CC BY
25
УДК 574.2+615.917
Е.Б. Белова, Р.Р. Колсанова, Т.Б. Калинникова, М.Х. Гайнутдинов
Институт проблем экологии и недропользования АН РТ, [email protected]
синергизм в действии ингибиторов ацетилхолинэстеразы и агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина на поведение свободноживущей почвенной нематоды
CAENORHABDITIS BRIGGSAE
Показано наличие синергизма в токсическом действии ингибитора АХ-эстеразы алдикарба и агонистов никотиновых рецепторов АХ левамизола и никотина на организм почвенной нематоды C. briggsae. Явление синергизма проявляется в усилении токсического действия алдикарба низкими концентрациями никотина и левамизола на поведение C. briggsae и свидетельствует о возможной эффективности совместного использования ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов н-холинорецеп-торов для контроля над нематодами и насекомыми, являющимися вредителями сельского хозяйства.
Ключевые слова: Caenorhabditis briggsae; ацетилхолинэстераза; никотиновые рецепторы ацетил-холина.
Введение
Ацетилхолин (АХ) является одним из основных нейротрансмиттеров в организмах человека и животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, играющим ключевую роль в регуляции всех основных функций организма. Поэтому нарушение функции холинергической системы паразитических червей и насекомых является механизмом действия многих антигельминтных средств и инсектицидов, используемых в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве (Opperman, Chang, 1991; Sattelle, 2009). Токсические воздействия на холинергическую систему включают в себя ин-гибирование ацетилхолинэстеразы (АХ-эстера-зы), повышающее концентрацию АХ в синапсах (Opperman, Chang, 1991) и действие агонистов никотиновых рецепторов АХ (н-холинорецепто-ров) (Sattelle, 2009). В связи с тем, что механизм токсического действия как ингибиторов АХ-эс-теразы, так и агонистов н-холинорецепторов на организмы паразитических червей и насекомых заключается в гиперактивации н-холинорецепто-ров (Charlie et al., 2006; Sattelle, 2009; Govorunova et al., 2010), предполагается отсутствие сложных взаимодействий этих токсикантов при их совместном использовании. Вместе с тем современные представления о молекулярной и клеточной организации холинергической системы нематод предполагают возможность качественных различий токсических эффектов ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов н-холинорецепторов. Поэтому возможно, что при совместном действии агони-стов н-холинорецепторов и ингибиторов АХ-эс-теразы на организмы нематод может проявляться аддитивность или синергизм их токсических
эффектов. Целью работы явилась проверка этой гипотезы с использованием в качестве модельного организма свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis briggsae. Выбор модельного организма обусловлен наличием хорошо охарактеризованных линий нематоды и стандартных условий ее выращивания в лабораторных условиях (Fodor et al., 1983; Dolgin et al., 2008).
Материалы и методы
Эксперименты проводили с C. briggsae линии дикого типа AF16, полученной из Caenorhabditis Genetics Center, выращенными при 22°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (Brenner, 1974). Для кормления нематод использовали E.coli OP50. Для определения чувствительности поведения к ингибитору АХ-эстеразы алдикарбу и агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина (н-холинорецепторов) левами-золу и никотину нематод двухдневного возраста трижды отмывали от среды выращивания и E.coli 10 мл NG буфера (0.3% NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgS04, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 6.0)) и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера с добавлением алдикарба, левамизо-ла или никотина. Нарушения поведения, вызванные ингибированием АХ-эстеразы или действием агонистов н-холинорецепторов, регистрировали через 30 или 90 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Показателями действия алдикарба, левамизола и никотина на поведение C. briggsae являлись нарушения моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхиванием пробирки с червем). Эти нарушения проявлялись в на-
42
российский журнал прикладной экологии
рушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, временной приостановке плавания, плавании по кругу и др. и полном прекращении способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом (паралич червей). В каждом варианте эксперимента использовали 30 червей. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. В работе использовали реактивы фирмы Sigma.
Результаты и их обсуждение
Алдикарб является ингибитором АХ-эстеразы, который широко используется в качестве пестицида в сельском хозяйстве и как инструмент дхта изучения молекулярных механизмов функций холинергической системы нематод (OppermBi, Chang, 1991; Charlie et al., 2006; Govorunova et al., 2010). В этих исследованиях используется токсикологический анализ, включающий в себя выявление изменений чувствительности локомоции к токсическому действию алдикарба и агонистов н-холинорецепторов, вызванных мутациями одного из генов, регулирующих функции холинергиче-ских синапсов (Charlie et al., 2006; Boulin et al., 2008; Govorunova et al., 2010; Petrash et al., 2013).
