CC BY
5
Средние данные определения функционального состояния печени по перечисленным показателям представлены в таблице.
Как видно из таблицы, наиболее значительным у подопытных живот-% ных оказалось изменение протромбинового времени, наблюдавшееся на протяжении всего опыта и через 10 дней после прекращения введения СС14. Содержание нейраминовых кислот в крови достоверно увеличилось по сравнению с контролем на 5-й и 20-й дни опыта, в дальнейшем изменения этого показателя были статистически недостоверными. Синтез гиппуровой кислоты у подопытных крыс (проба Квика — Пытеля) лишь на 10-й день опыта снизился на 25% по сравнению с контролем, но изменения были недостоверны-ными.
Уровень оксисантонина в моче подопытных крыс на 5-й день увеличился почти в 2 раза по сравнению с контролем и колебался на повышенных цифрах на протяжении всего опыта и 10 дней после прекращения введения яда. Только еще через 10 дней он снизился до исходного. ^ Отмечавшееся у контрольных (интактных) животных в период проведе-
ния опыта с CCI 4 повышение плотности мочи в области длины волны, характерной для оксисантонина, связано, по-видимому, со снижением диуреза сезонного характера (опыты с СС14 проводились зимой). Следует, однако, подчеркнуть, что изменение плотности мочи у подопытных животных достоверно отличалось от соответствующих данных, полученных у контрольных (интактных) животных в этот же период.
Таким образом, проба с нагрузкой сантонином в разработанной модификации не уступала по чувствительности одному из наиболее чувствительных из использовавшихся тестов (протромбиновое время), позволяющих выявить нарушение функционального состояния печени.
Подводя итоги изложенному, можно прийти к выводу, что разработанная модификация пробы с нагрузкой сантонином пригодна для определения антитоксической окислительной функции печени у мелких лабораторных животных и может быть рекомендована для экспериментального изучения Ч изменения функционального состояния данного органа под влиянием различных токсических агентов.
ЛИТЕРАТУРА
Кучеренко Е. М. Тер. арх. 1962, в. 1, с. 67. — Кучере н ко Е. М. и др. Там же, в. ! 1, с. 80. — F о d о г С., К е m е г у С. L., Experietia (Basel). 1965, v. 21, p. 666. — M о u k h t a r A., D j e v a t H., Presse med., 1933, v. 41, p. 1501.
Поступила 29/VI 1970 г УДК 613.262:615.285.7]-074
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ [в тонком слое1 МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФАМИДА В ФРУКТАХ И ОВОЩАХ
* Канд. биол. наук Т. И. Голубев, В. А. Волкова
Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений, Ленинград
Фосфамид (рогор) — перспективный инсектицид — акарцид из группы фосфорорганических соединений. Его действующим веществом является 0,0-диметил-5-(М-метилкарбамидометил) дитиофосфат:
СН-гО-. м
^р - 5СНгСОШ сн^.
СН^О
Химически чистый фосфамид — белое кристаллическое вещество с приятным камфарным запахом, технический препарат — густая маслянистая жидкость с неприятным запахом. Фосфамид легко растворяется во многих
органических растворителях, трудно — в петролейном эфире и лигроине, растворимость его в воде при комнатной температуре равна 39 г!л (Г. Шра-дер).
Фосфамид обладает внутрирастительными и контактным действием. Его применяют против вредителей плодовых, овощных и цитрусовых культур, а также против вредителей хлопчатника, в ветеринарной практике — для борьбы с личинками подкожного овода (П. В. Сазонов). Фосфамид умеренно токсичен для теплокровных животных, но в тканях растений и животных, по данным Оа^егтап и соавт., Бапи и соавт. и др., он может окисляться до Р-О-фосфамида: 0,0 — диметил-З-(М-метилкарбамидометил) тиофосфата
снуэ^,?
— БСНоСОШСНл • СН}СГ ' '
токсичность которого для теплокровных значительно выше.
В настоящее время существует несколько методов определения фос-фамида в биологическом материале. Bazzi, а также Jl. М. Фукельман описали колориметрические методы определения фосфамида по фосфору. Но они неспецифичны, так как по фосфору определяют и другие фосфорсодержащие соединения и метаболиты фосфамида. Методы определения фосфамида в тонком слое адсорбента (М. А. Клисенко; Е. С. Косматый; Beitz и Heinisch) специфичны, но требуют дополнительной очистки растительных экстрактов от сопутствующих веществ, мешающих анализу.
Основываясь на некоторых данных отечественных и зарубежных авторов (Г. Ф. Вылегжанина и соавт.; Abbott и соавт., и др.), мы разработали специфический хроматографический метод обнаружения микроколичеств фосфамида в биологическом материале, применив для очистки растительных экстрактов извлечение фосфамида из водной вытяжки хлороформом, а также хроматографирование в системе н-гексан — этилацетат (1 : 1).
