CC BY
20
РЕГУЛЯЦИЯ СЕРОТОНИНОМ И ОКТОПАМИНОМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ CAENORHABDITIS ELEGANS К ЛЕВАМИЗОЛУ, НИКОТИНУ И АЛДИКАРБУ
УДК 574.2
Е.Б. Белова1, А.Ф. Яхина12, Р.Р. Колсанова1
'Институт проблем экологии и недропользования АН РТ, [email protected] 2Казанский (Приволжский) федеральный университет
РЕГУЛЯЦИЯ СЕРОТОНИНОМ И ОКТОПАМИНОМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ CAENORHABDITIS ELEGANS К ЛЕВАМИЗОЛУ, НИКОТИНУ И АЛДИКАРБУ
В экспериментах с почвенной нематодой Caenorhabditis elegans показано, что экзогенные ок-топамин и серотонин, а также повышение уровня эндогенного серотонина нуль-мутацией гена переносчика серотонина mod-5(n3314) вызывают сенситизацию н-холинорецепторов к их агони-стам левамизолу и никотину и ингибитору ацетилхолинэстеразы алдикарбу.
Ключевые слова: Caenorhabditis elegans; поведение; никотиновые рецепторы ацетилхолина; никотин; левамизол; алдикарб; серотонин; октопамин.
Введение
Холинергическая система играет ключевую роль в регуляции всех основных функций организмов человека и животных. Известно, что активация центральных процессов холинергической системы в головном мозге является одним из механизмов адаптивной стресс-реакции организмов человека и животных на сильные изменения окружающей среды (Mineur et al., 2013). Ранее было показано, что и в простом организме почвенной нематоды Caenorhabditis elegans адаптивная активация холинергической системы индуцируется такими стрессовыми условиями среды как превышение физиологического оптимума температуры и отсутствие пищи (Калинникова и др., 2015). Механизмом активации холинергической системы C. elegans тепловым стрессом является сенситизация никотиновых рецепторов ацетилхолина (н-холинорецепторов) (Калинникова и др., 2015). Эта сенситизация может быть следствием модуляции н-холинорецепторов биогенными аминами в результате стимуляции их секреции сигналами из термосенсорных нейронов в условиях теплового стресса. Целью данной работы явилась экспериментальная проверка этой гипотезы с использованием серотонина, являющегося нейромодулятором в организмах как C. elegans, так и человека (Hardaker et al., 2001; Nurrish et al., 1999), и октопамина - биогенного амина, который в организмах беспозвоночных осуществляет функции, сходные с функциями но-радреналина в организмах человека и грызунов (Roeder et al., 2003).
Материал и методы исследования
Эксперименты проводили с C.elegans линий дикого типа N2 и мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314)), предоставленных Caenorhabditis Genetics Center. Нематод выращивали при 21°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод и E.coli OP50 для кормления (Brenner, 1974). Нематод трехдневного возраста трижды отмывали 10 мл NG буфера (0,3 % NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO4, 25 мМ калийфосфат-ного буфера (pH 7,0)) и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера с добавлением серотонина креатинин сульфата или октопамина. Через 30 мин добавляли левамизола гидрохлорид, никотина гемисульфат или алдикарб. Нарушения поведения, вызванные действием агонистов н-холинорецепторов или алдикарба, регистрировали каждые 15 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Показателем действия левамизола, никотина и алдикарба на поведение C.elegans являлось нарушение моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем). Эти нарушения проявлялись в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания и плавании по кругу. В каждом варианте эксперимента использовано 30 червей. Эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера ф*. В работе использовали реактивы фирмы Sigma.
38
российский журнал прим экологии
Результаты и их обсуждение
Одним из основных подходов к выяснению функций биогенных аминов в организме С. elegans является изучение действия экзогенного серотонина, дофамина и октопамина на поведение, размножение и другие функции организма этой нематоды. Этот подход был использован нами для выяснения возможности модуляции серотонином и октопамином чувствительности н-холинорецепторов. Как показано на рисунке 1, экзогенный серотонин в концентрациях 2 мМ вызывает сильное увеличение чувствительности плавания С. elegans, индуцированного механическим стимулом, к действию левамизола, являющегося селективным агонистом н-холи-норецепторов нематод. Серотонин увеличивает
0 15 30 60
Левамизол
Рис. 1. Влияние серотонина и мутации гена переносчика серотонина mod-5(n3314) на чувствительность поведения С. elegans к левамизолу.
По оси ординат - доля червей с нормальным поведением после 15-минутной экспозиции к левамизолу. По оси абсцисс-концентрация левамизола, мкМ. В каждом варианте использовано 30 нематод.
*** достоверность разницы между контролем (линия N2 в среде без серотонина) и опытом (линия МТ9772 (mod-5(n3314)) или линия N2 в среде с 2 мМ серотонина), р < 0.001
чувствительность поведения C. elegans не только к левамизолу, но и к другому агонисту н-холинорецепторов - никотину (табл.). Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что экзогенный серотонин вызывает сенситизацию н-холинорецепторов C. elegans.
