CC BY
5
же 3% спирто-водный раствор азотнокислого серебра (0,1 мл на пробу). В последнем случае термическая обработка проб исключается.
2. В качестве поглотительного раствора рекомендуется использовать охлажденный этиловый спирт.
ЛИТЕРАТУРА
А 1 t s h u 1 1 е г А. Р., Cohen I. R., Taft R. А., Analyt. Chem., 1961, v. 33, р. 726.
Поступила 7/XII 1970 г.
УДК 616.36-008-08 ?:612.354.2]-072.7
МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ
[по пробе с нагрузкой сантонином 1
Канд. мед. наук М. Я• Тверская, Т. П. Иванова
Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс, Киев
Методы, используемые в настоящее время для определения антитоксической функции печени и ее изменения под влиянием химических веществ, направлены главным образом на оценку детоксикации яда путем синтеза и фиксации (проба Квика — Пытеля, гексеналовая проба). Вместе с тем большинство химических веществ превращается в печени путем окисления. При этом процессы окисления, как правило, в организме нарушаются раньше, чем процессы синтеза и фиксации. В связи с этим изыскание методов, позволяющих оценить состояние окислительной детоксикации, приобретает особую актуальность.
МоикМаг и Э]еуа1 для определения антитоксической окислительной функции печени у людей предложили пробу с нагрузкой сантонином, основанную на том, что сантонин, окисляясь в печени, превращается в окси-сантонин, который выделяется с желчью и мочой. Оксисантонин в отличие от сантонина хорошо растворяется в воде и с раствором щелочи образует комплекс, характеризующийся весьма стойким розовым окрашиванием. Изменение характера кривых выделения во времени оксисантонина с мочой после нагрузки сантонином, определяемое по интенсивности окраски, свидетельствует о вовлечении печени в патологический процесс.
Е. М. Кучеренко и соавт. апробировали данный метод в клинике в комплексе с другими методами исследования антитоксической функции печени (проба Квика — Пытеля и др.) и подчеркнули его значение. Однако дальнейшего распространения в клинике и эксперименте данный метод не получил, поскольку интенсивность окрашивания, образующегося в результате взаимодействия оксисантонина с раствором щелочи, оценивалась визуально и, следовательно, носила субъективный характер. Объективной оценке интенсивности окраски мешали разные ее оттенки, обусловленные постоянно изменяющейся цветностью мочи.
Цель настоящей работы состояла в разработке модификации метода определения антитоксической окислительной функции печени по выделению оксисантонина с мочой после нагрузки сантонином, которая позволяла бы объективно оценить интенсивность окраски и была бы пригодна для проведения исследований в эксперименте на мелких лабораторных животных. Для решения поставленной задачи были подобраны дозы и выбран способ введения сантонина крысам, определены условия для получения устойчивого окрашивания. Затем на спектрофотометре СФ-4А и СФ-10 были сняты полные спектры поглощения в УФ области для чистой и обработанной щелочью мочи животных и мочи после нагрузки животных сантонином.
В результате этих исследований было установлено, что изменение цветности мочи не мешает спектрофотометрическому определению интенсивности окрашивания в результате взаимодействия оксисантонина со щелочью, так как максимумы поглощения для мочи с оксисантонином и без него расположены на разных длинах волн.
С целью проверки разработанной модификации мы провели 90 определений антитоксической окислительной функции печени по пробе с нагрузкой сантонином у интактных животных. Наряду с этим для выяснения степени чувствительности пробы с нагрузкой сантонином по сравнению с другими «печеночными тестами» нами была произведена серия опытов на крысах с токсическим гепатитом.
Общая характеристика следующая. Сантонин в виде 1% водной эмульсии вводят мелким лабораторным животным внутрижелудочно при помощи зонда в дозе 50 мг на 1 кг веса тела. Для приготовления эмульсии сантонина в качестве эмульгатора используются ОП-7. Одновременно с рассчитанным на вес животного количеством эмульсии сантонина в 1 шприце вводят дополнительно 2 мл молока, что необходимо для повышения диуреза.
