CC BY
15СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ
УДК 615.284
ПОЧВЕННАЯ НЕМАТОДА CAENORHABDITIS BRIGGSAE -УДОБНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ НЕМАТОЦИДОВ-АГОНИСТОВ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА
Калинникова Татьяна Борисовна, кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник1, Яхина Айгуль Фанузовна, младший научный сотрудник1, магистрант2, Егорова Анастасия Васильевна, младший научный сотрудник1, магистрант2, Хакимова Диляра Махмутриевна, кандидат медицинских наук, старший преподаватель2, Белова Евгения Борисовна, младший научный сотрудник1, Гайнутдинов Марат Хамитович, доктор биологических наук, профессор1, 1 Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, 2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Казань, РФ
Аннотация: Сравнительное исследование токсического действия агонистов н-холинорецепто-ров на организмы почвенньк нематод C. briggsae и C. elegans показало, что у C. briggsae значительно выше чувствительность организма как к левамизолу так и к никотину. Эти различия усиливаются действием агониста м-холинорецепторов пилокарпина. Результаты работы показали, что C. briggsae является перспективным модельным организмом для изучения действия нематоцидов-агонистов н-холинорецепторов.
Ключевые слова: Caenorhabditis elegans; Caenorhabditis briggsae; агонисты никотиновых;: и му-скариновых рецепторов ацетилхолина; токсичность.
SOIL NEMATODE CAENORHABDITIS BRIGGSAE - THE CONVENIENT MODEL FOR STUDYING THE ACTION OF NEMATOCIDES-AGONISTS OF NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTORS
Kalinnikova Tatiana Borisovna, PhD (Cand. Bio. Sci.), senior researcher1, Yakhina Aigul Fanuzovna, junior researcher1, the undegraduate2, Egorova Anastasia Vasilevna, junior researcher1, the undegraduate2, Belova Evgenia Borisovna, junior researcher1, Khakimova Dilyara Makhmutrievna, PhD (Cand. Med. Sci.), senior lecture2, Gainutdinov Marat Khamitovich, PhD (Doct. Bio. Sci.), professor1, 1 Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of
Sciences,
2Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
Summary: The comparative research of toxic action of agonists of nAChRs on organisms of soil nematodes C. briggsae and C. elegans revealed that organism of C. briggsae is much more sensitive either to levamisole or nicotine. These differences were enhanced by the action of mAChRs agonist pilocarpine. Results of this work have shown that C. briggsae is a promising model organism for studying the action of nematocides-agonists of nAChRs.
Keywords: Caenorhabditis elegans; Caenorhabditis briggsae; agonists of nicotinic and muscarinic receptors of acetylcholine; toxicity.
Холинергическая система была приобретена организмами многоклеточных животных на ранних стадиях их эволюции. Поэтому она принимает участие в регуляции всех основных функций не только человека, позвоночных и высших беспозвоночных, но и круглых червей. Молекулярные и клеточные механизмы холинер-гической системы высококонсервативны в эволюции [1, 2]. Поэтому, в связи с чрезвычайной сложностью организации холинер-гической системы грызунов, для изучения механизмов функций холинергической системы в норме и при патологии в качестве удобной модели широко используется простая нервная система свободноживу-щей почвенной нематоды Cаenorhаbditis elegans, состоящая всего из 302 нейронов, половина из которых являются холинер-гическими [2-4]. Из-за слабых различий организмов паразитических и свободно-живущих нематод С. е^аш используется и как модель для изучения токсического действия нематоцидов-агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина (АХ) (н-холинорецепторов) [2]. В то же время нами ранее было показано, что между организмами почвенных нематод одного рода, такими как С. elegans и С. briggsae, в ходе эволюции появились различия как в устойчивости к действию экстремально высокой температуры, так и к действию левамизола - агониста н-холинорецепто-ров, который широко используется как нематоцид в медицине и ветеринарии [3, 5]. Поэтому целью работы явилось сравнительное исследование холинергических
систем С. elegans и С. briggsae с использованием фармакологического анализа их поведения.
Методика исследования
С. elegans линии дикого типа N2 и С. briggsae линии дикого типа AF16 выращивали при 22 °С в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод [3]. Эксперименты проводили в NG буфере (0,3 % ШС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgSO4 и 25 мМ калийфосфатного буфера (рН = 7,0)). Молодых половозрелых червей переносили индивидуально в стеклянные стаканчики, содержащие 1 мл NG буфера (рН = 7,0). Нарушения плавания червей, индуцированного механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем), вызванные действием левамизола или никотина, наблюдали через 15 и 90 минут экспозиции к левамизолу или никотину при температуре 22 °С. Эти нарушения проявлялись в ошибках моторной программы плавания (нарушения координации мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании и прерывистое плавание, проявляющееся в течение 10 секунд после стимула) через 15 минут экспозиции к левамизолу и в полном обездвиживании нематод через 90 минут экспозиции к ле-вамизолу.