Известно, что действие экзогенных биогенных аминов на организмы нематод проявляется только при высоких их концентрациях (2-10 мМ) (Harda-ker et al., 2001; Nurrish et al., 1999 Hardaker et al., 2001; Nurrish et al., 1999). Это объясняется такими хорошо известными особенностями организмов нематод как чрезвычайно низкая проницаемость кутикулы для органических и неорганических веществ и низкая скорость обмена между окружающей жидкой средой и кишечником, из-за которых концентрации лекарств и токсикантов, эффективные для изменения поведения и выживания, в экспериментах с C. elegans на 3-5 порядков выше, чем в экспериментах с высшими беспозвоночными (Daphnia magna и др.). Концентрации серотонина, эффективные для повышения чувствительности поведения C. elegans к агонистам н-холинорецепторов (рис. 1, табл.), те же, что и концентрации серотонина, изменяющие спонтанную локомоцию и размножение C. elegans (Harda-ker et al., 2001; Nurrish et al., 1999).
Для выяснения вопроса о возможности модуляции н-холинорецепторов эндогенным серото-нином были проведены эксперименты, в которых сравнивалась чувствительность поведения к лева-мизолу и никотину у нематод линии дикого типа N2 и нематод мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314)) с мутацией гена переносчика серотони-на. Мутация этого гена вызывает повышение вне-нейронального серотонина в организме C. elegans (Ranganathan et al., 2001), а в наших экспериментах она увеличивает чувствительность поведения C. elegans к левамизолу и никотину (рис. 1, табл.).
Таблица. Влияние серотонина и мутации гена переносчика серотонина mod-5(n3314) на чувствительность поведения С. elegans к никотину и алдикарбу
Условия эксперимента Доля червей с нарушенной моторной программой плавания после 15-минутной инкубации с никотином или алдикарбом, %
никотин алдикарб
0.6 мМ 1.2 мМ 2.4 мМ 8 мкМ 16 мкМ 32 мкМ
Линия N2 0 16±2 31±3 0 0 41±2
Линия MT9772 (mod-5(n3314)) 28±2*** 47±3*** 71±4*** 19±1*** 49±2*** 100***
Линия N2 + серотонин 21±1*** 49±3*** 81±4*** 22±1*** 57±3*** 91±3***
Примечание: *** достоверность разницы между контролем (линия N2 в среде без серотонина) и опытом (линия МТ9772 (mod-5(n3314)) или линия N2 в среде с 2 мМ серотонина), р < 0.001
2/2016
39
РЕГУЛЯЦИЯ СЕРОТОНИНОМ И ОКТОПАМИНОМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ CAENORHABDITIS ELEGANS К ЛЕВАМИЗОЛУ, НИКОТИНУ И АЛДИКАРБУ
Следовательно, как экзогенный, так и эндогенный серотонин модулируют н-холинорецепторы, повышая их чувствительность к левамизолу и никотину.
Как показано в таблице, экзогенный серотонин и мутация гена mod-5(n3314) вызывают увеличение чувствительности поведения C. elegans не только к агонистам н-холинорецепторов, но и к ингибитору ацетилхолинэстеразы (АХ-эсте-разы) алдикарбу. Нарушения моторной программы плавания частичным ингибированием АХ-эстеразы являются следствием гиперактивации н-холинорецепторов (Nurrish et al., 1999; Rand, 2007). Поэтому увеличение чувствительности н-холинорецепторов к алдикарбу экзогенным и эндогенным серотонином объясняется сенситиза-цией н-холинорецепторов, которая выявляется в условиях аномального повышения концентрации ацетилхолина (АХ).
В связи с тем, что серотонин и октопамин вызывают как разнонаправленные (Horvitz et al., 1982), так и однонаправленные (Noble et al., 2013) изменения функций организма C. elegans, нами были проведены эксперименты, в которых исследовалось влияние октопамина на чувствительность н-холинорецепторов C. elegans.
Как показано на рисунке 2, октопамин оказывает сходное с серотонином влияние на чувствительность поведения C. elegans к действию левамизола, которое проявляется в усилении на-
рушений моторной программы плавания, индуцированных агонистами н-холинорецепторов. В среде с октопамином выявляется и повышенная чувствительность поведения C. elegans к частичному ингибированию АХ-эстеразы алдикарбом (рис. 2). Следовательно, октопамин вызывает активацию холинергической трансмиссии на постсинаптическом уровне модуляцией чувствительности н-холинорецепторов.
