CC BY
23
экспериментальная экология
УДК 574.2
Т.Б. Калинникова, Е.Б. Белова, Р.Р. Колсанова, М.Х. Гайнутдинов
Институт проблем экологии и недропользования АН РТ, [email protected]
активация холинергической системы почвенной
нематоды CAENORHABDITIS ELEGANS стрессовьши
условиями окружающей средь
В экспериментах с почвенными нематодами C. elegans показано, что двухчасовое голодание и тепловой стресс (30 минут при 33 °C) вызывают активацию холинергической системы нематод, выявляющуюся в увеличении чувствительности их локомоции к частичному ингибированию АХ-эс-теразы алдикарбом. Причиной активации холинергической системы тепловым стрессом является сенситизация н-холинорецепторов, проявляющаяся в сильном увеличении чувствительности поведения к их агонистам левамизолу и никотину. Адаптивное значение активации холинергической системы C. elegans стрессовыми условиями среды может определяться ее участием в таких формах поведения, как избегание среды с высокой температурой и поиск пищи.
Ключевые слова: Caenorhabditis elegans; стресс; холинергическая система; поведение.
Введение
Адаптация организмов животных к неблагоприятным изменениям окружающей среды включает в себя изменения физиологического состояния организма, повышающие его резистентность к действию экстремальных факторов среды, угрожающих жизни животного, и адаптивные изменения поведения, позволяющие избежать или ослабить повреждающее действие экстремального фактора среды (Раушенбах, 1997; Selye, 1956, 1975; Wendelaar Bonda, 1997). Адаптивные изменения как физиологического состояния, так и поведения многоклеточных организмов животных, индуцированные стрессовыми условиями среды, запускаются сигналами из нервной системы (Wendelaar Bonda, 1997; Suo et al., 2006; Tottenham, Sheridan, 2010). Из-за чрезвычайной сложности организации нервных систем позвоночных во многом остаются неизвестными механизмы процессов обработки информации о стрессовых условиях окружающей среды и формировании программ адаптивных форм поведения и сигналов, поступающих в гипоталамус из высших отделов головного мозга. В то же время известно, что быстрая активация холинергической системы в головном мозге при действии стресса на организм грызунов является одним из ключевых механизмов генерации форм поведения, индуцированных стрессом (Gilad, 1987; Mineur et al., 2013).
Почвенная нематода C. elegans широко используется как модельный организм при изучении молекулярных механизмов процессов, происходящих в нервной системе человека в норме и при патологии, из-за высокой консервативности многих молекулярных механизмов функций нервной системы в эволюции. Поэтому можно предположить, что и активация холинергической системы
стрессовыми условиями окружающей среды как адаптивная реакция появилась на ранней стадии эволюции у простых организмов круглых червей. Целью работы явилась проверка этой гипотезы с использованием в качестве модельного организма C. elegans.
Материалы и методы
Эксперименты проводили с C. elegans линии дикого типа N2, полученной из Caenorhabditis Genetics Center, выращенными при 22 °C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (Brenner, 1974). Для кормления нематод использовали E.coli oP50. Для определения чувствительности поведения к ингибитору ацетилхолинэстеразы (АХ-эстеразы) алдикарбу и агонистам никотиновых рецепторов ацетилхоли-на (н-холинорецепторов) левамизолу и никотину нематод двухдневного возраста трижды отмывали от среды выращивания и E.coli 10 мл NG буфера (0.3% naCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgSo4, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 6.0)) и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера с добавлением алдикарба, левамизола или никотина. Нарушения поведения, вызванные ингибировани-ем АХ-эстеразы или действием агонистов н-холи-норецепторов, регистрировали через 30 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Показателями действия алдикарба, лева-мизола и никотина на поведение C. elegans являлись нарушения моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхиванием пробирки с червем). Эти нарушения проявлялись в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, временной приостановке плавания, плавании по кругу и др. Эксперименты проводили
при трех разных температурах: 22, 30 и 33 °C. В каждом варианте эксперимента использовали 30 червей. Статистическую обработку результатов проводили с использованием ¿-критерия Стьюден-та. В работе использовали реактивы фирмы Sigma.