Очистку силикагеля и приготовление хроматографических пластинок производят следующим образом. Силикагель марки КСК (размер частиц 0,040—0,060 мм) заливают разбавленной 1 : 1 соляной кислотой. По мере отстаивания кислота декантируется и силикагель снова обрабатывается свежей порцией кислоты. Эту операцию повторяют до тех пор, пока новая порция кислоты не перестанет окрашиваться в желтый цвет. Затем силикагель промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на ионы хлора, обрабатывают 98% раствором уксусной кислоты и снова промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. После этого силикагель обрабатывают метанолом при перемешивании и нагревании до температуры кипения метанола в течение 3 часов на водяной бане с обратным холодильником, затем отсасывают на воронке Бюхнера и активируют 4 часа при 120° в сушильном шкафу. Адсорбент хранится в банке с притертой пробкой.
Силикагель наносят тонким слоем (около 0,2 мм) на стеклянную пластинку размером 50x130 мм в смеси с водой и гипсом (1,7 г силикагеля, 0,1 г гипса и 4 мл воды), активируют пластинку 30 мин. при 130°, после чего ее можно хранить в эксикаторе над плавленым хлористым кальцием до 7 дней.
Размельченную навеску исследуемого материала, взятую из средней пробы в количестве 100 г, помещают в колбу, заливают водой и взбалтывают 15 мин., затем фильтруют через слой ваты, замеряют общий объем фильтрата, берут 0,1 часть его и помещают в делительную воронку для экстракции инсектицида. Экстракцию производят 2-кратной обработкой вытяжки хлороформом, взятым в равных объемах по отношению к водной вытяжке при взбалтывании в течение 10 мин. Во избежание образования эмульсии перед экстракцией к вытяжке добавляют 5—10 г химически чистого хлористого натрия. Далее очистку растительного экстракта производят хромато-
графически. Для этого общий объем хлороформного экстракта концентрируют под вакуумом примерно до 0,5 мл и микропипеткой количественно наносят горизонтальной узкой полоской на пластинку с силикагелем, отступя от нижнего края на 15—20 мм. Пластинку ставят для хроматогра-фирования почти вертикально в герметический стеклянный сосуд (150 х Х80 мм), содержащий 25—30 мл смеси н-гексана и этилацетата (1 : 1). Пластинку выдерживают в сосуде до тех пор, пока подвижный растворитель не пройдет от старта 100 мм. Время хроматографирования 25—30 мин. По окончании этой операции пластинку высушивают под тягой до полного удаления растворителей.
После хроматографирования инсектицид располагается на пластинке на расстоянии 11—12 мм от старта. Сопутствующие вещества, мешающие анализу, частично остаются на старте, частично поднимаются по пластинке
Рис. 1. Хроматограмма (Л) и локализованная зона фосфамида на пластинке с силикагелем (Б), используемая для анализа без обработки хромогеновым реактивом. а — линия старта: б — фосфамнд; / — зона фосфамида.
Рис. 2. Хроматограмма фосфамида (химически чистый препарат), идентифицированного из свежей капусты. К — контроль; 1 — пятно фосфамида; 2 — пятно фосфамида-«свидетеля».
на 80—90 мм. Все это можно увидеть, если после хроматографирования пластинку опрыснуть 0,5% раствором бриллиантового зеленого в ацетоне с последующей обработкой ее парами брома в течение 30 сек. Инсектицид обнаруживают в тонком слое в виде желтой полосы /?/=0,11—0,12 (рис. 1). При определении фосфамида в биологическом материале эту зону локализации пестицида используют для анализа без предварительной обработки пластинки хромогеновыми реактивами. Для количественного определения фосфамида зону силикагеля с фосфамидом снимают с пластинки, ядохимикат извлекают дистиллированной водой при 10-минутном взбалтывании и после фильтрации под вакуумом через фильтр Шотта № 2 дважды экстрагируют хлороформом из водной вытяжки при помощи делительной воронки. Очищенный таким образом хлороформный экстракт концентрируют под вакуумом до 0,1—0,2 мл и количественно наносят в одну точку на стеклянную пластинку (50x130 мм) с силикагелем. Рядом на ту же пластинку наносят «свидетель» — химически чистый препарат фосфамида и «контроль» — растительный экстракт, не содержащий ядохимиката.
Хроматографирование производят в системе растворителей хлороформ— ацетон (9 : 1). Через 25—30 мин., когда фронт растворителя поднимется от старта на 10 см, пластинку высушивают под тягой и обрабатывают раствором бриллиантового зеленого и парами брома. На пластинке появляются
Рис. 3. Хроматограмма различных количеств фосфамида. а — химически чистый препарат: 1—5 — соответственно 3, 5. 10, 15 и 20 мкг; б — тех-нвческий препарат: 1—3 — соответственно 15, 10 и 5 мкг.
желтые пятна фосфамида /?/=0,35 (рис. 2). Отсутствие пятен в контроле свидетельствует о хорошей очистке растительных экстрактов от сопутствующих веществ, мешающих анализу. При этом, как показали наши наблюдения, такая очистка не ведет к большим потерям ядохимиката.
