CC BY
21
ванную взаимодействием В7 с аналогом CD28 — молекулой CTLA-4. Кинетика последующего антительного ответа определяется участием во взаимодействии Т-хелперов с В-лимфоцитами другой пары костимупирующих молекул: CD40L-CD40, необходимых для переключения синтеза иммуноглобулинов с IgM на IgG. Другие варианты переключения контролируются цитокинами:: TGF0—с IgM на JgA, IL-4—с IgM на IgE. В эффекторнойфазе иммунного ответа на кинетику его течения существенно влияют образующиеся иммунные комплексы, которые, связываясь с Fcy-рецеп-торами макрофагов, индуцируют преимущественную продукцию IL-10, супрессирующего опосредованный ТН1 ответ. При развитии клеточно-опосредованного отпета активированные гамма-интерфероном макрофаги продуцируют антимикробные нитроксидные радикалы, которые вносят свой вклад в негативную регуляцию опосредованного Thl ответа. Продукции важнейшего пропоспалительного и регуляторного цитокина JL-12 сопутствует продукция его физиологического антагониста, биологически неактивного гомодимера IL-12 (р40)2, который синтезируется дольше и в количестве, превосходящем количество IL-12. Этим также обеспечивается негативная регуляция клеточно-опосредованного ответа. Преобладание Th2 в кинетике иммунного ответа может быть связано и с более высокой чувствительностью Thl к апоптозу. Кинетику воспалительного и иммунного ответа так или иначе искажают патогенные микроорганизмы, особенно внутриклеточно паразитирующие. Нарушения кинетики иммунного ответа лежат в основе иммунопатологических процессов, что необходимо учитывать при иммунологической лабораторной диагностике. Конечной целью иммунокоррекции является восстановление нормальной иммунокинетики.
Работа поддержана грантом РФФИ №97-04-48889.
Внутривенное введение пептида, представляющего доминантный Т-клеточный эпитоп основного белка аллергена ASP F1, приводит к отмене ответа на полный аллерген
Фролова Э.Г., Коцарева О.Д., Свирщевская Е.В.
Институт биоорганической химии
им. М. М.Шемякина и Ю. В. Овчинникова РАН
Москва, Россия
Аллергия на грибок Aspergillus fumigatus (Asp f) приводит к ряду заболеваний, включая такие тяжелые, как аллергический бронхолегочный аспергиллез (АБЛА) и астма. В состав комплекса Asp f входит более 15 белков. На начальных этапах гиперчувствительности клетки больных распознают только часть белков, главным образом низкомолекулярных. Так, у больных с легкой формой аллергии выявляются антитела к риботоксину Asp fl (18,5 кДа) и пероксисомному белку Asp f3 (18 кДа). При прогрессировании заболевания появляется 'гувствительность к основным белкам аллергена Asp fl, Asp f6, Asp-hsp и, воз-
можно, к другим. Проведение гипосенсибилизации на ранних этапах гиперчувствительности могло бы позволить предотвратить развитие тяжелых форм заболевания. В данной работе изучали в мышиной модели возможность выработки толерантности к полному аллергену, используя гипосенсибилизацию за счет введения неимму-ногенного пептида, соответствующего доминантному эпитопу белка риботоксина Asp fl. Для выявления доминантного эпитопа были синтезированы 4 пептида Asp f 1, отобранных на основе компьютерного прогноза и соответствия карманам молекулы I-Ad, которая опосредует представление данного антигена Т-клеткам. Лимфоциты лимфатических узлов мышей BALB/c, иммунизированных неочищенным экстрактом грибка Asp f в дозе 100 мкг/мышь, рестимулировали in vitro в присутствии анти-генпредставляющих клеток и пептидов. Пептид 165-177 стимулировал продукцию интерлейкина-2 (ИЛ-2) и пролиферацию Т-клеток, то есть потенциально может являться доминантным эпитопом для Т-клеток, распознающих Asp fl. Анализ продукции мРНК ИЛ-4 и ИНФ-у показал, что данный пептид является, по-видимому, регуляторным, так как поддерживает продукцию ИНФ-у, но не поддерживает продукцию ИЛ-4. Выбранный пептид вводили внутривенно в дозе 50 мкг/мышь до иммунизации экстрактом либо этим пептидом, введеном п/к с адыовантом. Однократное введение пептида приводило к полной отмене продукции ИЛ-2 in vitro лимфоцитами мышей, иммунизированных пептидом в иммуногенной форме, и к частичному снижению продукции ИЛ-2 после иммунизации экстрактом Asp f. При трехкратном введении пептида за 5,3 и 2 дня до иммунизации ответ на полный экстракт снижался значительно. Это показывает, что использование пептидов, соответствующих доминантным эпитопам белков, вызывающих первичный иммунный ответ, может значительно снизить иммунный ответ на полный аллерген, тем самым повышая порог чувствительности к аллергену и снижая риск прогрессирования заболевания.