Результаты и их обсуждение
Для выяснения вопроса о возможном участии холинергической системы C. elegans в адаптивной реакции на стрессовые условия среды были проведены эксперименты, в которых использованы такие неблагоприятные для организма изменения окружающей среды, как переносимое организмом C. elegans кратковременное действие высокой температуры (30-33 °C) и прекращение доступа нематод к пище.
Одним из подходов при изучении роли холи-нергической системы как в реакции нервной системы грызунов на стресс, так и в формировании у них хроническим стрессом форм поведения, сходных с депрессией у человека, является фармакологический анализ. Этот анализ включает в себя активацию холинергической системы инъекцией в головной мозг ингибиторов АХ-эстеразы или агонистов рецепторов ацетилхолина (АХ) с последующей регистрацией изменений поведения, индуцированных этими воздействиями (Mineur et al., 2013). Необходимость локальных инъекций ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов рецепторов АХ в головной мозг, а не в тело грызунов определяется наличием гематоэнцефали-ческого барьера, препятствующего поступлению лекарств и токсинов в ЦНС, и сильном влиянии этих фармакологических воздействий на периферические функции холинергической системы в
сердце, сосудах и органах дыхания. В то же время в простом организме C. elegans отсутствуют как гематоневральный барьер, так и сердечно-сосудистая система и орган внешнего дыхания. Это позволяет проводить фармакологический анализ функций холинергической системы C. elegans введением ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов и антагонистов рецепторов АХ в среду инкубации нематод (Boulin et al., 2008; Jospin et al., 2009; Petrash et al., 2013).
15
& s
s a
° та « &
<D S
M о
a & 2 G
100 90
80 70
60 50
□ Контроль □ Голодание ri
40 30
20 10
■
« 8 16 32
Концентрация алдикарба, мкмоль
Рис. 2. Влияние двухчасового голодания на чувствительность поведения С. е^ат к алдикарбу.
Время экспозиции нематод к алдикарбу 30 минут.
В каждом варианте использовано 30 червей.
В экспериментах сравнивалась чувствительность плавания С. elegans, индуцированного механическим стимулом, к действию ингибитора АХ-эстеразы алдикарба в оптимальных условиях среды и в условиях теплового стресса или кратковременного голодания. Как показано на рис. 1 и 2, как тепловой стресс, так и отсутствие пищи
К Е
s 3
Я M
и й
п о a & и с F ¡s
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
16
32
64
Концентрация алдикарба, мкмоль
Рис. 1. Влияние теплового стресса на чувствительность поведения С. elegans к действию алдикарба. Время экспозиции нематод к алдикарбу при температуре 22, 30 или 33 °С - 30 минут. В каждом варианте использовано 30 червей.
s к
S Я
« S
5 a И я
(D (3
э g
6 а
100 90
80 70
>я ь
(D ^ ffl О
S
« 8
60 50
40
30 -20
10
15 30 60
Концентрация левамизола, мкмоль
Рис. 3. Влияние теплового стресса на чувствительность поведения С. elegans к действию левамизола. Время экспозиции нематод к левамизолу при температуре 22, 30 или 33 °С - 30 минут. В каждом варианте использовано 30 червей.