Высокие концентрации лекарственных средств, использованные в работе (10-3 М и более), объясняются чрезвычайно низкой проницаемостью кутикулы нематод для лекарственных средств и токсикантов [6-9].
Эксперименты проводили с февраля по
апрель. В каждом варианте эксперимента, проведенном в трех повторностях, использовано 30 червей. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера.
Результаты и обсуждение
Локомоция нематод регулируется системой нейронов, включающей в себя холинергические командные нейроны, холинергические моторные нейроны и ГАМК-ергические моторные нейроны [4, 7, 10]. Холинергические моторные нейроны имеют синаптические контакты не только с мышцами тела, но и с ГАМК-ер-гическими нейронами [4, 7, 10].
Для оценки различий функций холинер-гических систем С. elegans и С. briggsae был использован фармакологический анализ локомоции нематод, который ранее был разработан в исследованиях механизмов функций холинергической системы С. elegans. В наших экспериментах он включал в себя анализ чувствительности плавания нематод, индуцированного механическим стимулом, к действию агонистов н-холинорецепторов левамизола и никотина. Гиперактивация н-холинорецепторов нематод их агонистами левамизолом и никотином вызывает два типа нарушения поведения С. elegans и С. briggsae. Относительно низкие концентрации агонистов
% 100
80 ■
контроль 60 ■
■ +0,5мМ 40 ■
пилокарпина
■ +1.0мМ 20 ■
пилокарпина 0 ^
н-холинорецепторов в условиях кратковременной (15...30 мин) экспозиции нематод к этим токсикантам вызывает нарушения моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом. При этом все нематоды сохраняют способность к плаванию. Увеличение времени экспозиции нематод к левамизолу или увеличение его концентрации вызывает полную потерю нематодами способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом, для которой обычно используется такой термин как «паралич» нематод [10].
В соответствии с результатами нашей предыдущей работы, чувствительность поведения к действию левамизола у С. briggsae значительно выше, чем у С. elegans, так как концентрации лева-мизола, эффективные для нарушения моторной программы плавания в условиях 15-минутной экспозиции и для индукции паралича нематод в условиях 90-минутной инкубации в среде с левамизолом, у С. briggsae значительно ниже, чем у С. elegans (рис. 1, 2) [3]. Результаты этих экспериментов показывают, что чувствительность н-холинорецепторов в мышцах и нейронах у С. briggsae значительно выше, чем у С. elegans. В то же время известно существование у нематод рода СавпвгкаЬ&И^ъ двух подтипов н-холиноре-
Б
С.Ьп^зае
**+
к,
контроль
I +0,5 иМ пнлокарпнна
1+1,ОыМ пилокарпина
16 32 64
Левам!иол, мкМ
8 16 32
Левам! пол, мкМ
Рис. 1. Влияние пилокарпина на чувствительность поведения С. eIegans и С. briggsae к левамизолу: по оси ординат - доля нематод (в %) без нарушений моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом, после 15-минутной экспозиции к левамизолу. *** - достоверность разницы между контролем (среда без пилокарпина) и опытом
(среда с пилокарпином); * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
Рис. 2. Влияние пилокарпина на токсическое действие левамизола на организмы
С. в^ат и С. briggsae: по оси ординат - доля нематод (в %), потерявших способность к плаванию, индуцированному механическим стимулом, после 90-минутной экспозиции к ле-вамизолу. *** - достоверность разницы между контролем (среда без пилокарпина) и опытом
(среда с пилокарпином); *** - р < 0,001.
цепторов, таких как рецепторы L-подтипа, чувствительные к действию левамизола, и К-подтипа, нечувствительные к левамизо-лу, но чувствительные к действию никотина [11]. Поэтому нами были проведены эксперименты, в которых сравнивалась чувствительность поведения у С. briggsae и С. elegans к действию никотина.
Как показано на рис. 3, 4, чувствительность поведения к действию никотина у С. briggsae значительно выше, чем у С. elegans. Различия в чувствительности к никотину между С. briggsae и С. elegans выявляются как при 15-минутной экспозиции к никотину, вызывающей нарушения моторной программы плавания нематод, так и при 90-минутной экспозиции к никотину, после которой у С. elegans никотин в диапазоне концентраций 2...5 мМ не вызывает паралич, а у С. briggsae обездвиживание нематод наблюдается при концентрации никотина 5 мМ. Результаты этих экспериментов показывают, что у С. briggsae, по сравнению с С. elegans, повышена чувствительность н-холиноре-цепторов как L-подтипа, так и К-подтипа.
