Идентификация тритерпено-вых сапонинов корневищ с корнями синюхи с помощью тонкослойной хроматогра-фии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ФАРМАКОГНОЗИЯ И БОТАНИКА

Ю.А. Голяк, О.М. Хишова,

Н.В. Дубашинская

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТРИТЕРПЕНО-ВЫХ САПОНИНОВ КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ СИНЮХИ С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Витебский государственный медицинский университет

Разработана методика идентификации тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи методом тонкослойной хроматографии. Оптимальные условия проведения ТСХ: силика-гельная пластина - «Сорбфил», раствор сравнения — раствор эсцина, элюирующая система — бутанол Р — этанол 96% Р — аммиака раствор концентрированный Р (10:4:4), детектирующий реагент

— раствор фосфорномолибденовой кислоты Р.

ВВЕДЕНИЕ

Создание лекарственных средств (ЛС) на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) является важной задачей в области фармацевтической технологии. Лекарственные растения (ЛР) в медицине широко используются как для лечения заболеваний, так и для их профилактики. Отсутствие выраженных побочных эффектов при приеме ЛС на основе ЛРС является одним из преимуществ фитотерапии по сравнению с фармакотерапией.

Одним из ЛР, представляющим интерес для медицинского применения, является синюха голубая.

Основными биологически активными веществами (БАВ) синюхи голубой являются тритерпеновые сапонины (ТС). Сапонины - сложные органические соединения гликозидного характера, водные растворы которых образуют при встряхивании обильную, очень стойкую пену, подобную мыльной, за что они получили свое название (от латинского «Баро» - мы-

ло). Сапонины синюхи обладают высокой гемолитической активностью. Для корней и корневищ гемолитический индекс составляет 7000 - 11000, для травы не превышает 1000, для отдельных фракций достигает 100000 - 200000 [1].

Тонкослойной хроматографией на силикагеле установлено, что метанольный экстракт содержит, по крайней мере, пять соединений, дающих характерную окраску с треххлористой сурьмой [2]. По степени возрастания полярности они названы по-лемониозидами А, В, С, D и Е. Для выделения полемониозида В и полемониозида С метанольный экстракт переводили в водный раствор и последовательно извлекали этилацетатом и бутанолом, затем бу-танольную фракцию хроматографически разделяли на колонке с силикагелем [2]. Сахарная часть полемониозида С состоит из уроновой кислоты, галактозы и араби-нозы, а сахарная часть полемониозида В -из галактозы и уроновой кислоты [2, 3].

Впервые структура агликонов была установлена для ТС, выделенных из корневищ с корнями Ро1етошш reptans [4]. Затем K. Hiller с соавторами изолировали из корневищ с корнями синюхи голубой комплекс сапогенинов и доказали, что генная часть состоит в основном из эфиров, которые относятся к типу тритерпена. В качестве кислотных остатков эфира были уксусная, ангелиновая, тигловая а -метилмасляная кислоты, а также в следовых количествах пропионовая и изомасля-ная кислоты. Основа скелета тритерпена представляет собой смесь, состоящую преимущественно из высоко гидроксилиро-ванных тритерпеновых спиртов. Из смеси сапогенина изолировали полемониогенин А (С37Н5бО8) - диэфир камеллиагенина Е

[5].

Для выделения ТС из корневищ с корнями синюхи голубой и установления их структуры метанольное извлечение экстрагировали бутанолом и осаждали диэти-ловым эфиром. Полученный осадок ТС очищали на колонке с Sephadex и на колонке с силикагелем. С помощью тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ установ-

лено, что очищенный экстракт содержит 6 основных и 5 дополнительных ТС. Из 6 основных ТС препаративной ВЭЖХ выделены 3 индивидуальных химических со-

единения, названных полемониумсапони-ном 1, полемониумсапонином 2 и полемо-ниумсапонином 3 (рис. 1) [6].

Полемониумсапонин 2: Р = Полемониумсапонин 3:Р =

—ООС\ /СН3

Н3С ^

ООС

>=С

Н

_^Н

Н3С' "СНз

Рис. 1. Химическая структура полемониумсапонинов

3

Для идентификации ТС в действующей нормативной документации описана реакция пенообразования. Эта реакция является общей на ЛРС, содержащее ТС [7]. Поэтому актуальной является задача идентификации ТС корневищ с корнями синюхи методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССДЕДОВАНИЯ Материалы исследования: корневища с корнями синюхи, хроматографические пластины для ТСХ «Силуфол» (Чехия) 15 х 15 см, «Сорбфил» (Россия) 10 х 10, эс-цин с молекулярной массой 1101,24 («Бійка»). Твердофазную экстракцию осуществляли с использованием сорбента Диасорб-100-С16 с диаметром частиц сорбента 63 - 200 мкм (ЗАО «БиоХимМак СТ»).

