CC BY
15
ЭЛЕКТРОННЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «АРНОГО. СЕРИЯ: ЕСТЕСТВЕННЫЕ И ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ»
УДК 612
№ 3 2016
МОДУЛЯЦИЯ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ САЕЫОР^НАВйтЭ ВШввЭАЕ АКТИВАЦИЕЙ МУСКАРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА
Калинникова Татьяна Борисовна
кандидат биологических наук Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, Казань
Хакимова Диляра Махмутриевна
кандидат медицинских наук Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
Гайнутдинов Марат Хамитович
доктор биологических наук Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, Казань
Аннотация. Показано, что агонист м-холинорецепторов нематод ареколин и низкие концентрации ингибиторов ацетилхолинэстеразы ал-дикарба и неостигмина вызывают сенситизацию плавания С. Ьпддзэв, индуцированного механическим стимулом, к действию агониста н-холинорецепторов левамизола. Эта сенситизация блокируется введением в среду антагониста м-холинорецепторов атропина. Результаты работы показывают, что чувствительность н-холинорецепторов С. Ьпддзэв модулируется активацией м-холинорецепторов.
Ключевые слова: Caвnorhabditis Ьпддзэв; поведение; никотиновые рецепторы ацетилхолина; мускариновые рецепторы ацетилхолина; модуляция.
MODULATION OF NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTORS OF SOIL NEMATODE CAENORHABDITIS BRIGGSAE BY ACTIVATION OF MUSCARINIC ACETYLCHOLINE RECEPTORS
Kalinnikova Tatiana Borisovna
candidate of biology
Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, Kazan
Khakimova Dilyara Makhmutrievna
candidate of medicine Kazan Federal University, Kazan
Gainutdinov Marat Khamitovich
doctor of biology
Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, Kazan
Abstract. It is shown that arecoline, agonist of nematode mAChRs, and low concentrations of ACh-esterase inhibitors aldicarb and neostigmine sensitized C. briggsae swimming, induced by mechanical stimulus, to levamisole, agonist of nAChRs. Atropine, antagonist of mAChRs, blocked this sensitization. Results of this work show that activation of mAChRs can modulate the sensitivity of C. briggsae nAChRs.
Key words: Caenorhabditis briggsae; behavior; nicotinic acetylcholine receptors; muscarinic acetylcholine receptors; modulation.
Холинергическая система была приобретена многоклеточными организмами животных на ранней стадии их эволюции. Она принимает участие в регуляции основных функций не только в организме человека, но в простых организмах круглых червей. Ацетилхолин в холинергиче-ском синапсе является сигнальной молекулой, которая при связывании с
постсинаптическими ионотропными никотиновыми рецепторами (н-холинорецепторы) осуществляет функции возбуждающего нейротранс-миттера, а при связывании метаботропными мускариновыми рецепторами ацетилхолин является нейромодулятором [1-3].
В организме человека и в организмах почвенных нематод ацетилхолин модулирует быструю холинергическую синаптическую трансмиссию, связываясь с м-холинорецепторами [3]. Известно, что у нематод эта модуляция осуществляется активацией двух подтипов м-холинорецепторов в холинергических нейронах, которая может изменять скорость секреции ацетилхолина в противоположных направлениях [3]. В то же время остается открытым вопрос о том, может ли ацетилхолин модулировать чувствительность н-холинорецепторов, активируя м-холинорецепторы в нейронах или мышцах нематод. Ранее нами было показано, что ареколин, являющийся у нематод агонистом м-холинорецепторов, но не н-холинорецепторов, сенситизирует поведение свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans к действию агонистов н-холинорецепторов [4]. В этой работе приведены результаты исследования возможной роли м-холинорецепторов в модуляции чувствительности н-холинорецепторов близкородственной к C. elegans нематоды Caenorhabditis briggsae.
Материалы и методы
Эксперименты проводили с C.briggsae линии дикого типа AF16, предоставленной Caenorhabditis Genetics Center. Нематод выращивали при 23°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод и E.coli OP50 для кормления [5]. Нематод двухдневного возраста трижды отмывали 10 мл NG буфера (0,3 % NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO4, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 6,0)) и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера.