0
0
72 российский журнал прикладной ЭШйй
в течение 2 часов вызывают увеличение чувствительности поведения к алдикарбу, которое проявляется в снижении концентрации алдикарба, эффективной для нарушения моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом. АХ-эстераза - это фермент, который гидролизует АХ, секретируемый нейронами. Ее частичное ингибирование алдикарбом и другими ингибиторами вызывает активацию холинергиче-ской системы увеличением концентрации АХ в холинергических синапсах. Чрезмерная активация холинергической системы частичным инги-бированием АХ-эстеразы вызывает нарушения поведения как у грызунов (Mineur et al., 2013), так и у C. elegans (рис. 1-2) (Jospin et al., 2009). Изменения чувствительности грызунов к действию ингибиторов АХ-эстеразы, нарушающему поведение, индуцированные стрессовыми условиями среды (Mineur et al., 2013), и эти же изменения, индуцированные у C. elegans мутациями генов, регулирующих функции холинергической системы (Jospin et al., 2009; Petrash et al., 2013), свидетельствуют об изменениях активности холинер-гической системы. Поэтому результаты наших экспериментов показывают, что тепловой стресс и голодание вызывают активацию холинергической системы C. elegans, проявляющуюся в сенситиза-ции поведения к повышению концентрации АХ алдикарбом.
Двумя возможными механизмами активации холинергической системы C. elegans тепловым стрессом и кратковременным голоданием являются стимуляция секреции АХ нейронами или повышение чувствительности рецепторов АХ в нейронах и мышцах тела нематоды.
Для выяснения возможной роли чувствительности рецепторов АХ в активации холинергиче-ской системы C. elegans тепловым стрессом были проведены эксперименты, в которых сравнивалась чувствительность поведения к действию аго-нистов н-холинорецепторов C. elegans левамизола и никотина при температуре выращивания 22 °C и при высокой температуре среды (30-33 °C). Как показано на рис. 3, повышение температуры среды с 22 до 30 °C вызывает умеренное увеличение чувствительности поведения C. elegans к действию левамизола, в то время как при дальнейшем повышении температуры до 33 °C чувствительность к действию левамизола значительно увеличивается. Сходное влияние тепловой стресс оказывает и на чувствительность поведения C. elegans к другому агонисту н-холинорецепторов никотину (рис. 4). Эти данные свидетельствуют о том, что механизмом активации холинергической
системы С. elegans тепловым стрессом является сенситизация н-холинорецепторов, а не стимуляция секреции АХ.
г s
§ IS
х м
a tä
^ s
u ö
=S a
и ^
ш о
а а
и с F ;S
?! § [2 о ° tks
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
□ 22 °С ш30 °С D33 °С
0.62 1.25
Концентрация никотина, ммоль
Рис. 4. Влияние теплового стресса на чувствительность поведения С. в^ат к действию никотина. Время экспозиции нематод к никотину при температуре 22, 30 или 33 °С - 30 минут.
В каждом варианте использовано 30 червей.
Ограничение пищевых ресурсов, так же как и сильное превышение физиологического оптимума температуры, является для организмов животных одним из основных стрессов, вызывающих адаптивные изменения как поведения, так и физиологического состояния организма ^ио et а1., 2006). В связи с тем, что активация холинергической системы С. вlвgans выявляется как при тепловом стрессе (рис. 1), так и при кратковременном голодании (рис. 2), очевидно, что она адаптивна как при неблагоприятном увеличении температуры окружающей среды, так и при дефиците пищевых ресурсов. В то же время результаты наших экспериментов выявили различия в активации холинер-гической системы С. вlвgans тепловым стрессом и кратковременным голоданием. Во-первых, голодание в течение двух часов является для С. вlвgans чрезвычайно мягким стрессом, который формирует адаптивные формы поведения, но не вызывает экспрессию генов стрессовых белков (белки теплового шока, антиоксидантные белки и др.) ^ио et а1., 2006), в то время как температура 33 °С является достаточно сильным стрессовым воздействием на организм С. вlвgans, индуцирующим экспрессию генов стрессовых белков (Калинникова и др., 2006). В то же время влияние двухчасового голодания на чувствительность поведения С. вlвgans к частичному ингибированию АХ-эсте-разы алдикарбом значительно сильнее, чем повышение температуры до 33 °С (рис. 1, 2). Во-вторых, повышение температуры до 30 °С вызывает значительное увеличение чувствительности пове-
дения C. elegans к агонисту н-холинорецепторов левамизолу (рис. 1) без изменения чувствительности к алдикарбу (рис. 3). В-третьих, отсутствует корреляция между изменениями чувствительности к левамизолу и алдикарбу, индуцированными тепловым стрессом и голоданием. При температуре 33 °C выявляется сильное увеличение чувствительности н-холинорецепторов к левамизолу (в 4 раза) и только в два раза повышается чувствительность к алдикарбу, хотя при двухчасовом голодании в 4 раза повышается чувствительность к алдикарбу, а чувствительность к левамизолу в экспериментах не изменялась.
