д.в. Новиков2, М.А. волкова3, Н.А. Новикова1,
1ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, 2Институт молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, 3ГУЗНО «Детская инфекционная больница № 8», г. Н. Новгород
Епифанова Наталия Владимировна - e-mail: epifanovanv@mail.ru При изучении структуры острых кишечных заболеваний у детей в Нижнем Новгороде в период с июля 2006 г. по январь 2010 г. показана ведущая этиологическая роль вирусов, которые были выявлены в виде моновирусных и микствирусных инфекций у 62,6% из 3465 обследованных детей. В период наблюдения основное место в этиологической структуре вирусных кишечных инфекций детей занимали ротавирусы (преимущественно, тип G4P[8]), норовирусы (преобладал генотип GII.4), энтеровирусы (чаще ЕСН030, Коксаки А16), аденовирусы (группа F и C), парэховирусы (доминировал тип 1). Доля других вирусов (астровирусы, торовирусы, бокавирусы, агент Аичи, пикобирнавирусы) относительно невелика, однако их выявление позволяет дополнительно расшифровать 2-5% кишечных инфекций.
Ключевые слова: вирусные кишечные инфекции, этиологическая структура,
метод ОТ-ПЦР, генотипирование.
In studying the structure of acute intestinal diseases in children in Nizhny Novgorod in the period from July 2006 to January 2010 the important etiological role of viruses, which have been identified as monoviral and mixed viral infection in 62,6% of 3465 examined children, was shown. During the monitoring period rotaviruses (mainly, the type of G4P [8]), noroviruses (predominant genotype GII.4), enteroviruses (most often ECH030, Coxsackie A16), adenoviruses (group F and C), parehovirus (dominated by type 1) took the principal place in the etiological structure of viral intestinal infections of children. The share of other viruses (astroviruses, toroviruses, bokavi-ruses, agent Aichi, pikobirnaviruses) is relatively small, but their identification additionally allows to establish the etiology of 2-5% of intestinal infections.
Key words: viral intestinal infections, etiologic structure, the method of RT-PCR, genotyping.
Введение
Острые кишечные заболевания (ОКЗ) продолжают оставаться одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения из-за широкой распространенности и отсутствия в России системы их вакцинопрофилактики. Этиологическая расшифровка ОКЗ в России остается на низком уровне. По данным официальной статистики в 2009 г. в России было зарегистрировано 472 574 случая ОКЗ (включая сальмонеллезы и шигеллезы) среди детей до 14 лет, причем 60,8% из них зарегистированы как острые кишечные инфекции (ОКИ), вызванные неустановленными возбудителями, и пищевые токсикоинфекции неустановленной этиологии [1]. Развитие молекулярных методов индикации возбудителей инфекционных заболеваний, в первую очередь обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), позволило установить ведущую роль вирусов в этиологии ОКИ, как среди детей, так и среди взрослых [2]. В настоящее время с острым гастроэнтеритом (ОГЭ) ассоциируют представителей как минимум восьми различных семейств вирусов: Reoviridae (род Rotavirus), Caliciviridae (роды Norovirus, Sapovirus), Adenoviridae (род Mastadenovirus), Astroviridae (род Astrovirus), Picornaviridae (роды Enterovirus, Parechovirus, Kobuvirus - агент Аичи), Coronaviridae (роды Coronavirus, Torovirus), Parvoviridae
(род Bocavirus), PicoЫmaviпdae (род РкоЫп^к^). Спектр возможных этиологических агентов острого гастроэнтерита человека продолжает расширяться по мере выявления у больных неизвестных ранее вирусов, хотя их значимость при данной патологии нуждается в подтверждении.