Нарушения поведения, вызванные действием левамизола и алди-карба, регистрировали каждые 15 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Регистрируемыми изменениями поведения, вызванным левамизолом, неостигмином и алдикарбом, являлись нарушения моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем). Эти нарушения проявлялись в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания и плавании по кругу. До введения левамизола, неостигмина или алдикарба в среду нематод инкубировали индивидуально в течение 30 минут при 23°C в 1 мл NG буфера (контроль) или в 1 мл NG буфера с добавлением ареко-лина или ареколина и атропина (опыт).
В каждом варианте эксперимента использовано 30 червей. Эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера ф* В работе использовали реактивы фирмы Sigma. Высокие концентрации ареколина, атропина, левамизола, неостигмина и алдикарба, использованные в работе, объясняются особенностью C. briggsae как модельного организма, поскольку кутикула нематод обладает чрезвычайно низкой проницаемостью. Поэтому концентрации большинства лекарств и токсикантов, эффективные для изменения поведения C. briggsae, на порядки выше, чем у высших беспозвоночных.
Результаты и обсуждение
При изучении молекулярных механизмов функций холинергической системы нематод методами молекулярной генетики широко используется фармакологический анализ их поведения [2; 3; 6]. Этот анализ был использован и нами для выяснения вопроса о возможности модуляции чувствительности н-холинорецепторов активацией м-холинорецепторов.
Гиперактивация н-холинорецепторов их агонистами, такими как ле-вамизол и никотин, или аномальным повышением концентрации ацетил-холина при частичном ингибирования ацетилхолинэстеразы вызывает нарушения моторной программы плавания С. ЬпддБЭв, индуцированного механическим стимулом [1; 8]. Эти нарушения проявляются в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания и плавании по кругу.
Таблица 1
Влияние ареколина и атропина на чувствительность поведения Caenorhabditis briggsae к левамизолу
Условия эксперимента Доля нематод с нарушенной моторной программой плавания после 30-минутной экспозиции к левамизолу, %
левамизол, мкм
16 32 64
Контроль Ареколин 3,5 мМ Ареколин 7 мМ Ареколин 7 мМ + атропин 2 мМ 0 10 ± 2 61 ± 3°°° 8 ± 0 55 ± 3°°° 90 ± 4°°° 25 ± 40 ± 2 85 ± 4°°° 100°°° 65 ± 2^
Примечание: °°° - достоверность разницы между контролем (среда без ареколина) и опытом (среда с ареколином); °°° - p < 0,001; ••• - достоверность разницы между экспериментами в среде с 7 мМ ареколина и в среде с 7 мМ ареколина + 2 мМ атропина; ••• - p < 0,001.
Как показано в таблице 1, 30-минутная преинкубация С. Ьпддээв в среде с ареколином, который у нематод является агонистом м-холинорецепторов, но не н-холинорецепторов [2; 7] вызывает сильное увеличение чувствительности поведения к действию левамизола - аго-ниста н-холинорецепторов нематод. Это увеличение проявляется в снижении концентрации левамизола, эффективной для нарушения моторной программы плавания, в 3 раза. Введение в среду антагониста м-холинорецепторов атропина блокирует сенситизацию чувствительности
поведения к левамизолу, индуцированную ареколином (см. табл. 1). Результаты этих экспериментов показывают, что активация м-холинорецепторов ареколином увеличивает чувствительность н-холинорецпторов С. Ьпддзэв.
