CC BY
102
ЕЮ
УДК 578.5
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПАРЭХОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
В.В. Зверев, Л.Н. Голицына, С.Г. Фомина, О.В. Парфенова, Д.В. Новиков,
Л.Б. Луковникова, Н.В. Епифанова, Н.А. Новикова,
ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, Институт молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского
Голицына Людмила Николаевна - e-mail: [email protected]
Разработана методика обнаружения парэховирусов человека и определения их типов. Впервые показана частота обнаружения парэховирусов среди детей с острой кишечной инфекцией в нашей стране. Определены типы парэховирусов, циркулирующие среди населения Нижегородской области
Ключевые слова: парэховирус человека, полимеразная цепная реакция, праймер,
нуклеотидная последовательность, геном, тип.
The technique of detection and definition of types of parechoviruses is developed. For the first time frequency of detection of parechoviruses among children with acute gastroenteritis in our country is shown. The types of parechoviruses circulating among the population of the Nizhniy Novgorod area are defined.
Key words: human parechovirus, polymerase chain reaction, primer, nucleotide sequence, genome, type.
Введение
Парэховирусы человека (ПЭВ) вместе с вирусами Ljungan входят в род Parechovirus семейства Picornaviridae. В 1956 г. во время изучения случаев летней диареи Wigand R. и Sabin A. выделили из ректальных тампонов больных детей два ранее неизвестных вируса [1]. Эти вирусы первоначально были классифицированы как вирус ЕСНО 22 (штамм Harris) и ЕСНО 23 (штамм Williamson). Однако исследователи сразу обратили внимание на особые ростовые свойства новых вирусов (трудности пассажа и адаптации к культуре клеток детеныша обезьяны, ограниченный цитопатогенный эффект к периферической части монослоя клеток), отличные от таковых у других энтеровирусов. Другое отличие от типичных энтеровирусов заключалось в полном отсутствии подавления синтеза протеинов в клетке хозяина. Уникальные свойства присущи капсиду вириона и вторичной структуре генома парэховирусов [2]. На основании отличительных молекулярно-биологических свойств эховирусы 22 и 23 были выделены в 1999 году в самостоятельны род Parechovirus и переименованы в парэховирус 1 и 2 человека, соответственно HPEV1 и HPEV2 [3]. На данный момент охарактеризовано 10 типов парэховирусов человека [4].
ПЭВ - безоболочечные вирусы, вирионы которых имеют размер 30 нм и обладают икосаэдральной симметрией с Т=3. Геном представлен однонитевой РНК положительной полярности, кодирующей 12 протеинов. Репликация и сборка происходят в цитоплазме, высвобождение вирусных частиц происходит при лизисе клетки. Вирусы политропны, наиболее частыми формами парэховирусной инфекции являются гастроэнтериты и респираторные заболевания. Основной группой риска по заболеванию парэховирусной инфекцией являются дети младшего возраста [3].
На возросший интерес к проблеме парэховирусной инфекции в мире указывает то, с какой стремительностью откры-
ваются новые типы ПЭВ - только за последний шесть лет было открыто 8 типов вируса. В нашей стране изучение этих вирусов не проводилось, собственно, как и не было сведений о циркуляции парэховирусов на территории России. Обнаружение нами в 2006 году [5] на территории Нижегородской области парэховирусов человека показало необходимость их всестороннего изучения.
Целью данной работы являлась разработка метода полимеразной цепной реакции для обнаружения парэховирусов человека и установления их типовой принадлежности.