Токсическое действие алдикарба на поведение C. briggsae проявляется в обратимых нарушениях плавания, индуцированного механическим стимулом, таких как нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, временной приостановке плавания, плавании по кругу или в полном обездвиживании червей (их «параличе»), если увеличивается концентрация алдикарба или время экспозиции нематод к нему. Нарушения поведения нематод алдикарбом обусловлены аномальным повышением концентрации АХ и зависят как от скорости секреции АХ нейронами, так и от чувствительности н-холинорецепторов к АХ (Jospin et al., 2009; Petrash et al., 2013).
В связи с тем, что мутации генов н-холино-рецепторов в моторных нейронах нематод вызывают сильные изменения секреции АХ этими нейронами и, как следствие, - изменения чувствительности поведения к алдикарбу (Jospin et al., 2009), можно было предположить, что агонисты н-холинорецепторов могут сенситизировать поведение C. briggsae к токсическому действию ал-дикарба усилением секреции АХ. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты, в которых исследовалось влияние никотина на чувствительность поведения C. briggsae к алдикарбу.
Рис. 1. Сенситизация поведения С. briggsae к действию алдикарба никотином после 30-минутной
экспозиции нематод к токсикантам.
Вкаждомвариантеиспользовано 30 нематод.
Как показано на рис. 1-2, никотин в концентрациях, являющихся подпороговыми для полного обездвиживания С. briggsae, вызывает сильное увеличение чувствительности организма С. briggsae к токсическому действию алдикарба. Сенситизация поведения С. briggsae к действию алдикарба никотином выявляется как в условиях обратимого нарушения алдикарбом плгвэдаота, ин-дуцщювшиного механггаеским стик^лом (рис. г ), так к в уллоао-ях полновл оакхдвиживания нематод алдикарбом (рис. 3).
Рис. 2. Влияние никотина на обездвиживание
С. Ьг^С^ё^ьае,иадуинроцанноеси^^иа^1рбка^
90-минутнойэкспозициинематод^ктоксикантам.
В каждом вариантеиспользовано 30 нематод.
Известно наличие в организмах нематод двух подтипов н-холинорецепторов, таких как L-под-тип, чувствительный к левамизолу, и П-подтип, нечувствительный к левамизолу, но чувствительный к никотину ^айеИе, 2009). Поэтому нами были проведены эксперименты, в которых оценивалось влияние левамизола на чувствительность поведения С. briggsae к алдикарбу. Как показано на рис. 3-4, левамизол оказывает сходное с нико-
2/2015
43
тином действие на нарушения поведения, индуцированные алдикарбом. Во-первых, концентрации левамизола, подпороговые для индукции паралича нематод в среде без алдикарба, усиливают паралич C. briggsae, вызванный введением алдикарба в среду (рис. 3). Во-вторых, в условиях кратковременной (30 минут) экспозиции C. briggsae к токсикантам, которлк не приводиткпараличу,но вызывает ларушение моторной программы плавания нематод, также наблюдается сенситизация поведения к токсическому действию алдикарба лведенаам в ореду левамизола (рис. 4).
паралич нематод, также может быть следствием стимуляции секреции АХ моторными нейронами.
Рис. 3. Влияние левамизола на обездвиживание C. briggsae,индуцированноеалдикарбом после 90-минутнойэкспозиции нематод к токсикантам. В каждом варианте использовано 30 нематод.
Уровень аномального повышения концентрации АХ определяется не только концентрацией алдикарба, но и скоростью секреции АХ холинер-гическими моторными нейронами (Jospin et al., 2009). Поэтому наиболее вероятным объяснением сенситизации C. briggsae никотином и левами-золом к параличу, индуцированному алдикарбом, является увеличение скорости секреции АХ хо-линергическими нейронами. Это объяснение находится в соответствии с результатами исследований механизмов функций холинергических моторных нейронов у нематод близкородственного C. briggsae вида C. elegans, полученных методами молекулярной генетики (Jospin et al., 2009). Эти исследования показали наличие у моторных нейронов нейронального подтипа н-холинорецепто-ров, активация которого сверхэкспрессией генов субъединиц этого рецептора приводит к стимуляции секреции АХ и, как следствие, к ускорению паралича нематод, индуцированного алдикарбом (Jospin et al., 2009). Соответственно, сенситиза-ция C. briggsae никотином и левамизолом к токсическому действию алдикарба, вызывающему
100 90 SO 70 60 50 40 30 20 10 о
□ Без левамизола ■ С левамизолом (30 нкноль)
fill
0 16 32
Концентрация алдикарба, мкмоль
Рис. 4. Сенситизация поведения C. briggsae к действию алдикарба левамизолом после 30-минутной экспозиции нематод к токсикантам. Вкаждом вариантеиспользовано30нематод.