Частичное ингибирование ацетилхолинэстеразы введением алди-карба или неостигмина вызывает сходные с действием левамизола нарушения моторной программы плавания [1; 8], являющиеся следствием гиперактивации н-холинорецпторов повышением концентрации аце-тилхолина. В то же время ацетилхолин активирует не только н-холинорецепторы, но и м-холинорецепторы нематод [2; 3]. Поэтому влияние ареколина на чувствительность н-холинорецепторов позволило предположить, что и частичное ингибирование ацетилхолинэстеразы может вызывать не только гиперактивацию н-холинорецепторов, но и активацию м-холинорецепторов, ограничивающую действие ацетилхо-лина на н-холинорецепторы. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты, в которых исследовалось совместное действие ингибиторов ацетилхолинэстеразы алдикарба и неостигмина и левамизола на поведение С. Ьпддзэв. В этих экспериментах использовались алдикарб и неостигмин в концентрациях, подпороговых для нарушения поведения С. Ьпддзэв.
Как показано в таблице 2, низкие концентрации алдикарба и неостигмина увеличивают чувствительность поведения к действию левами-зола, и эта сенситизация блокируется введением в среду атропина. Следовательно, не только ареколин, но и ацетилхолин могут вызывать сенситизацию н-холинорецепторов С. Ьпддзэв, связываясь с м-холинорецепторами.
В геноме С. в1вдэпз, нематоды, близкородственной С. Ьпддзэв, идентифицированы три гена м-холинорецепторов - дэг-1, дэг-2 и дэг-3 [2; 9]. Только рецептор GAR-3 обладает значительной чувствительностью к антагонисту м-холинорецепторов атропину. У GAR-2 чувстви-
тельность к атропину полностью отсутствует, а у GAR-1 она выражена слабо [9]. В ходе эволюции нематод появились относительно небольшие различия организмов свободноживущих и паразитических нематод, а также между нематодами одного рода Caenorhabditis [10]. Это позволяет использовать при обсуждении результатов данной работы результаты исследований молекулярных механизмов функций м-холинорецепторов С. в1вдэпз. Ареколин - это агонист м-холинорецепторов С. в1вдэпз [2], и его действие на функции организма С. в1вдэпз является следствием активации GAR-3 м-холинорецепторов. Поэтому наиболее вероятной причиной сенситизации н-холинорецепторов С. Ьпддзэв является активация GAR-3 м-холинорецепторов. В соответствии с этим предположением находится чувствительность этой сенситизации к атропину, который действует на GAR-3 рецепторы С. в1вдэпз, но не на GAR-1 или GAR-2 м-холинорецепторы. У С. в1вдэпз гены дэг-3 экспрессируются как во многих нейронах, так и мышцах тела [2]. Поэтому двумя возможными мишенями действия ареколина на чувствительность поведения С. Ьпддзэв к левамизолу являются нейроны и локомоторные мышцы этой нематоды.
Таблица 2
Влияние алдикарба и неостигмина на чувствительность поведения Caenorhabditis briggsae к левамизолу
Условия эксперимента Доля нематод с нарушенной моторной программой плавания после 30-минутной экспозиции к левамизолу, %
левамизол, мкм
32 64 128
Контроль 0 38 ± 2 85 ± 4
Алдикарб 30 мкМ 66 ± 3°°° 95 ± 3°°° 100
Алдикарб 30 мкМ + 11 ± 45 ± 2^ 91 ± 5
атропин 2 мМ
Неостигмин 3 мМ 58 ± 2°°° 92 ± 4°°° 100
Неостигмин 3 мМ + 15 ± 2— 41 ± 3— 87 ± 4
атропин 2 мМ
Примечание: °°° - достоверность разницы между контролем (среда без добавок) и опытом (среда с алдикарбом или неостигмином); °°° - p < 0,001. ••• - достоверность разницы между экспериментами в среде с алдикарбом или неостигмином и в среде с 2 мМ атропина; ••• - p < 0,001.
В наших экспериментах чувствительность С. Ьпддэав к левамизолу оценивалась по нарушениям моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом, хотя при действии более высоких концентраций левамизола или увеличении времени экспозиции к нему наступает полное обездвиживание (паралич) нематод. Причиной этого паралича является гиперсокращение мышц, сменяющееся их необратимым расслаблением в результате гиперактивации мышечных н-холинорецепторов [1; 6]. В то же время нарушения моторной программы плавания концентрациями левамизола, подпороговыми для индукции паралича нематод, не могут быть объяснены гиперактивацией мышечных н-холинорецепторов, но хорошо объясняются активацией н-холинорецепторов в нейронах, принимающих участие в регуляции локо-моции. В соответствии с этим объяснением находится экспрессия у С. ввдапв генов субъединиц н-холинорецепторов как в возбуждающих и ингибиторных моторных нейронах, так и во многих интернейронах [1].