Фосфамид в биологическом материале определяют, сравнивая величину пятен инсектицида из исследуемого экстракта с величиной пятен инсекти-цида-«свидетеля». Для этой цели предварительно готовят соответствующую шкалу, нанося на пластинку с силикагелем (90—120 мм) 3, 5, 10, 15 и 20 мкг фосфамида. После хроматографи-рования и проявления на пластинке сразу же появляются пятна фосфамида. Размеры пятен находятся в прямой зависимости от количества инсектицида (рис. 3, а). Пользуясь приготовленной шкалой, количество инсектицида в исследуемом материале вычисляют по формуле:
X = •4100° 10 1000'
где X — количество инсектицида (в миллиграммах) в 1 кг анализируемого продукта; А — количество инсектицида (в микрограммах) в 10 г образца, найденное по шкале; 10 — навеска образца (в граммах), взятая для анализа;
Полнота извлечения фосфамида из биологического материала (средние данные из 3 повторностей)
Исследуемый материал Количество инсектицида, внесенного в пробу Количество инсектицида, обнаруженного в пробе Точность определения (в %)
мкг
Яблоки 2,0 1,543+0,066 75,4—73,05
3,0 2,286+ 0,133 77,3—71,76
10,0 10,0±0 100,0
20,0 20,0±0 100,0
Капуста 5,0 5,0±0 100,0
10,0 10,0±0 100,0
15,0 12,66± 0,333 86,6—82,1
20,0 20,0±0 100,0
1000 — навеска образца (в граммах), на которую ведется пересчет количества инсектицида; 1000 — переводной коэффициент микрограммов в миллиграммы.
Точность метода проверяли на яблоках и капусте, в которые предварительно вносили различное количество инсектицида. Из таблицы видно, что рекомендуемым методом можно определять фосфамнд с достаточной точностью (71—100%). Если иметь в виду, что удается определять минимальное количество пестицида — 2 мкг, то чувствительность метода составит 0,2 мк/кг. Для проверки метода на техническом 40% препарате фосфамида БИ-58 (рис. 3, б) была приготовлена стандартная шкала, площади пятен на которой не отличались от размера соответствующих пятен на шкале химически чистого фосфамида. Анализы на растительном материале показали, что для химически чистого и технического фосфамида точность и чувствительность метода одинаковы.
Вывод
Разработан доступный хроматографический (в тонком слое) микрометод определения фосфамида в яблоках и капусте. Он позволяет определять фосфамид с точностью 71—100% заданного количества. Чувствительность метода 0,2 мг/кг.
ЛИТЕРАТУРА
Голубев Т. И., Волкова В. А. Вопр. питания, 1967, № 1. —Косматый Е. С. Методы анализа остатков пестицидов. М., 1968.—Сазонов П. В. В кн.: Гигиена и токсикология пестицидов и клиника отравления. Киев, 1965, с. 27. — Abbott D. С., Buntino T. A., Thomson T., The Analyst., 1966, v. 91.— В е i t z H., H e i n i s с h E., Nachr Bl dt Dejtschen Pflschutzdienst (Stuttg), 1967, Bd 7, S. 125.
Поступила 7/1* 1970 г.
УДК 613.281-07:615.256.SI.024
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИЭТИЛСТИЛЬБЭСТРОЛА В МЯСЕ И СУБПРОДУКТАХ
Г. П. Вавилина Л. Ф. Адигамов, JI. Я• Соловьева, E. Е. Рязанцева Институт питания АМН СССР, Москва
Применение гормональных препаратов способствует увеличению продуктивности животноводства. Возможность их использования определяется тем, что употребление в пищу мясных продуктов, полученных от животных, которым вводили гормональные препараты, безопасно для здоровья людей. При гигиеническом изучении мяса и субпродуктов, полученных от животных, стимулированных гормональными препаратами, важно определение остаточного количества этих веществ.
Настоящая работа посвящена определению диэтилстильбэстрола в продуктах животного происхождения. При этом использован химический метод, официально принятый в США г. В этот метод были внесены некоторые изменения, касающиеся облучения диэтилстильбэстрола в УФ свете и условий экстракции (16-часовая экстракция заменена экстракцией по Hos-kins). Экстракцию диэтилстильбэстрола проводили 7% этиловым спиртом в хлороформе с добавлением 2 г целита (на 20 г ткани) на магнитной мешалке при 40° в течение 60 мин. Экстракт фильтровали через бумажный фильтр и к фильтрату добавляли 1 н. раствор H2S04 (на 50 мл фильтрата 25 мл 1 н. раствора H2S04). После тщательного перемешивания в делительной воронке отделяли нижний хлороформный слой. К кислотному слою добавляли 10 мл хлороформа и повторяли описанную выше процедуру. Хлороформные
1 Association of Officiai Agricultural Chemics. Washington, 1965, [sec. 33039.