Никотин и левамизол оказывают сильное влияние не только на паралич нематод, происходящий после длительной (90 минут) экспозиции червей к алдикарбу (рис. 2-3), но и на нарушения моторной программы плавания, которые происходят в отсутствие полного обездвиживания нематод при кратковременной (30 минут) экспозиции к алдикарбу или при концентрации алдикарба, подпороговой для паралича нематод (рис. 1, 4). Нарушения моторной программы плавания, индуцированные ал-дикарбом, не могут быть следствием гиперсокращения мышц, так как они наблюдаются при концентрации алдикарба, подпороговой для паралича нематод. Следовательно, повышение уровня АХ, индуцированное частичным ингибированием АХ-эстеразы и подпороговое для гиперсокращения мышц, вызывает нарушения функций системы нейронов, регулирующих локомоцию C. briggsae. Подтверждением этого вывода являются результаты других исследований, в которых показано, что проявления нарушения моторной программы плавания, такие как нарушения координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временная приостановка плавания, плавание по кругу и др., при действии высокой температуры на нервную систему C. elegans и C. briggsae те же, что и при действии алдикарба (Калинникова и др., 2011; Kalinnikova et al., 2012; Kalinnikova et al, 2013). В связи с тем, что гиперактивация н-холинорецепторов является механизмом всех известных проявлений токсического действия на организмы нематод не только агонистов этих рецепторов, но и аномального повышения уровня АХ алдикарбом, очевидно, что и нарушения функций системы нейронов, регулирующей локомо-
ж
44
российский журнал прикладной окон
цию, алдикарбом, левамизолом и никотином обусловлены гиперактивацией н-холинорецепторов в нейронах. В связи с тем, что экспрессия генов субъединиц н-холинорецепторов происходит во многих нейронах нематод рода Caenorhabditis (Jones, Sattelle, 2004), нейротоксическое действие алдикарба, левамизола и никотина, выявляющееся в обратимых нарушениях поведения (рис. 1, 4), может происходить на следующих двух уровнях организации нервной системы C. briggsae.
1. Нарушения моторной программы плавания могут происходить вследствие гиперактивации н-холинорецепторов в холинергических и ГАМК-ергических моторных нейронах C. briggsae, так как система этих нейронов с холинергическими синапсами не только между холинергическими моторными нейронами и мышцами, но и между холинергическими и ГАМК-ергическими моторными нейронами регулирует не только процессы сокращения и расслабления, но и координацию этих процессов, необходимую для синусоидальных движений тела при плавании (Jospin et al., 2009; Petrash et al., 2013).
2. Экспрессия генов н-холинорецепторов у нематод происходит не только в моторных, но и во многих других нейронах (Jones, Sattelle, 2004). Соответственно нарушения моторной программы плавания могут быть следствием гиперактивации н-холинорецепторов в интернейронах.
Известно, что н-холинорецепторы в холинергических моторных нейронах, активация которых приводит к стимуляции секреции ими АХ, являются внесинаптическими ауторецепторами (Jospin et al., 2009), функцией которых является саморегуляция секреции АХ моторными нейронами (Jospin et al., 2009). Возможно наличие этих н-холинорецепторов и в холинергических интернейронах нематод, и в этом случае никотин и ле-вамизол могут ускорять секрецию АХ не только моторными, но и интернейронами C. briggsae и, как следствие, - усиливать токсическое действие алдикарба на нервную систему.
Заключение
Таким образом, обнаруженное в работе явление синергизма, проявляющееся в усилении токсического действия алдикарба низкими концентрациями никотина и левамизола на поведение свободноживущих почвенных нематод C. briggsae, может иметь важное значение для разработки оптимальной стратегии использования антигельминтных средств и инсектицидов, мишенью действия которых является холинерги-ческая система. Существующая стратегия заклю-
чается в раздельном использовании ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов н-холинорецепторов, так как в обоих случаях токсический эффект обусловлен гиперактивацией н-холинорецепторов в организмах паразитических червей и насекомых.
Если сенситизация н-холинорецепторов к токсическому действию ингибиторов АХ-эстеразы низкими концентрациями агонистов н-холино-рецепторов происходит не только в организме C. briggsae, но и в организмах паразитических нематод, то совместное применение ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов н-холинорецепторов для борьбы с паразитическими нематодами и насекомыми, являющимися вредителями сельского хозяйства, может не только повысить эффективность применения пестицидов, мишенью действия которых является холинергическая система, но и снизить риски токсического действия ингибиторов АХ-эстеразы, используемых в сельском хозяйстве, на организм человека и экосистемы из-за снижения концентраций этих ингибиторов.