Цель исследования - изучение этиологической структуры вирусных кишечных инфекций у детей в Нижнем Новгороде.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили фекалии 3645 детей в возрасте до 14 лет, госпитализированных в отделение кишечных инфекций детской инфекционной больницы № 8 г. Нижнего Новгорода с диагнозами «острая кишечная инфекция, острый гастроэнтерит, гастрит, энтерит, вирусная диарея» в период с июля 2006 г. по январь 2010 г. Исследования проводили методом ПЦР или ОТ-ПЦР с использованием тест-систем «Амплисенс» производства ЦНИИЭ (Москва, Россия) для выявления ДНК аденовирусов, РНК ротавирусов, норовирусов, энтеровирусов, астровирусов, а также лабораторных вариантов постановки реакции с применением специфических праймеров для выявления парэховирусов, бокавирусов, торовирусов, агента Аичи [3, 4, 5]. Для проведения ПЦР использовали амплификаторы «Терцик» («ДНК-технология», г. Москва).
Для электрофоретипирования ротавирусов и выявления пикобирнавирусов применяли метод электрофреза в полиакриаламидном геле. Генотипирование вирусов осуществляли методом ПЦР с использованием представленных в литературе, модифицированных нами и оригинальных типоспецифических праймеров, а также с помощью секвенирования отдельных участков вирусных геномов [6, 7]. Определение первичной структуры кДНК осуществляли в автоматическом режиме на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США), согласно рекомендациям производителя. Статистическую обработку данных проводили общепринятым методом с использованием критерия Стъюдента.
Результаты и обсуждение
Результаты расшифровки спорадических случаев ОКИ убедительно демонстрируют ведущую роль вирусных агентов в этиологии острых кишечных заболеваний у детей. За период наблюдения вирусы были выявлены у 2281 из 3645 пациентов, что составило 62,6% от числа обследованных (47,9% - моноинфекция различными вирусами, 14,7% - микст-инфекция). В 37,4% случаев ОКЗ были обусловлены другими причинами, в число которых могут входить патогенная и условно-патогенная микрофлора, протозойные, грибковые инфекции, гельминтозы, соматические заболевания, а также, возможно, еще не установленные вирусные агенты.
Спектр выявляемых кишечных вирусов и частота их обнаружения в виде моно- и микствирусных инфекций в целом за период наблюдения представлены в таблице. Как и ожидалось, наиболее часто у детей с ОКИ выявляются ротавирусы (РВ). Электрофоретипирование показало циркуляцию в изучаемый период времени как минимум двадцати различных генетических вариантов ротавируса, которые на основании G/P-типирования отнесены к типам G1P [8], G2P[4], G3P[6], G3P[9], G4P[8]. Доминирующим в период наблюдения являлся тип G4P[8] (60% типированных изо-лятов РВ), в отличие от периода 1997-2005 гг., когда в Нижнем Новгороде преобладал вариант G1P [8].
Значимость ротавирусов в инфекционной патологии детей, особенно раннего возраста, определила разработку и внедрение антиротавирусных вакцин, которые в настоящее время включены в календарь прививок в ряде развивающихся и развитых стран [9]. Вопрос о целесообразности применения этих вакцин в нашей стране пока не решен, и ежегодный зимне-весенний подъем заболеваемости рота-вирусной инфекцией остается неизбежным явлением.
Вторыми по частоте обнаружения являются норовирусы (НВ), причем анализируемый показатель для норовирусов в 2008-2009 гг. достоверно увеличился по сравнению с 2007-2008 гг. Показана генетическая гетерогенность популяции норовирусов, циркулирующих в Нижнем Новгороде [10]. Норовирусы дифференцированы на две геногруппы - GI и GII. Наиболее распространенными являются норови-
русы геногруппы II, которые, как было показано с помощью секвенирования участка N/S-домена белка VP1, были представлены генотипами GII.2, GII.6, GII.7, GII.b, GII.4.
Доминировал в период наблюдения генотип СП.4, который в свою очередь дифференцирован на три геновариан-та: ЄИ.4-2006а, ЄН.4-2006Ь, GH.4-KH.2008.