После введения сантонина животных помещают в обменные клетки (без корма и питья) для сбора мочи за 18—20 часов. Объем собранной за указанный срок мочи должен составлять не менее 4 мл, так как происходящее при меньшем объеме мочи концентрирование оксисантонина обычно обусловливает чрезмерно интенсивное окрашивание, снижающее точность определения.
Из собранной мочи после центрифугирования отбирают 2 мл прозрачного центрифугата, к которому прибавляют 2 мл 30% водного раствора КОН. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр и по истечении 30 мин. подвергают спектрофотометрированию на аппарате СФ-4А в кварцевой кювете; расстояние между гранями 1 см при длине волны 508 мм. Компенсирующей жидкостью служит 30% водный раствор КОН. Измерение оптической плотности каждой пробы производят не менее 3 раз; учитывают среднюю арифметическую из 3 отсчетов. Интенсивность окраски выражают в единицах экстинкции. Раствор щелочи следует прибавлять к каждой пробе отдельно по времени с тем, чтобы спектрофотометрирование ее проводилось точно через 30 мин.
Исследования были проведены в летний период у здоровых белых беспородных крыс 3 групп (по 10 в каждой). Мочу для определения пробы собирали по 3 раза у каждого животного.
В результате этих исследований было установлено, что хотя величина экстинкции оксисантонина для отдельных животных колебалась в довольно широких пределах, средние данные для каждой группы оказались практически однородными и составляли 1,14+0,12; 1,19+0,14; 1,33+0,04.
Опыт по определению функционального состояния печени у животных, подвергавшихся многократному повторному воздействию CCI 4, проводили следующим образом. Интоксикацию вызывали у животных путем ежедневного введения в желудок СС14 в дозе 0,5 мл/кг в течение 20 дней (Fodor и Кетегу).
На протяжении этих 20 дней и в течение 30 дней после прекращения введения СС14 наблюдали за весом тела, общим состоянием и поведением животных, их отношением к пище, питью и пр. Наряду с этим на 5, 10 и 20-е дни опыта и на 10, 20 и 30-е дни после прекращения введения яда определяли функциональное состояние печени по следующим показателям: протромбиновое время, содержание нейраминовых кислот, антитоксическая функция печени по пробе с нагрузкой бензойнокислым натрием (проба Квика — Пытеля) и с нагрузкой сантонином в разработанной модификации.
В результате этих исследований у животных, получавших СС14 в течение 1-й недели опыта, были отмечены общее возбуждение, неопрятность, снижение веса тела в среднем на 15,4%. В дальнейшем состояние и поведение подопытных крыс нормализовались и не отличались от таковых в контроле.
3*
67
Средние данные определения функционального состояния печени у крыс на разных этапах интоксикации
Показатели Исходные данные Данные, полученные при введении СС14 через разные сроки (в днях) Данные, полученные после прекращения введения СС14 через разные сроки (в днях)
S 10 20 10 10 30
Вес Опыт Контроль Р 208,0+7,5 208,0± 14,0 176,0±8,5 209,0± 16,0 <0,1 207,0+9,0 222,0+16,4 <0,5 201,0±8,5 221,0± 17,0 <0,5 221,0±8,2 221,0± 17,4 215,0± 11,0 210,0± 17,1 227,0± 9,1 232,0± 18,0
Протромбиновое время Опыт Контроль Р 16,0±0,4 17,0±0,1 22,0+0,8 17,0±0,1 <0,05 17,0±0,03 16,0±0,04 <0,05 17,0±0,5 15,0±0,45 <0,05 16,0±0,35 13,0±0,9 <0,05 16,0± 0,53 16,0±0,6 17,0±0,4 17,0+0,1
Дифениламиновая проба Опыт Контроль Р 125±3,6 130±5,7 150±6,6 130±5,7 <0,02 132±7,8 131±3,6 184 ±6,3 157±5,2 <0,01 196±6,5 181 ± 6.5 >0,05 161 + 7,7 175±2,7 >0,05 135± 5,6 142±6,2
Проба Квика — Пытеля Опыт Контроль р 34,1 + 7,5 37,6+3,2 — 29,5± 7,8 37,6±3,2 >0,05 37,6±5,5 38,7+5,7 >0,25 40,0+ 10,2 43,0+3,8 36,0±5,6 41,0±7,2
Сантониновая проба Опыт Контроль р 1,33±0,15 1,13±0,15 2,2±0,01 1,19±0,02 <0,05 1,7±0,06 1,65±0,12 >0,05 1,98±0,07 1,56±0,08 <0,05 1,74±0,02 1,4±0,04 <0,05 1,13±0,05 1,3±0,14 1,19+0,15 1,2±0,3
* % V
Средние данные определения функционального состояния печени по перечисленным показателям представлены в таблице.