Список литературы
1. Калинникова Т.Б., Тимошенко А.Х., Тарасов О.Ю., Гай-нутдинов Т.М., Гайнутдинов М.Х. Термотолерантность организмов почвенных нематод Caenorhabditis briggsae линии AF16 и Caenorhabditis elegans линии N2 в эксперименте // Экология. 2011. № 5. С. 398-400.
2. Boulin T., Gielen M., Richmond J.E., Williams D.C., Paoletti P., Bessereau J.-L. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor // PNAS. 2008. V. 105. P. 18590-18595.
3. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V. 77. P. 71-94.
4. Charlie N.K., Schade M.A., Thomure A.M., Miller K.G. Presynaptic UNC-31 (CAPS) is required to activate the G alpha(s) pathway of the Caenorhabditis elegans synaptic signaling network // Genetics. 2006. V. 172. P. 943-961.
5. Dolgin E.S., Félix M.-A., Cutter A.D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae // Heredity. 2008. V. 100. P. 304-315.
6. Fodor A., Riddle D.L., Nelson F.K., Golde J.W. Comparison of a new wild-type Caenorhabditis briggsae with laboratory strains of C. briggsae and C. elegans // Nematologica. 1983. V. 29. P. 203-217.
7. Govorunova E.G., Moussaif M., Kullyev A., Nguyen K.C.G., McDonald T. V., Hall D.H., Sze J.Y. A homolog of FHM2 is involved in modulation of excitatory neurotransmission by serotonin in C. elegans // PLoS ONE. 2010. V. 5. e10368.
8. Jones A.K., Sattelle D.B. Functional genomics of the nicotinic acetylcholine receptor gene family of the nematode, Caenorhabditis elegans // Bioessays. 2004. V. 26. P. 39-49.
9. Jospin M., Qi Y.B., Stawicki T.M., Boulin T., Schuske K.R., Horvitz R., Bessereau J.-L., Jorgensen E.M., Jin Y. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans // PLoS Biology. 2009. V. 7. P. e1000265.
10. Kalinnikova T.B., Kolsanova R.R., Gainutdinov M.Kh. Caenorhabditis elegans as a convenient model organism for understanding heat stress effects upon intact nervous system // In: Heat Stress: Causes, Treatment and Prevention / Eds. Stanislas Josipovich and Elias Ludwig. NY: Nova Science Publishers, 2012. P. 113-140.
2/2015
45
11. Kalinnikova T.B., Shagidullin R.R., Kolsanova R.R., Osipova E.B., Zakharov S.V., Gainutdinov M.Kh. Acetylcholine deficiency in Caenorhabditis elegans induced by hyperthermia can be compensated by ACh-esterase inhibition or activation of GAR-3 mAChRs // Environment and Natural Resources Research. 2013. V. 3. P. 98-113.
12. Opperman C.H., Chang S. Effects of aldicarb and fenamiphos on acetylcholinesterase and motility of Caenorhabditis elegans // J. Nematology. 1991. V. 23. P. 20-27.
13. Petrash H.A., Philbrook A., Haburcak M., Barbagallo B., Francis M.M. ACR-12 ionotropic acetylcholine receptor complexes regulate inhibitory motor neuron activity in Caenorhabditis elegans // J. Neurosci. 2013. V. 33. P. 5524-5532.
14. Sattelle D.B. Invertebrates nicotinic acetylcholine receptors - targets for chemicals and drugs important in agriculture, veterinary medicine and human health // J. Pesti. Sci. 2009. V. 34. P. 233-240.
The existence of synergism in toxic action of ACh-esterase inhibitor aldicarb and agonists of nAChRs levamisole and nicotine on organism of soil nematode C. briggsae is shown. This synergism reveals in enhancement of aldicarb toxic action on C. briggsae behavior by low concentrations of nicotine and levamisole and indicates the possible efficiency of joint use of ACh-esterase inhibitors and agonists of nAChRs for pest control of nematodes and insects in agriculture.
Keywords: Caenorhabditis briggsae; acetylcholine esterase; nicotinic acetylcholine receptors
E.B. Belova, R.R. Kolsanova, T.B. Kalinnikova, M.Kh. Gainutdinov. Synergism in action of acetylcholine esterase inhibitors and agonists of nicotinic acetylcholine receptors on the free-living soil nematode Caenorhabditis briggsae behavior
46
российский журнал прикладной экологии