ТАБЛИЦА
Частота обнаружения кишечных вирусов у больных с ОКИ в Нижнем Новгороде в 2006-2010 гг. (п=3645)
Возбудители Частота обнаружения, %
моноинфекция микстинфекция всего
Ротавирусы 26,89±0,73 10,67±0,51 37,56±0,80
Норовирусы 9,41±0,48 5,40±0,37 14,81±0,59
Энтеровирусы 4,53±0,34 5,40±0,37 9,93±0,50
Аденовирусы 4,17±0,33 4,31±0,34 8,48±0,46
Парэховирусы 1,26+0,18 3,18±0,29 4,44±0,34
Астровирусы 0,77±0,14 1,18±0,18 1,95±0,23
Торовирусы 0,33±0,09 0,71±0,14 1,04±0,17
Бокавирусы 0,14±0,06 0,38±0,10 0,52±0,12
Саповирусы 0,25±0,08 0,14±0,06 0,38±0,10
Агент Аичи 0,08±0,05 0,44±0,11 0,52±0,12
Пикобирнавирусы 0,05±0,04 0,03±0,03 0,08±0,05
Саповирусы (СВ), относящиеся к менее распространенному, чем норовирусы, роду калицивирусов, обнаруживались довольно редко и были представлены тремя вариантами: генотипами GI.1, GI.2 геногруппы I и генотипом GII.1 геногруппы II.
Интерес к норовирусам как этиологическим агентам ОГЭ у детей вырос в последние годы. Оказалось, что они не только являются основной причиной вспышек ОКИ во всем мире, но и играют существенную роль в спорадической заболеваемости [11]. Это подтверждает обоснованность включения норовирусов (с формулировкой «вирус Норволк») с 2010 г. в форму 2 статистической отчетности по инфекционной заболеваемости в России.
Энтеровирусы (ЭВ) занимают третье место по частоте обнаружения. Методом прямого секвенирования участка гена VP1 в 31 случае был установлен тип энтеровируса. Были идентифицированы ЭВ вида А (Коксаки А2, А4, А5, А16), ЭВ вида В (Коксаки А9, Коксаки В2, ECHO 16, 18, 30) и ЭВ вида С (Полиовирусы типов 1, 2, 3 и Коксаки А1, А22, А24). Различий в типовом составе ЭВ при моно- и мик-стинфекциях не выявлено. При этом относительно чаще выявлялись вирусы ЕСНО30, Коксаки А16 и полиовирус типа 2.
В связи с широкой циркуляцией энтеровирусов, в том числе среди здорового населения, вопрос о целесообразности их индикации в качестве причины гастроэнтерита является дискуссионным. По нашему мнению, поскольку гастроэнтерит может являться одним из проявлений энте-ровирусной инфекции, обнаружение ЭВ в виде
моноинфекции позволяет считать их в данном случае этиологическим агентом ОКИ.
Аденовирусы (АВ) находятся на четвертом месте по частоте обнаружения у больных ОКИ. Они дифференцированы на 2 геногруппы - F и С. Среди аденовирусов группы F идентифицированы серотипы 40 и 41, среди АВ группы С - серотипы 1 и 2. Неожиданным оказалось преобладание аденовирусов группы С, которые составили 37% от числа выявленных аденовирусов, в то время как кишечные аденовирусы группы F - только 25%. В настоящее время считается, что ведущее место в этиологии ОКИ занимают именно АВ группы F [12], на выявление которых направлены имеющиеся в России мультиплексные ПЦР-тест-системы для диагностики ОКИ. Полученные данные определяют необходимость уточнения этиологической роли аденовирусов групп А, В, С и D в возникновении ОКИ.
Парэховирусы (ПЭВ) занимают пятое место по частоте выявления. Их этиологическая роль в возникновении ОГЭ убедительно показана за рубежом [13]. В России внимание этой инфекции уделяется только в рамках проводимых в ННИИЭМ исследований. В 2005 году впервые была показана циркуляция ПЭВ среди населения Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Разработана методика идентификации наиболее широко распространенных в мире типов ПЭВ человека на основе ОТ-ПЦР. Показана циркуляция среди населения Нижнего Новгорода в 2006-2009 гг. парэховирусов 1-, 3- и 6-го типов с доминированием парэ-ховирусов 1-го типа.