В качестве метода исследования использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ).

В качестве стандарта использовали раствор рабочего стандартного образца (РСО) эсцина в спирте 70% Р с концентрацией 2 мг/мл, так как его химическая структура близка к структуре ТС корневищ с корнями синюхи (рис. 2).

В качестве проявителя для ТС наиболее часто используют 25% раствор фосфорновольфрамовой кислоты в спирте 96% Р и 10% раствор фосфорномолибденовой кислоты Р в спирте 96% Р.

При использовании фосфорно-фольфрамовой кислоты зоны, содержащие ТС, проявляются в виде малиновых пятен на белом фоне, а при использовании раствора фосфорномолибденовой кислоты Р -в виде темно-синих пятен на желтом фоне. Обработка пластин парами аммиака в последнем случае позволяет обесцветить фон и повысить контрастность пятен. Исходя из литературных данных, чувствительность реакции ТС с фосфорномолибденовой кислотой Р выше, чем с фосфорновольфрамовой кислотой, поэтому при раз-

работке методики идентификации использовали фосфорномолибденовую кислоту Р

с последующей обработкой парами аммиака [8].

Ч/

НООС

О'

Из

>

=С

^СНз

",//ООССН3 СН2ОН

‘"ЮН

Н3С' Н

Ангеликовая кислота НООС^ /Н

>

=С^Г

С\,

Нз^ 'СН3

Тиглиновая кислота СНзч

НзС

>

Н—С Н2—СООН

В позициях Я1 и Я2

Изомаслянная кислота 2 остатка Б-глюкозы или 1 остаток Б-глюкозы и остаток Б-

ксилозы. В позиции Я3 - ангеликовая, тиглиновая и изомасляная кислоты

Рис.2. Химическая структура эсцина

Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10 (Россия). Высота подъема фронта 10 см на пластинах «Силуфол» и 6 см на пластинах «Сорбфил».

Методика 1. 1,0 измельченных

корневищ с корнями синюхи, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещали в круглодонную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл спирта 40% Р. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Горячее извлечение процеживали через вату, охлаждали (раствор 1).

На линию старта хроматографической пластинки наносили 5 мкл раствора 1 в виде полосы длиной 1 см, рядом наносили в виде точки 3 мкл раствора раствора РСО Р-эсцина с концентрацией 2 мг/мл. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 5 мин, затем помещали в камеру с элюирующей системой и хроматографировали восходящим способом (смесь растворителей заливали в камеру за 60 мин до хроматографирования). Когда фронт растворителей проходил 6 см, пластинку вынимали из камеры, высушивали в вытяжном шкафу в течение 2 мин, обрабатывали 10% раствором фосфорномолибденовой кислоты Р и нагревали ее в течение 2 - 3 мин в сушильном шкафу при температуре 100 - 105 0С. На уровне пятна РСО Р-эсцина проявлялась

полоса темно-синего цвета на желтом фоне. При обработке пластины парами аммиака происходило обесцвечивание фона.

Сравнивали количество полос темно-синего цвета, получаемое при хроматографировании извлечения из корневищ с корнями синюхи в четырех, наиболее часто рекомендуемых элюирующих системах:

1. бутанол Р - уксусная кислота безводная Р - вода Р (5:1:4) верхний слой; 2. бутанол Р - этанол 96% Р - аммиака раствор концентрированный Р (7:2:5); 3. бутанол Р -этанол 96% Р - аммиака раствор концентрированный Р (10:4:4); 4. хлороформ Р -метанол Р - вода Р (30:17:3).

Для очистки от неполярных балластных веществ применяли предварительную экстракцию хлороформом, от полярных - твердофазную экстракцию, с использованием сорбента Диасорб-100-С16 по методике 2.

Методика 2. 1,0 г измельченных корневищ с корнями синюхи, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл хлороформа Р. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее хлороформное извлечение процеживали через вату. Вату помещали в колбу для экстрагирования, прибавляют 50 мл хлороформа Р и повторяли экстрагирование

на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Вытяжку процеживали через вату. Хлороформное извлечение отбрасывали. Вату помещали в колбу для экстрагирования, прибавляли 10 мл спирта 40% Р и экстрагировали в течение 15 мин. Извлечение процеживали через вату (раствор 2).

К 2 мл раствора А добавляли 8 мл воды Р (раствор 3).

5 мл раствора Б наносили на подготовленную хроматографическую колонку. Промывали под вакуумом 5 мл воды Р со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывали. Сумму ТС элюировали 2 раза по

0,5 мл спирта 96% Р (Раствор 4).

Подготовка хроматографической колонки проводилась по следующей методике: 0,2 г сорбента Диасорб-100-С16 вно-

Как видно из данных, представленных в таблице 1, на всех хроматограммах испытуемых образцов имеется полоса, значение которой совпадает со значением РСО эсцина.