В экспериментах с С. elegans ранее было показано, что агонист м-холиноре-цепторов ареколин вызывает увеличение чувствительности нематод к действию аго-
нистов н-холинорецепторов левамизола и никотина [12]. Следовательно, чувствительность н-холинорецепторов нематод модулируется активностью м-холиноре-цепторов [12]. Поэтому одной из возможных причин различий чувствительности н-холинорецепторов у организмов С. elegans и С. briggsae являются различия в модуляции чувствительности н-холиноре-цепторов активацией м-холинорецепторов эндогенным АХ. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты, в которых исследовалось влияние аго-ниста м-холинорецепторов пилокарпина на чувствительность поведения С. elegans и С. briggsae к действию левамизола и никотина. Пилокарпин известен как агонист м-холинорецепторов организмов человека и грызунов и поэтому широко используется в фармакологии. В то же время известно, что фармакологическая чувствительность м-холинорецепторов в организмах человека и нематод сильно различается. Поэтому информация о влиянии пилокарпина на организмы нематод в научной литературе отсутствует. В наших экспериментах 15-минутная экспозиция С. elegans и С. briggsae к пилокарпину в диапазоне концентраций 10-4.10-3 М не вызывала изменений поведения нематод. В то же время
Рис. 3. Влияние пилокарпина на чувствительность поведения С. в^ат и С. briggsae к никотину: по оси ординат - доля нематод (в %) без нарушений моторной программы плавания, индуцированного механическим стимулом, после 15-минутной экспозиции к никотину. *** - достоверность разницы между контролем (среда без пилокарпина) и опытом (среда с
пилокарпином); ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
Никотин,мМ Никотин,мМ
Рис. 4. Влияние пилокарпина на токсическое действие никотина на организмы
С. в^а^ и С. briggsae: по оси ординат - доля нематод (в %), потерявших способность к плаванию, индуцированному механическим стимулом, после 90-минутной экспозиции к никотину. *** - достоверность разницы между контролем (среда без пилокарпина) и опытом (среда
с пилокарпином); ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
в этом диапазоне концентрации пилокарпин усиливал деИствие левамизола, нарушающего моторную программу плавания C. elegans и C. briggsae, индуцированного механическим стимулом, в условиях 15-минутной экспозиции нематод к лева-мизолу или к левамизолу и этому агонисту м-холинорецепторов (рис. 1). Как показано на рис. 1, сенситизация поведения нематод к действию левамизола введением в среду пилокарпина сильнее проявляется в экспериментах с C. briggsae, чем в экспериментах с C. elegans.
Пилокарпин вызывал сенситизацию
поведения нематод к действию не только левамизола, но и никотина (рис. 3, 4). В экспериментах с C. elegans эта сенсити-зация не выявлялась, но в экспериментах с C. briggsae пилокарпин в концентрациях 0,5...1,0 мМ усиливал деИствие никотина, проявляющееся в нарушениях моторной программы плавания в условиях 15-минутной экспозиции к никотину и в параличе нематод, вызванном длительной (90 мин) экспозицией к никотину (рис. 3, 4). Вследствие различий в чувствительности поведения C. elegans и C. briggsae к пилокарпину, выявляющихся в услови-
ях гиперактивации н-холинорецепторов левамизолом и никотином, в среде с пилокарпином различия чувствительности поведения С. elegans и С. briggsae к лева-мизолу и особенно к никотину значительно сильнее, чем в отсутствие пилокарпина.
Ранее было показано, что другой аго-нист м-холинорецепторов - ареколин вызывает сенситизацию поведения С. е^аш как к левамизолу, так и к никотину [12]. Эта сенситизация показывает, что активация м-холинорецепторов ареколином вызывает модуляцию чувствительности н-холинорецепторов как L-подтипа, так и К-подтипа. В то же время пилокарпин в экспериментах с С. elegans вызывает сенситизацию поведения только к левами-золу (рис. 1, 2), но не к никотину (рис. 3, 4). Следовательно, существуют различия в действии ареколина и пилокарпина на холинергическую систему нематод, которые могут быть объяснены наличием у С. elegans трех подтипов м-холинорецеп-торов, GAR-1, GAR-2 и GAR-3, которые могут модулировать чувствительность н-холинорецепторов L-подтипа и 14-подти-па, и чувствительность подтипов м-холи-норецепторов к ареколину и пилокарпину различна [7]. В то же время у С. briggsae, в отличие от С. elegans, пилокарпин сен-ситизирует поведение к никотину. Эти
результаты показывают наличие межвидовых различий в модуляции н-холиноре-цепторов нематод рода CaвnorhaЬditis активностью м-холинорецепторов.