Возможные объяснения этих различий влияния теплового стресса и голодания на холинергиче-скую систему C. elegans сводятся к следующему:
1. Активация холинергической системы может осуществляться как стимуляцией секреции АХ нейронами, так и сенситизацией н-холинорецеп-торов, и возможны различия влияния теплового стресса и голодания на эти два процесса, выявляющиеся в проведенных экспериментах.
2. Ранее нами было показано, что экстремальная высокая температура 36° C вызывает не активацию холинергической системы C. elegans, а напротив, нарушает ее функции ингибированием секреции АХ (Kalinnikova et al., 2013). Поэтому возможно, что и умеренный тепловой стресс (30-33° C) также снижает скорость секреции АХ, но одновременно вызывает и сенситизацию н-холинорецепторов, и этим объясняется сильное влияние теплового стресса на чувствительность поведения к левамизолу (рис. 3) при умеренном его влиянии на чувствительность поведения к ал-дикарбу (рис. 1).
Независимо от вопроса о механизмах активации холинергической системы тепловым стрессом и голоданием результаты работы свидетельствуют о том, что эта активация является адаптивной реакцией организма C. elegans на стрессовые условия окружающей среды. В связи с тем, что стресс вызывает активацию холинергической системы не только у C. elegans, но и в таких отделах головного мозга грызунов, как гиппокамп и амигдала (Mineur et al., 2013), очевидно, что эта активация появилась как адаптация к стрессовым условиям среды уже у простых организмов круглых червей и сохранилась у млекопитающих и человека. В то же время известно, что у грызунов стресс активирует холинергическую систему в головном мозге стимуляцией секреции АХ (Mineur et al., 2013), хотя ее активация у C. elegans тепловым стрессом происходит в результате сенсити-зации н-холинорецепторов. Поэтому возможно,
что активация холинергической системы является общей для организмов грызунов адаптивной реакцией на стресс, но механизмы этой реакции у грызунов и C. elegans различны.
Адаптивное значение активации холинергической системы стрессом заключается в формировании программ поведения, позволяющих избежать или ослабить повреждающее действие экстремальных факторов среды на организм. Очевидно, что и у C. elegans активация холинер-гической системы стрессом является компонентой формирования адаптивных форм поведения, так как избегание повреждающего действия теплового стресса (Mohammadi et al., 2013) и поиск местообитаний с пищевыми ресурсами являются известными формами поведенческих реакций C. elegans на сильное превышение физиологического оптимума температуры и голодание.
Заключение
Таким образом, в экспериментах с почвенными нематодами C. elegans показано, что причиной активации холинергической системы тепловым стрессом является сенситизация н-холинорецеп-торов, проявляющаяся в сильном увеличении чувствительности поведения к их агонистам левамизолу и никотину. Адаптивное значение активации холинергической системы C. elegans стрессовыми условиями среды может определяться ее участием в таких формах поведения, как избегание среды с высокой температурой и поиск пищи.
Список литературы
1. Калинникова Т.Б., Тимошенко А.Х., Гайнутдинов Т.М., Гиндина В.В., Гайнутдинов М.Х. Адаптация нематоды Caenorhabditis elegans к высокой температуре среды // Журн. эвол. биох. и физиол. 2006. Т. 42. С. 457-462.