Наибольшей разделяющей способностью обладает элюирующая система 3, так как при ее использовании на хроматограмме обнаруживается наибольшее число пятен темно-синего цвета. В связи с этим, данная система предложена в качестве оптимальной.

Фосфорномолибденовая кислота Р является реактивом общего назначения, позволяющим обнаружить большое число соединений различных классов. Для подтверждения того, что пятна темно-синего цвета принадлежат ТС, проводили экстракцию и очистку по методике 2.

При хроматографировании на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей: бутанол Р - этанол 96% Р - аммиака раствор концентрированный Р (10:4:4)

сили в полипропиленовый патрон с внутренним диаметром 10 мм, в нижнюю часть которого помещали стекловату. Добавляли

0,3 мл спирта 96% Р. Оставляли на 15 мин, промывали 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Скорость регулировали при помощи вакуумной системы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При использовании пластин «Си-луфол» с представленными элюирующими системами зоны получаются сильно размытыми.

Данные с использованием пластин «Сорбфил» и различных элюирующих систем представлены в таблице 1.

неочищенного извлечения (раствор 1) и очищенного извлечения по методике 2 (раствор 4) хроматограммы испытуемых образцов были идентичны.

Полученные результаты позволяют использовать ТСХ-анализ ТС из корневищ с корнями синюхи без предварительной очистки.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика идентификации тритерпеновых сапонинов корневищ с корнями синюхи.

2. Подобраны оптимальные параметры проведения ТСХ-анализа для три-терпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи.

3. Разработанная методика может быть использована для стандартизации корневищ с корнями синюхи голубой и лекарственных средств на ее основе.

Таблица 1 - Значения Rf ТС корневищ с корнями синюхи (n = 5, Р = G,95)

№ систе- мы Rf РСО эсцина Значения Rf извлечения из корневищ с корнями синюхи ( Х ± А Х ) Количество пятен на хроматограмме извлечения

1 G,4G±G,G5 G,4G±G,G5 - - - 1

2 G,5G±G,G5 G,3G±G,G5 G,4B±G,G5 G,62±G,G5 - 3

3 G,2G±G,G5 G,2G±G,G5 G,35±G,G5 G,4G±G,G5 G,63±G,G5 4

4 G,32±G,G5 G,2B±G,G5 G,37±G,G5 G,B4±G,G5 - 3

Вестник фармации №1 (39) 2008 ЛИТЕРАТУРА

1. Растительные лекарственные средства / Н.П. Максютина [и др.]; под общ. ред. Н.П. Максютиной. - К.: Здоров,я, 1985. - 280 с.

2. Бухаров, В. Г. Некоторые данные о строении генина - гликозида Polemonium coeruleum / В.Г. Бухаров, В. А. Талан, Л.Н. Карнеева // Химия природных соединений.

- 1969. - №5. - С. 452-453.

3. Бухаров, В. Г. Новый тип гликозид-ной связи / В.Г. Бухаров, Л.Н. Карнеева // Известия Академии Наук СССР. Сер. хим. наук - 1970. - №8. - С. 1916.

4. Jurenitsch, J. Zurstruktur der Sapo-genine aus Polemonium reptans L. / J. Jurenitsch, E. Haslinger, W. Kubelka // Die Phar-mazie. - 1979. - Vol. 34, №7. - S. 445-446.

5. Uber die saponine von Polemonium caeruleum L / K. Hiller [et. al.] // Die Phar-mazie. - 1979. - Vol. 34, №9. - S. 565-566.

6. Polemonium coeruleum L.: The main saponins of lover polarity / G. Reznicek [et. al.] // Die Pharmazie. - 1994. - Vol. 49, №1. -S. 58-61.

7. Государственная фармакопея СССР.

- XI изд. - Вып. 2. - М.: Медицина. - 1990.

- С. 362-363.

8. Количественное определение три-терпеновых сапонинов методом ВЭТСХ с использованием сканирующей денситометрии / Т.А. Брежнева [и др.] // Хим.-фарм. журнал. - 1999. - №12. - С. 43-45.

SUMMARY Y. A. Haliak, O. M. Chishova,

N. V. Dubachinskaia QUALITATIVE DETERMINATION OF THE SUM OF TRITERPENOID SAPONINS IN RHIZOMES WITH THE RADICALS OF POLEMONIUM CAERULEUM Method identification of triterpenoid saponins in rhizomes with the radicals of Po-lemonium caeruleum by thin-layer chromatography is developed. Optimal condition carry out of TLC: TLC silica gel plate -«Sorbfil», reference solution - solution escin, mobile phase - butanol R - ethanol R - ammonia solution concentrate R (10:4:4), detec-

tion reagent - solution molybdophosphoric acid R.

Поступила: 03.03.2008 г.