CC BY
31
ВЛИЯНИЕ АГОНИСТОВ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОРГАНИЗМА ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ Caenorhabditis briggsae К ИНГИБИТОРУ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ АЛДИКАРБУ
© Калинникова Т.Б.* *, Белова Е.Б.*,
Колсанова Р.Р.*, Гайнутдинов М.Х.*
Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, г. Казань
Показано, что низкие, подпороговые для токсического действия, концентрации агонистов н-холинорецепторов левамизола и никотина вызывают значительное усиление токсического действия ингибитора АХ-эстеразы алдикарба на организма почвенной нематоды C.briggsae. Это предполагает возможную эффективность совместного использования агонистов н-холинорецепторов и ингибиторов АХ-эстеразы для контроля над численностью нематод и насекомых-вредителей сельского хозяйства.
Ключевые слова Caenorhabditis briggsae, ацетилхолинэстераза, никотиновые рецепторы ацетилхолина.
Ацетилхолин (АХ) является одним из основных нейротрансмиттеров в организмах человека и животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, играющим ключевую роль в регуляции всех основных функций организма. Поэтому нарушение функции холинергической системы паразитических червей и насекомых является механизмом действия многих антигельминтных средств и инсектицидов, используемых в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве [1-2]. Токсические воздействия на холинергическую систему включают в себя ингибирование ацетилхолинэстеразы (АХ-эстеразы), повышающее концентрацию АХ в синапсах [1] и действие агонистов никотиновых рецепторов АХ (н-холинорецепторов) [2]. Современные представления о молекулярной и клеточной организации холинергической системы нематод предполагают возможность качественных различий токсических эффектов ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов н-холинорецепторов. Поэтому возможно, что при совместном действии агонистов н-холинорецепто-
* Старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии, кандидат биологических наук.
* Младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии, кандидат биологических наук.
* Научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии.
* Заведующий лабораторией экспериментальной экологии, доктор биологических наук, профессор.
Биологические науки
25
ров и ингибиторов АХ-эстеразы на организмы нематод может проявляться аддитивность или синергизм их токсических эффектов. Целью этой работы явилась проверка этой гипотезы с использованием в качестве модельного организма свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis briggsae из-за наличия хорошо охарактеризованных линий этой нематоды и стандартных условий ее выращивания в лаборатории [3-4].
Эксперименты проводили с C.briggsae линии дикого типа AF16, выращенными при 22 °C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод [5]. Для кормления нематод использовали E.coli OP50. Для определения чувствительности поведения к ингибитору ацетилхолинэстеразы (АХ-эстеразы) алдикарбу и агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина (н-холинорецепторов) левамизолу и никотину нематод инкубировали индивидуально в пробирках с 1 мл NG буфера(0,3 % NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO4, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 6,0)) с добавлением алдикарба, левами-зола или никотина. Нарушения поведения, вызванные ингибированием АХ-эстеразы или действием агонистов н-холинорецепторов, регистрировали через 30 или 90 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Показателями действия алдикарба, левамизола и никотина на поведение C.briggsae являлись нарушения моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом (встряхиванием пробирки с червем). Эти нарушения проявлялись в нарушениях координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела, временной приостановке плавания, плавании по кругу и др. и полном прекращении способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом (паралич червей). В каждом варианте эксперимента использовано 30 червей.
Таблица 1
Влияние никотина и левамизола на чувствительность Caenorhabditis briggsae к действию алдикарба
Условия эксперимента Алдикарб, pM
0 8 16 32
Без добавок 0 6±1 12±2 55±3
+ 1 mM никотина 7±1 48±2 63±3 83±4
+ 30 pM левамизола 0 53±2 72±4 95±3
В таблице приведена доля нематод (в %) с нарушениями моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом, после 30-минутной экспозиции к алдикарбу, к алдикарбу и никотину или алдикарбу и левамизолу. В каждом варианте 30 нематод.