2. Раушенбах И.Ю. Стресс-реакция насекомых: механизм, генетический контроль, роль в адаптации // Генетика. 1997. Т. 33. С. 1110-1118.
3. Boulin T., Gielen M., Richmond J.E., Williams D.C., Paoletti P., Bessereau J.-L. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor // PNAS. 2008. V. 105. P. 18590-18595.
4. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V. 77. P. 71-94.
5. Gilad G.M. The stress-induced response of the septo-hippocampal cholinergic system. A vectorial outcome of psychoneuroendocrinological interactions // Psychoneuroendocrinol. 1987. V. 12. P. 167-184.
6. Jospin M., Qi Y.B., Stawicki T.M., Boulin T., Schuske K.R., Horvitz R., Bessereau J.-L., Jorgensen E.M., Jin Y. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans // PLoS Biology. 2009. V. 7. P. e1000265.
7. Kalinnikova T.B., Shagidullin R.R., Kolsanova R.R., Osipova E.B., Zakharov S.V., Gainutdinov M.Kh. Acetylcholine deficiency in Caenorhabditis elegans induced by hyperthermia can be compensated by ACh-esterase inhibition or activation of GAR-3 mAChRs // Environment and Natural Resources Research. 2013. V. 3. P. 98-113.
74
российский журнал прикладной экологии
8. Mineur Y.S., Obayemi A., Wigestrand M.B., Fote G.M., Calarco C.A., Li A.M. Picciotto M.R. Cholinergic signaling in the hippocampus regulates social stress resilience and anxiety-and depression-like behavior // PNAS. 2013. V. 110. P. 35733578.
9. Mohammadi A., Rodgers J.B., Kotera I., Ryu W.S. Behavioral response of Caenorhabditis elegans to localized thermal stimuli // BMC Neuroscience. 2013. V. 14. P. 66-77.
10. Petrash H.A., Philbrook A., Haburcak M., Barbagallo B., Francis M.M. ACR-12 ionotropic acetylcholine receptor complexes regulate inhibitory motor neuron activity in Caenorhabditis elegans // J. Neurosci. 2013. V. 33. P. 5524-5532.
11. Selye H. The stress of life. NY: McGraw-Hill, 1956. 515 p.
12. Selye H. Confusion and controversy in the stress field // J. Human Stress. 1975. V. 1. P. 37-44.
13. Suo S., Kimura Y., Van Tol H.H.M. Starvation induces cAMP response element-binding protein-dependent gene expression through octopamine Gq signaling in Caenorhabditis elegans // J. Neurosci. 2006. V. 26. P. 10082-10090.
14. Tottenham N., Sheridan M.A. A review of adversity, the amygdala and the hippocampus: a consideration of developmental timing // Front. Hum. Neurosci. 2010. V. 3. Article 68.
15. Wendelaar Bonda S.E. The stress response in fish // Physiol. Rev. 1997. V. 77. P. 591-625.
T.B. Kalinnikova, E.B. Belova, R.R. Kolsanova, M.Kh. Gainutdinov. The activation of cholinergic system of soil nematode Caenorhabditis elegans by stressful environment
In experiments with soil nematodes C. elegans it is shown that 2-hours starvation and heat stress (30 minutes at 33 °C) cause activation of nematodes' cholinergic system, revealed in the increase of locomotion sensitivity to partial ACh-esterase inhibition by aldicarb. The reason of cholinergic system activation by heat stress is sensitization of nAChRs, revealed in strong increase in behavior sensitivity to nAChRs' agonists levamisole and nicotine. Adaptive value of C. elegans cholinergic system activation by stressful environmental conditions may be determined by its participation in such behaviors as avoidance of high temperature and food search.
Keywords: Caenorhabditis elegans; stress; cholinergic system; behavior.