Материалы и методы
Для оценки и разработки олигонуклеотидных праймеров были использованы полные нуклеотидные последовательности парэховирусов человека 1-8 типов и вирусов Ljungan, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ: HPEV1:
EF051629,FJ840477, FM178558, GQ183018-GQ183025,
GQ183034, GQ183035; HPEV2: AJ005695, HPEV3: AB084913, AJ88918,GQ183026-GQ183033;HPEV4:AB433629,AM235750, DQ315670; HPEV5: AF055846, AM235749; HPEV6: AB252582, EU024629, EU077518; HPEV7: EU556224; HPEV8: EU716175; вирусы Ljungan: AF538689, EF202833, FJ384560. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали алгоритм Clustal W в составе программного обеспечения MEGA 4.0 [6]. Для оптимизации метода идентификации ПЭВ были использованы 140 образцов от больных гастроэнтеритом с отрицательным результатом ПЦР-тестирования на кишечные вирусы. При апробации исследовано 1972 пробы копроматериала от больных, госпитализированных с ОКИ инфекцией в инфекционные стационары Нижнего Новгорода. Экстракцию вирусных РНК и обратную транскрипцию проводили с использованием наборов «Рибосорб» и «Реверта» фирма Интерлабсервис, Москва, согласно инструкции по применению. Продукты амплификации выявляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Результаты и обсуждение
Оптимизация ПЦР для обнаружения ПЭВ.
Важным элементом, определяющим эффективность полимеразной цепной реакции, являются олигонуклеотидные
праймеры. На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ пар праймеров, представленных в литературе. На основе выравнивания праймеров с нуклеотидными последовательностями генома ПЭВ 8 типов и вирусов Ципдап была проведена оценка комплементарности праймеров, консервативности соответствующих им участков, размера фланкируемого фрагмента. Всего были проанализированы пять пар праймеров (таблица 1).
таблица 1.
Праймеры используемые для идентификации парэховирусов человека
Название праймеров Расположение в геноме парэховирусов источник, год
E1, E2. 5'UTR [2], 1990
ev22+, ev22-. 5'UTR [7], 1998
OL250, OL251. VP1 [8], 1998
C1+, C2-. 5'UTR [9], 2000
K28, R30. 5'UTR [10], 1998
таблица 2.
Нуклеотидные последовательности VP1 генома ПЭВ различных типов в местах расположения универсальных праймеров VP1F и VP1R к — последовательность олигонуклеотидов, обратно комплементарная праймеру VP1-parEchoR1. Й: A/G; У: С/Т; К: G/T; Ш A/T_
последовательность авторских праймеров VP1-parEchoF1 CCAAAATTCTTGGGGTTC VP1-parEchoR^ GCATATTTAGATAGAGGTTT
штамм ПЭВ
HPEV 1 Harris
HPEV 1 Bahrain
HPEV 2 CT86-6760
HPEV 2 Gregory
HPEV 2 Williamson
HPEV 3 A308-99
HPEV3 Can82853-01
HPEV 4 Fuk2005-123
HPEV 4 K2 51176-02
HPEV 4 T92-15
HPEV 5T75-4077
HPEV 6 2005-823
HPEV 6 BNI-788St
последовательности модифицированных праймеров CCARAAYTCWTGGGGYTC GCWTAYTTRRATAGRGGKTT
Критерием, на котором основывался выбор, была компле-ментарность праймеров местам их посадки с учетом последовательностей новых типов ПЭВ, открытых позднее представленных в научной литературе праймеров. По результатам анализа нами была выбрана пара праймеров K28 и R30, предложенных М. Oberste с соавторами для идентификации парэховирусов в пробах, пассированных в культурах ткани [10]. Эта пара фланкирует участок генома в 5'-нетранслируемом регионе (5'НТР). Уникальность участков генома, комплементарных данным праймерам, заключается в абсолютном консерватизме нуклеотидных последовательностей 8 типов ПЭВ.