Алдикарб является ингибитором АХ-эстеразы, который широко используется в качестве пестицида в сельском хозяйстве. Токсическое действие алдикарба на поведение C.briggsae проявляется в обратимых нарушениях плавания, индуцированного механическим стимулом, таких как нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, временной приостановке плавания, плавании по
26
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
кругу или в полном обездвиживании червей (их «параличе»), если увеличивается концентрация алдикарба или время экспозиции нематод к алдикарбу. Нарушения поведения нематод алдикарбом обусловлены аномальным повышением концентрации АХ, которое вызывает гиперактивацию н-холино-рецепторов в нейронах и локомоторных мышцах, и проявляет сильную зависимость от скорости секреции АХ нейронами и от чувствительности н-холинорецепторов к АХ [6-7].
Как показано в табл. 1, никотин в концентрациях, являющихся подпороговыми для полного обездвиживания C.briggsae, вызывает сильное увеличение чувствительности организма C.briggsae к токсическому действию алдикарба. Сенситизация поведения C.briggsae к действию алдикарба никотином выявляется как в условиях обратимого нарушения алдикарбом плавания, индуцированного механическим стимулом (табл. 1), так и в условиях полного обездвиживания нематод алдикарбом (табл. 2).
Таблица 2
Влияние никотина и левамизола на паралич Caenorhabditis briggsae, индуцированный алдикарбом
Условия эксперимента Алдикарб, рМ
0 16 32 64
Без добавок 0 0 0 31±2
+ 1 mM никотина 0 51±3 75±3 81±4
+ 30 рМ левамизола 0 43±2 85±3 93±4
В таблице приведена доля нематод (в %) с полной потерей способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом, после 90-минутной экспозиции к алдикарбу, к алдикарбу и никотину или алдикарбу и левамизо-лу. В каждом варианте 30 нематод.
Известно наличие в организмах нематод двух подтипов н-холинорецеп-торов, таких как L-подтип, чувствительный к левамизолу, и N-подтип, нечувствительный к левамизолу, но чувствительный к никотину [2]. Поэтому нами были проведены эксперименты, в которых оценивалось влияние левамизола на чувствительность поведения C.briggsae к алдикарбу. Как показано в табл. 2, левамизол оказывает сходное с никотином действие на нарушения поведения, индуцированные алдикарбом. Во-первых, концентрации левамизола, подпороговые для индукции паралича нематод в среде без алдикарба, усиливают паралич C.briggsae, вызванный введением алдикарба в среду (табл. 2). Во-вторых, в условиях кратковременной (30 минут) экспозиции C.briggsae к токсикантам, которая не приводит к параличу, но вызывает нарушение моторной программы плавания нематод, также наблюдается сенситизация поведения к токсическому действию алдикарба введением в среду левамизола (табл. 1).
Уровень аномального повышения концентрации АХ определяется не только концентрацией алдикарба, но и скоростью секреции АХ холинергическими моторными нейронами [6]. Поэтому наиболее вероятным объяснением сенситизации C.briggsae никотином и левамизолом к параличу, инду-
Биологические науки
27
цированному алдикарбом, является увеличение скорости секреции АХ холинергическими нейронами. Это объяснение находится в соответствии с результатами исследований механизмов функций холинергических моторных нейронов у нематод близкородственного C.briggsae вида C.elegans, полученных методами молекулярной генетики [6]. Эти исследования показали наличие у моторных нейронов нейронального подтипа н-холинорецепторов, активация которого сверхэкспрессией генов субъединиц этого рецептора приводит к стимуляции секреции АХ и, как следствие, к ускорению паралича нематод, индуцированного алдикарбом [6]. Соответственно, сенситиза-ция C.briggsae никотином и левамизолом к токсическому действию алди-карба, вызывающему паралич нематод, также может быть следствием стимуляции секреции АХ моторными нейронами.