В связи с тем, что эффективность модуляции чувствительности н-холиноре-цепторов активацией м-холинорецепто-ров пилокарпином значительно выше у С. briggsae, чем у С. elegans, возможно, что различия чувствительности н-холи-норецепторов, выявляющиеся в среде без пилокарпина (рис. 3, 4), являются следствием различий модуляции н-холиноре-цепторов эндогенным АХ. Для выяснения этого вопроса необходимы дополнительные исследования.
В целом результаты работы позволяют сделать следующие выводы:
1. Показано, что модуляция чувствительности н-холинорецепторов активацией м-холинорецепторов происходит в организмах двух видов нематод рода CaвnorhaЬditis при наличии больших межвидовых различий этой модуляции.
2. Результаты работы показывают, что С. briggsae является более перспективным, по сравнению с С. elegans, модельным организмом для исследования нематоцидов, мишенью токсического действия которых является холинергическая система.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Albuquerque E. X., Pereira E. F., Alkondon M., Rogers S. W. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function // Physiol. Rev. - 2009. - V. 89. - P. 73-120.
2. Satelle D. B. Invertebrate nicotinic acetylcholine receptors - targets for chemicals and drugs important in agriculture, veterinary medicine and human health // J. Pestic. Sci. - 2009. - V. 34. - P. 233-240.
3. Kalinnikova T. B., Kolsanova R. R., Belova E. B., Shagidullin R. R., Gainutdinov M. Kh. Opposite responses of the cholinergic nervous system to moderate heat stress and hyperthermia in two soil nematodes // J. Thermal Biol. - 2016. - V. 62. - P. 37-49.
4. Pereira L., Kratsios P., Serrano-Saiz E., Sheftel H., Mayo A.E., Hall D.H., White J.G., LeBoeuf B., Garcia L.R., Alon U., Hobert O. A cellular and regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans // eLIFE. - 2015. - V. 4. - e12432.
5. Kalinnikova T. B., Shagidullin R. R., Kolsanova R. R., Osipova E. B., Zakharov S. V., Gainutdinov M. Kh. Acetylcholine deficiency in Caenorhabditis elegans induced by hyperthermia can be compensated by ACh-esterase inhibition or activation of GAR-3 mAChRs // Environment and Natural Resources Research. - 2013. - V. 3. - P. 98-113.
6. Chan J. P., Staab T. A., Wang H., Mazzasette C., Butte Z., Sieburth D. Extrasynaptic muscarinic acetylcholine receptors on neuronal cell bodies regulate presynaptic function in Caenorhabditis elegans // J. Neurosci. - 2013. - V. 33. - P. 14146-14159.
7. Dittmann J. S., Kaplan J. M. Behavioral impact of neurotransmitter-activated GPCRs: muscarinic and GABAb receptors regulate C. elegans locomotion // J. Neurosci. - 2008. - V. 28. - P. 71047112.
8. Glosh R., Mohammadi A., Kruglyak L., Ryu W.S. Multiparameter behavioral profiling reveals distinct thermal response regimes in Caenorhabditis elegans // BMC Biol. - 2012. - V. 10. - P. 1-17.
9. Kalinnikova T. B., Kolsanova R. R., Shagidullin R. R., Osipova E. B., Gaynutdinov M. Kh. On the role of gene of SER-4 serotonin receptor in thermotolerance of Caenorhabditis elegans behavior // Russian Journal of Genetics. - 2013. - V. 49. - P. 363-366.
10. Jospin M., Qi Y. B., Stawicki T. M., Boulin T., Schuske K. R., Horvitz R., Bessereau J.-L., Jorgense, E. M., Jin Y. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans // PLoS Biology. - 2009. - V. 7. - e1000265.
11. Rand J. B. Acetylcholine [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://wormbook.org/ chapters/www_acetylcholine/acetylcholine.pdf
12. Gainutdinov M. Kh., Belova E. B., Kalinnikova T. B., Kolsanova R. R., Shagidullin R. R. Sensitization of nicotinic acetylcholine receptors of soil nematode Caenorhabditis elegans through activation of muscarinic receptors by arecoline // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. - 2015. - V. 51. - P. 349-351.
Материал поступил в редакцию 19.05.2017 © Калинникова Т. Б., Яхина А. Ф., Егорова А. В., Хакимова Д. М., Белова Е. Б., Гайнутдинов М. Х., 2017