Известно, что у млекопитающих холинергическая синаптическая трансмиссия модулируется активацией м-холинорецепторов на преси-наптическом уровне изменением скорости секреции ацетилхолина нейронами [3]. В то же время в этой и в нашей предыдущей работе [4] впервые показано наличие у нематод модуляции холинергических синапсов на постсинаптическом уровне изменением чувствительности н-холинорецепторов в нейронах и, возможно, в мышцах. Два возможных объяснения отсутствия сведений о такой модуляции у млекопитающих заключаются в следующем: 1. Модуляция н-холинорецепторов активацией м-холинорецепторов
приобретена многоклеточными организмами животных на ранней
стадии их эволюции простыми организмами круглых червей, но не сохранилась при последующем усложнении организмов в ходе эволюции.
2. Эта модуляция существует в центральных, но не периферических процессах в холинергической системе млекопитающих, но не обнаружена в настоящее время из-за методических сложностей электрофизиологических исследований нейронов головного мозга грызунов.
Список использованных источников
1. Jospin M., Qi Y.B., Stawicki .M., Boulin T., Schuske K.R., Horvitz H.R., Bessereau J.-L., Jorgensen E.M., Jin Y. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caeno-rhabditis elegans // PLoS Biology. 2009. V. 7. e1000265.
2. Steger K., Avery, L. The GAR-3 muscarinic receptor cooperates with calcium signals to regulate muscle contraction in the Caenorhabditis elegans pharynx // Genetics. 2004. V. 167. P. 633-643.
3. Dittman J.S., Kaplan J.M. Behavioral impact of neurotransmitter-activated GPCRs: muscarinic and GABAB receptors regulate C. elegans locomotion // J. Neurosci. 2008. V. 28. P. 7104-7112.
4. Гайнутдинов М.Х., Белова Е.Б., Калинникова Т.Б., Колсанова Р.Р., Шагидуллин Р. Р. Сенситизация никотиновых рецепторов ацетилхо-лина почвенной нематоды Caenorhabditis elegans активацией муска-риновых рецепторов ареколином // Журн. эвол. биох. физиол. 2015. Т. 51. № 4. С. 305-307.
5. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V. 77. P. 71-94.
6. Gottschalk A., Almedom R.B., Schedletzky T., Anderson S.D., Yates J.R., Schafer W.R. Identification and characterization of novel nicotinic
receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans // The EMBO J. 2005. V. 24. P. 2566-2578.
7. Chan J.P., Staab T.A., Wang H., Mazzasette C., Butte Z., Sieburth D. Extrasynaptic muscarinic acetylcholine receptors on neuronal cell bodies regulate presynaptic function in Caenorhabditis elegans // J. Neurosci. 2013. V. 33. P. 14146-14159.
8. Kalinnikova T.B., Shagidullin R.R., Kolsanova R.R., Osipova E.B., Zakh-arov S.V., Gainutdinov M.Kh. Acetylcholine deficiency in Caenorhabditis elegans induced by hyperthermia can be compensated by ACh-esterase inhibition or activation of GAR-3 mAChRs // Environ. Nat. Resources Res. 2013. V. 3. P. 98-113.
9. Lee Y.S., Park Y.S., Nam S., Suh S.J., Lee J., Kaang B.K., Cho N.J. Characterization of GAR-2, a novel G protein-linked acetylcholine receptor from Caenorhabditis elegans // J. Neurochem. 2000. V. 75. P. 18001809.
10. Stein L.D., Bao Z., Blasiar D., Blumenthal T. et al. The genome sequence of Caenorhabditis briggsae: a platform for comparative genomics // PLoS Biology. 2003. V. 1. P. 166-192.