Известно, что н-холинорецепторы в холинергических моторных нейронах, активация которых приводит к стимуляции секреции ими АХ, являются внесинаптическими ауторецепторами [6], функцией которых является саморегуляция секреции АХ моторными нейронами [6]. Возможно наличие этих н-холинорецепторов и в холинергических интернейронах нематод, и в этом случае никотин и левамизол могут ускорять секрецию АХ не только моторными, но и интернейронами C.briggsae и, как следствие, усиливать токсическое действие алдикарба на нервную систему.
Свободноживущие почвенные нематоды рода Caenorhabditis являются удобной моделью для изучения механизмов токсического действия антигельминтных средств из-за большого сходства их организмов и организмов паразитических нематод. Поэтому обнаруженная в этой работе сенситиза-ция организма C.briggsae к токсическому действию ингибитора АХ-эстера-зы алдикарба низкими, нетоксичными для организма концентрациями агонистов н-холинорецепторов может иметь важное значение для разработки оптимальной стратегии использования антигельминтных средств и инсектицидов, мишенью действия которых является холинергическая система. Существующая стратегия заключается в раздельном использовании ингибиторов АХ-эстеразы и агонистов н-холинорецепторов, так как в обоих случаях токсический эффект обусловлен гиперактивацией н-холинорецепторов в организмах паразитических червей и насекомых.
Если сенситизация н-холинорецепторов к токсическому действию ингибиторов АХ-эстеразы низкими концентрациями агонистов н-холиноре-цепторов происходит не только в организме C.briggsae, но и в организмах паразитических нематод, то совместное применение ингибиторов АХ-эсте-разы и агонистов н-холинорецепторов для борьбы с паразитическими нематодами и насекомыми может не только повысить эффективность применения пестицидов, мишенью действия которых является холинергическая система, но и снизить риски токсического действия ингибиторов АХ-эстеразы, используемых в сельском хозяйстве, на организмы человека и экосистемы из-за снижения концентраций этих ингибиторов.
28
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Список литературы:
1. Opperman C.H., Chang S. Effects of aldicarb and fenamiphos on acetylcholinesterase and motility of Caenorhabditis elegans // J. Nematology. 1991. V 23. P. 20-27.
2. Sattelle D.B. Invertebrates nicotinic acetylcholine receptors - targets for chemicals and drugs important in agriculture, veterinary medicine and human health // J. Pesti. Sci. 2009. V 34. P. 233-240.
3. Fodor A., Riddle D.L., Nelson F.K., Golde J.W. Comparison of a new wild-type Caenorhabditis briggsae with laboratory strains of C.briggsae and C.elegans // Nematologica. 1983. V 29. P. 203-217.
4. Dolgin E.S., Felix M.-A., Cutter A.D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C.briggsae // Heredity. 2008. V 100. P. 304-315.
5. Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans // Genetics. 1974. V 77. P. 71-94.
6. Jospin M., Qi Y.B., Stawicki T.M., Boulin T., Schuske K.R., Horvitz R., Bessereau J.-L., Jorgensen E.M., Jin Y A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans // PLoS Biology. 2009. V 7. P. e1000265.
7. Petrash H.A., Philbrook A., Haburcak M., Barbagallo B., Francis M.M. ACR-12 ionotropic acetylcholine receptor complexes regulate inhibitory motor neuron activity in Caenorhabditis elegans // J. Neurosci. 2013. V 33. P. 5524-5532.
О РОЛИ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА ПОЧВЕННОЙ НЕМАТОДЫ Caenorhabditis elegans К СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ
© Калинникова Т.Б.* *, Белова Е.Б.*,
Колсанова Р.Р.*, Гайнутдинов М.Х.*
Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, г. Казань
В экспериментах с почвенными нематодами C.elegans показано, что двухчасовое голодание и тепловой стресс (30 минут при 33 °C) вызы-
* Старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии, кандидат биологических наук.
* Младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии, кандидат биологических наук.
* Научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии.
* Заведующий лабораторией экспериментальной экологии, доктор биологических наук, профессор.