Известно, что модуляция синаптической трансмиссии серотонином в организмах высших беспозвоночных происходит не только на преси-наптическом, но и на постсинаптическом уровне (Butt et al., 2002). В то же время в этой работе впервые показано, что модуляция холинерги-ческой трансмиссии биогенными аминами происходит в простой нервной системе нематод на постсинаптическом уровне. Остается открытым вопрос о том, какую роль модуляция н-холино-рецепторов серотонином и октопамином играет в осуществляемой биогенными аминами регуляции поведения и физиологического состояния C. elegans. В то же время н-холинорецепторы являются молекулярной мишенью действия ряда антигельминтных средств, включающих в себя левамизол, на организмы паразитических нематод (Dent, 2001). В связи с большим сходством организации C. elegans и паразитических нематод организм C. elegans является удобной моделью для изучения механизмов действия нематоцидов
А
S S <и ч <и в о с
л s s
<и
3
^
& s
о за <и
в &
<и
Т -
4 о
ч
100 %
80 60 40 20 -\ 0
J3
8 16 32
Алдикарб □ Контроль □+ 1 мМ октопамина
S S <и ч <и в о с
л s s
<и
3 &
я s
о за <и
в &
<и
Т -
4 о
ч
100 80 60 40 20 0
%
J3
16 32 64
Левамизол
□ Контроль □+ 1 мМ октопамина
Рис. 2. Влияние октопамина на чувствительность поведения С. elegans к действию алдикарба и
левамизола.
По оси ординат - доля нематод с нарушениями поведения после 15-минутной экспозиции к алдикарбу (А) и левамизолу (Б). По оси абсцисс - концентрация алдикарба (А) и левамизола (Б), мкМ. Алдикарб и левамизол добавляли после 30-минутной инкубации нематод в среде с 1 мМ октопамина или без него (контроль). В каждом варианте использовано 30 нематод. *** достоверность разницы между контролем (среда без октопамина) и опытом (среда с 1 мМ октопамина), р < 0.001
Б
4!
российский журннл ориклнлной экологии
(Dent, 2001). Поэтому результаты работы могут рассматриваться как свидетельство участия серо-тонина и октопамина в регуляции эффективности токсического действия нематоцидов-агонистов н-холинорецепторов на организмы не только C. elegans, но и паразитических нематод.
Список литературы
1. Калинникова Т.Б., Белова Е.Б., Колсанова Р.Р., Гайнут-динов М.Х. Активация холинергической системы почвенной нематоды Caenorhabditis elegans стрессовыми условиями окружающей среды // Российский журнал прикладной экологии. 2015. № 1. С. 71-75.
2. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V. 77. P. 71-94.
3. Butt S.J., Pitman R.M. Modulation by 5-hydroxytrypt-amine of nicotinic acetylcholine responses recorded from an identified cockroach (Periplaneta Americana) motoneurons // Eur. J. Neurosci. 2002. V. 15. P. 429-438.
4. Dent J.A. What can Caenorhabditis elegans tell us about nematocides and parasites? // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2001. V. 6. P. 252-263.
5. Hardaker L.A., Singer E., Kerr R., Zhou G., Schafer W. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans // J. Neurobiol. 2001. V. 49. P. 303-313.
6. Horvitz H.R., Chalfie M., Trent C., Sulston J.E., Evans P.D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans // Science. 1982. V. 216. P. 1012-1014.
7. Mineur Y.S., Obayemi A., Wigestrand M.B., Fote G.M., Calarco C.A., Li A.M. Picciotto M.R. Cholinergic signaling in the hippocampus regulates social stress resilience and anxiety- and depression-like behavior // PNAS. 2013. V. 110. P. 3573-3578.
8. Noble T., Stieglitz J., Srinivasan S. An integrated serotonin and octopamine neuronal circuit directs the release of an endocrine signal to control C. elegans body fat // Cell Metabolism. 2013. V. 18. P. 672-684.
9. Nurrish S., Ségalat L., Kaplan J.M. Serotonin inhibition of synaptic transmission: Ga0 decreases the abundance of UNC-13 at release sites // Neuron. 1999. V. 24. P. 231-242.
10. Rand J.B. Acetylcholine // Wormbook / ed. The C. elegans Research Community, Wormbook. 2007 [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.wormbook.org (Дата обращения: 17.03.2016).
11. Ranganathan R., Sawin E.R., Trent C., Horvitz H.R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine // J. Neurosci. 2001. V. 21. P. 5871-5884.
12. Roeder T., Seifert M., Kahler C., Gewecke M. Tyramine and octopamine: antagonistic modulators of behavior and metabolism // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 2003. V. 54. P. 1-13.
E.B. Belova, A.F. Yakhina, R.R. Kolsanova. Serotonin and octopamine regulation of the soil nematode Caenorhabditis elegans sensitivity to le-vamisole, nicotine and aldicarb.
Experiments with soil nematode C. elegans showed that exogenous octopamine and serotonin, as well as increase of the level of endogenous serotonin null mutation in the serotonin transporter gene mod-5 (n3314) cause sensitization of nicotinic acetylcholine receptors to their agonists levamisole and nicotine and to acetylcholinesterase inhibitor aldicarb.
Keywords: Caenorhabditis elegans; behavior; nicotinic acetylcholine receptors; nicotine; levami-sole; aldicarb; serotonin; octopamine.
2/2016
41