Как видно из таблицы, наиболее значительным у подопытных живот-% ных оказалось изменение протромбинового времени, наблюдавшееся на протяжении всего опыта и через 10 дней после прекращения введения СС14. Содержание нейраминовых кислот в крови достоверно увеличилось по сравнению с контролем на 5-й и 20-й дни опыта, в дальнейшем изменения этого показателя были статистически недостоверными. Синтез гиппуровой кислоты у подопытных крыс (проба Квика — Пытеля) лишь на 10-й день опыта снизился на 25% по сравнению с контролем, но изменения были недостоверны-ными.
Уровень оксисантонина в моче подопытных крыс на 5-й день увеличился почти в 2 раза по сравнению с контролем и колебался на повышенных цифрах на протяжении всего опыта и 10 дней после прекращения введения яда. Только еще через 10 дней он снизился до исходного. ^ Отмечавшееся у контрольных (интактных) животных в период проведе-
ния опыта с CCI 4 повышение плотности мочи в области длины волны, характерной для оксисантонина, связано, по-видимому, со снижением диуреза сезонного характера (опыты с СС14 проводились зимой). Следует, однако, подчеркнуть, что изменение плотности мочи у подопытных животных достоверно отличалось от соответствующих данных, полученных у контрольных (интактных) животных в этот же период.
Таким образом, проба с нагрузкой сантонином в разработанной модификации не уступала по чувствительности одному из наиболее чувствительных из использовавшихся тестов (протромбиновое время), позволяющих выявить нарушение функционального состояния печени.
Подводя итоги изложенному, можно прийти к выводу, что разработанная модификация пробы с нагрузкой сантонином пригодна для определения антитоксической окислительной функции печени у мелких лабораторных животных и может быть рекомендована для экспериментального изучения Ч изменения функционального состояния данного органа под влиянием различных токсических агентов.
ЛИТЕРАТУРА
Кучеренко Е. М. Тер. арх. 1962, в. 1, с. 67. — Кучере н ко Е. М. и др. Там же, в. ! 1, с. 80. — F о d о г С., К е m е г у С. L., Experietia (Basel). 1965, v. 21, p. 666. — M о u k h t a r A., D j e v a t H., Presse med., 1933, v. 41, p. 1501.
Поступила 29/VI 1970 г УДК 613.262:615.285.7]-074
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ [в тонком слое1 МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФАМИДА В ФРУКТАХ И ОВОЩАХ
* Канд. биол. наук Т. И. Голубев, В. А. Волкова
Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений, Ленинград
Фосфамид (рогор) — перспективный инсектицид — акарцид из группы фосфорорганических соединений. Его действующим веществом является 0,0-диметил-5-(Ы-метилкарбамидометил) дитиофосфат:
СН-гО-. м
^р - 5СНгСОШ сн^.
СН^О
Химически чистый фосфамид — белое кристаллическое вещество с приятным камфарным запахом, технический препарат — густая маслянистая жидкость с неприятным запахом. Фосфамид легко растворяется во многих