С использованием выбранной пары праймеров было исследовано 140 образцов от больных с ОКИ, отрицательных при ПЦР-тестировании на другие кишечные вирусы (рота-, энтеро-, адено-, норо- и астровирусов). В отличие от М. Oberste с соавторами, мы проводили выявление ПЭВ путем прямого исследования клинических проб, в связи с чем в целях повышения чувствительности и специфичности реакции ПЦР, вместо обычной, использовали TaqF-ДНКполимеразу, а амплификацию проводили в режиме 94С - 15 мин.: (94С-10 с, 48С-10 с, 72С-10 с) х 52. При визуализировании результатов в агарозном геле в 8 пробах был идентифицирован фрагмент необходимого размера. Специфичность данного способа детекции ПЭВ была подтверждена путем секвенирования кДНК из 4 случайно выбранных проб. Во всех пробах присутствовали последовательности, идентифицированные в BLAST [http://blast.ncbi. nlm.nih.gov] как 5'НТР генома ПЭВ.
Для контроля специфичности амплификации использовали кДНК различных кишечных вирусов: ротавирусов, норо-вирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А. Результаты ПЦР во всех случаях были отрицательными.
Оптмизированный вариант ПЦР апробирован при обнаружении ПЭВ в фекалиях детей, госпитализированных в инфекционные стационары. Исследовано 1972 пробы, парэ-ховирусы человека выявлены в 8,9% случаев. В 70% проб, содержащих парэховирусы, одновременно были обнаружены другие кишечные вирусы. Наиболее часто парэховирусы обнаруживались совместно с ротавирусами (60,3% парэховирус-вирусных ассоциаций), реже с энтеро- и кали-цивирусами (20,6% и 13,5%, соответственно), в единичных случаях с адено-, кобу-, астро-, бокавирусами, вирусом гепатита А. Установленная нами частота обнаружения парэ-ховирусной инфекции у детей с ОКИ согласуется с данными зарубежных исследователей. Так, в Голландии, при проведении трехлетнего обследования детей с различными заболеваниями в возрасте до пяти лет была установлена средняя частота обнаружения ПЭВ, равная 16,3% [11]. У детей с энтеритом в возрасте до двух лет парэховирусы обнаруживались с частотой 11,6% [12].
Полученные нами результаты свидетельствуют широком распространении ПЭВ среди населения Нижнего Новгорода.
Разработка методики ПЦР-типирования ПЭВ
«Генетическое серотипирование» парэховирусов, так же, как и других пикорнавирусов, проводят путем анализа области генома, кодирующей капсидный белок VP1, так как именно он содержит детерминанты, определяющие серотип вируса. Амплификация данного участка генома имеет более низкую чувствительность в сравнении с амплификацией 5'НТР в следствие более высокой вариабельности и вырож-денности генетического кода. В связи с этим для определения типа ПЭВ был разработан вариант двухраундовой ПЦР.
ЕЮ
Постановку первого раунда ПЦР осуществляли с использованием универсальных праймеров, предложенных в 2005 году Benschop К. с соавторами [13]. На основе сравнения последовательностей этих праймеров с последовательностями генома ПЭВ, появившихся в базах данных позднее 2005 г., мы ввели модификации с учетом вырожденности (таблица 2). Амплификацию проводили в режиме: (94С-10 с, 42С-10 с, 72С-10 с) х 42.
Для проведения второго раунда ПЦР нами были созданы праймеры, специфичные в отношении 1, 3 и 6 типов ПЭВ, которые являются наиболее распространеными и часто встречаемыми типами ПЭВ [11, 12, 14]. Расположение типовых праймеров и размер фланкируемых ими фрагментов представлены на рисунке.
С помощью разработанного метода были исследованы 52 положительных на парэховирусы образца. Парэховирусы ї типа были идентифицированы в 28 (53,8%) случаях, 3-го типа - в 7 (13,5%) и 6-го типа - в 15 (28,8%) случаях. У двух больных была выявлена смешанная парэховирусная инфекция (1-го и 6-го типа в обоих случаях). В 4 случаях тип вируса установлен не был, что может быть объяснено присутствием парэховирусов других типов. Специфичность разработанного метода была подтверждена путем секвенирования фрагментов кДНК, амплифицированных с использованием типоспецифичных праймеров.