Астровирусы (АсВ) обнаружены в относительно небольшом количестве случаев, и имеют, как показано и в других исследованиях, свою небольшую, но стабильную долю в структуре ОКИ у детей [14].
Торовирусы (ТВ) в нашем исследовании выявлялись редко, хотя есть сообщения о взаимосвязи торовирусов с острой и хронической диареей у 27% обследованных детей [15].
Бокавирусы (БВ) начали выявляться нами с эпидсезона 2007-2008 гг., частота их обнаружения невелика. Эти вирусы, открытые в 2005 г. путем неспецифической амплификации вирусной РНК из образцов респираторных секретов больных, считаются этиологическим агентом респираторных заболеваний. Однако в последнее время все больше подтверждений находит их самостоятельная этиологическая роль в возникновении ОГЭ у детей и взрослых [16].
Агент Аичи (АА) также обнаруживался с низкой частотой и, как правило, в виде смешанной инфекции. Низкая выявляемость вируса Аичи показана при спорадической заболеваемости детей с острой диареей, однако он оказался ассоциированным более, чем с половиной вспышек ОКИ, связанных с употреблением морепродуктов [17].
Пикобирнавирусы (ПБВ) обнаруживались чрезвычайно редко - всего 3 случая за период наблюдения. Несмотря на то, что ПБВ выявляются у больных с диареей, этиологиче-
ская связь этих вирусов с заболеванием до настоящего времени однозначно не показана, хотя есть достаточно убедительные данные о роли ПБВ в возникновении диареи у ВИЧ-инфицированных пациентов [18].
На основании полученных данных были рассчитаны доли больных, инфицированных тем или иным вирусов в виде моноинфекции, а также доля больных, у которых выявлено более одного вируса (микствирусные инфекции) от общего количества вирусинфицированных (п=2281). Полученное распределение долей отражает этиологическую структуру вирусных кишечных инфекций у детей в Нижнем Новгороде в целом за период наблюдения (рис.)
РВ
1,2%
РИС.
Этиологическая структура вирусных кишечных инфекций у детей в Нижнем Новгороде в 2006-2010 гг. (п=2281). РВ - ротавирусы, НВ - норовирусы, ЭВ - энтеровирусы, АВ - аденовирусы, ПЭВ - парэховирусы, АсВ - астровирусы, ТВ - торовирусы, БВ - бокавирусы, СВ - сапо-вирусы, АА - агент Аичи, ПБВ - пикобирнавирусы.
*Доли моноинфекций бокавирусами, саповирусами, пикобирнавируса-ми и агентом Аичи показаны в сумме.
Выводы
1. Показана ведущая роль вирусных агентов в этиологии острых кишечных заболеваний у детей: вирусы были выявлены у 62,6% пациентов (47,9% - моноинфекция различными вирусами, 14,7% - микст-инфекция).
2. В период наблюдения (июль 2006 - январь 2010 гг.) в Нижнем Новгороде основное место в этиологической структуре вирусных ОКИ у детей занимали ротавирусы (преимущественно, тип G4P[8]), норовирусы (преобладал генотип GII.4), энтеровирусы (чаще ЕСНО30, Коксаки А16), аденовирусы (группа F и С) и парэховирусы (доминировал тип 1).
3. Существенная роль парэховирусов в этиологической структуре ОКИ обосновывает необходимость разработки тест-системы для их выявления и целесообразность их идентификации при диагностике кишечных инфекций.
4. Доля других вирусов (астровирусы, торовирусы, бока-
вирусы, торовирусы, агент Аичи, пикобирнавирусы) относительно невелика, однако позволяет дополнительно расшифровать 2-5% кишечных инфекций. 123
ЛИТЕРАТУРА
1. Сведения об инфекционных и паразитарных заболевания (форма 1) за январь-декабрь 2009 г. http://www.fcgsen.ru.
ЕЮ
2. Glass R.I., Bresee J., Jiang B., Gentsch J., Ando T., Fankhauser R., Noel J., Parashar U., Rosen B., Monroe S.S. Gastroenteritis viruses: an overview. Novartis Found Symp. 2001. № 238. Р. 5-19.
3. Oberste M. S., Maher K., Pallansch M. A. Specific detection of echoviruses 22 and 23 in cell culture supernatants by RT-PCR. J. Med. Virol. 1999. № 58. Р. 178-181.
4. Allander T., Tammi M.T., Eriksson M., Bjerkner A., Tiveljung-Lindell A., Andersson B. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. № 102. Р. 12891-128966.
5. Duckmanton L., Luan B., Devenish J., Tellier R., Petric M. Characterization of torovirus from human fecal specimens. Virology. 1997. № 239. Р. 158-68.
6. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф. G/P-генотипирование ротавирусов с использованием полимеразной цепной реакции. Методические рекомендации. Н. Новгород. 2007.
7. Голицына Л.Н, Новикова Н.А., Домбровская О.Н. Княгина О.Н., Новиков Д.В., Аркова Т.В. Оценка разработанного «nested»-варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных. Вопросы вирусологии 2002. № 5. С. 41-43.
8. Новикова Н.А., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В., Чупрова А.Б. G[P] типы ротавируса группы А человека и их распространение в г. Нижнем Новгороде и г. Дзержинске в 1997-2005 гг. Вопросы вирусологии 2007. № 3. С.19-23.
9. Dennehy P.H. Rotavirus vaccines: an overview. Clin. Microbiol. Rev. 2008. № 216. Р. 198-208.
10. Луковникова Л.Б., Епифанова Н.В., Новиков Д.В., Новикова Н.А. Генетическое разнообразие калицивирусов человека, обнаруженных у
детей с гастроэнтеритом в Нижнем Новгороде. Вопросы вирусологии. 2009. № 6. С. 24-28.
11. Koopmans M. Progress in understanding Norovirus epidemiology. Curr. Opin. Infect. Dis. 2008. № 21. Р. 544 - 552.
12. Verma H., Chitambar S.D., Varanasi G. Identification and characterization of enteric adenoviruses in infants and children hospitalized for acute gastroenteritis. J. Med. Virol. 2009. № 81. Р. 60-64.
13. Harvala H., Simmonds P. Human parechoviruses: biology, epidemiology and clinical significance. J. Clin. Virol. 2009. № 45. Р. 1-9.
14. Levidiotou S., Gartzonika C., Papaventsis D., Christaki C., Priavali E., Zotos N., Kapsali E., Vrioni G. Viral agents of acute gastroenteritis in hospitalized children in Greece. Clin. Microbiol. Infect. 2009. № 15. Р. 596-598.
15. Koopmans M.P., Goosen E.S., Lima A.A., McAuliffe I.T., Nataro J.P., Barrett L.J., Glass R.I., Guerrant R.L. Association of torovirus with acute and persistent diarrhea in children. Pediatr. Infect. Dis. J. 1997. № 16. Р. 504-507.
16. Chow B.D., Ou Z., Esper F.P. Newly recognized bocaviruses (HBoV, HBoV2) in children and adults with gastrointestinal illness in the United States. J. Clin. Virol. 2010. № 47. Р. 143-147.
17. Ambert-Balay K., Lorrot M., Bon F., Giraudon H., Kaplon J., Wolfer M., Lebon P., Gendrel D., Pothier P. Prevalence and genetic diversity of Aichi virus strains in stool samples from community and hospitalized patients. J. Clin Microbiol. 2008. № 46. Р. 1252-1258.
18. Giordano M.O., Martinez L.C., Rinaldi D., Espul C., Martinez N., Isa M.B., Depetris A.R., Medeot S.I., Nates S.V. Diarrhea and enteric emerging viruses in HIV-infected patients. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. № 15. Р. 1427-1432.