Обнаружение на территории Нижнего Новгорода трех типов ПЭВ свидетельствует о генетической гетерогенности
местной популяции ПЭВ. Доминирование ПЭВ 1-го типа и значительное представительство ПЭВ 6-го и 3-го типов согласуются с данными о широком распространении этих типов ПЭВ в мире [11, 12, 14].
Выводы
В результате работы были 1) разработаны методики постановки ПЦР для обнаружения и типирования парэховирусов человека; 2) определена частота обнаружения ПЭВ у детей с ОКИ, составившая 8,9% случаев; 3) показана гетерогенность ПЭВ, циркулирующих на территории Нижнего Новгорода, проявившаяся наличием вирусов как минимум трех типов.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Wigand R., Sabin A. Properties of ECHO types 22, 23, 24 viruses. Arch. Gesamte Virus forsch. 1961. № 11. Р. 224-247.
2. Coller B., Chapman N., Beck M., Pallansch M. Echovirus 22 is an atypical enterovirus. J. Virol. 1999. № 64. Р. 2692-2701.
3. Stanway, G., and Hyypia T. Parechoviruses. J. Virol., 1999. Vol. 73. P. 52495254
4. Pham N.T., Trinh Q.D., Takanashi S. et. al. Novel Human Parechovirus, Sri Lanka. Emerg. Infect. Dis. 2010. № 16. Р. 130-132.
5. Голицына Л.Н., Зверев В.В., Новикова Н.А. и др. Обнаружение парэховирусов у детей с гастроэнтеритом. Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов; 2007 Апрель 26-27; Москва: Санэпидмедиа. 2007. Т. 2. С. 224-225.
6. Tamura K., Dudley J., Nei M. and Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution
2007. № 24. Р. 1596-1599.
7. Joki-Korpela P., Hyypia T. Diagnosis and epidemiology of Echovirus 22 infections. Clin. Infect. Dis. 1998. № 26. Р. 129-36.
8. Ghazi F., Hughes P.J., Tyypia T., Stanway G. Molecular analysis of human parechovirus type 2 (formely echovirus 23). J. Gen. Virol. 1998. № 79. Р. 2641-2650.
9. Joki-Korpela P., Roivanen M., Lankinen H. et. al. Antigenic properties of human parechovirus 1. J. Gen. Virol. 2000. № 81. Р. 1709-1718.
10. Oberste M.S., Maher K. and Pallansch M.A. Specific detection of echoviruses 22 and 23 in cell culture supernatants by RT-PCR . J. Med. Virol. 1999. № 58. Р. 178.
11. Benshop K., Thomas X., Serpenti C. et.al. High prevalence of human Parechovirus (HPeV) genotypes in the Amsterdam region and identification of specific HPeV variants by direct genotyping of stool samples. J. Clin. Microbiol.
2008. № 46. Р. 3965-3970.
12. Baumgarte S., de Souza Luna L.K., Grywna K. et.al. Prevalence, Types, and RNA Concentrations of Human Parechoviruses, Including a Six Parechovirus Type, in Stool Sampales from Patients with Acute Enteritis. J. Clin. Microbiol. 2008. № 46. Р. 242-248.
13. Benschop K.S.M., Schinkel J., Minnaar R.P. et. al. Human Parechovirus Infections in Dutch Children and the Association between Serotypeand Disease Severity Clin. Infect. Dis. 2006. № 42. Р. 204-210.
14. Watanabe K., Oie M., Higuchi M. et.al. isolation and characterization of novel human parechovirus from clinical samples. Emerg. Infect. Dis. 2007. № 13. Р. 889-895.
759 н.о.
VP1F VP1R
2332- 2349 3071-3090
422 н.о.
*2491-2509 2896-291*2
342 н.о.
"2581- 25992 908-2923
^F6^ 405н.о.
2521-2541
2909-2925
рис.
Унифицированная комплексная схема типовой идентификации ПЭВ
(позиции праймеров отмечены по геному HPEV 6 2005-823).