Модельная система для изучения роли углеводов поверхности клеток-мишеней на цитотоксическую активность естественных киллеров человека
Хирова Е.В., Коваленко Е.И., Саблина М. А.,
Хайдуков С.В., Бовин Н.В.
ИБХнм. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Москва, Россия
В настоящее время известно, что существующие на поверхности клеток-мишеней олигосахариды могут выполнять роль как позитивного, так и негативного сигнала для естественных киллеров (NK-клеток) человека, усиливая или ослабляя их литическую активность. Однако механизмы углевод-зависимого распознавания все еще остаются неизвестными.
Цель: разработка модельной системы для оценки влияния углеводов поверхности клетки-мишени на цитотоксичность МК-клеток человека, включающая в себя выявление оптимальных условий для встраивания нео-гликоконыогатов в мембрану клеток-мишеней.
Задачи: подобрать оптимальные условия для встраивания гликоконыогата (ГК) в клетки-мишенн различных линий и оценить влияние содержания липидного компонента в ГК на его встраивание; изучить кинетику элиминации ГК с поверхности клеток-мишеней и охарактеризовать механизм его взаимодействия с клеточной мембраной; оценить пространственную доступность углеводных остатков после встраивания ГК. С помощью разработанной модельной системы выявить влияние трисахарида Ых на цитотоксическую активность МК-клеток человека.
Материалы и методы. В работе использовали синтетические полимерные ГК типа Оус-РАА-РЕ и 01ус-РАА(Пи)-РЕ (где 01ус — остаток сахарида, РА — полимер, РЕ — фосфатидилэтаноламин, Р1и — флуоресцеип). В качестве углеводного лиганда был выбран трисахарид Ье* (СО 15). Для оптимизации встраивания были синтезированы ГК, с разным количеством РЕ (0.5,1,2.5,5,10 и 20 мол.%). Мишенями служили клеткиэритролейкемической линии К562 и лимфобластоидных линий Ка_р и ОаисК. Факт встраивания ГК в мембрану доказывали цитофлуориметрически. Пространственную доступность остатков Ье* на клетках-мишенях определяли с помощью флуоресцентно-меченых моноклональных антител. Цитотоксичность оценивали в ци-тотоксическом тесте с помощью флуоресцентных красителей (кальциин АМ, этидиум гомодимер-1). В качестве клеток-эффекторов использовали периферические моно-нуклеары без прилипающих клеток, выделенные по стандартной методике из крови здорового донора.
Результаты. Подобраны оптимальные условия для встраивания ГК типа 01ус-РАА(Р1и)-РЕ в клетки-мишени разных линий (К562, 1Цп, ОаисП). Определено содержание в нем липидного компонента (5 мол. % РЕ), приводящее к максимальному уровню встраивания для всех использованных линий. ГК с 20 мол.% РЕ в наименьшей степени взаимодействовал с клеточной поверхностью, что можно объяснить его способностью к мицеллооб-разованию. Необходимость липидного компонента в конъюгате была доказана безуспешной попыткой встроить ГК, не содержащий РЕ, в мембрану клеток. Показано, что с течением времени ГК активно элиминируется с поверхности клеток-мишеней, и исследована кинетика этого процесса. Для клеток К562 отмечено уменьшение интенсивности флуоресценции с течением времени (через 4 часа приблизительно в 2 раза и через сутки в 7,5 раз). Выявлены различия по эффективности встраивания и элиминации ГК с поверхности клеток-мишеней разных линий, что, по-видимому, обусловлено различиями в свойствах их клеточных мембран. Доказано, что при взаимодействии ГК с мембранами клеток-мишеней имеет место истинное встраивание. Также продемонстрирована пространственная доступность углеводных лигандов (Ьех), необходимая для МК-клеточного узнава-
ния клеток-мишеней, модифицированных гликоконъюгатом. С помощью разработанной модельной системы выявлено позитивное влияние трисахарида Lex на цитотоксическую активность NK-клеток человека.
Заключение. Таким образом, нами создана модельная система для оценки влияния углеводов на цитотоксическую активность NK-клеток, включающая в себя встраивание липофильных неоппикоконыогатов в клетки-мишени. Разработанную модельную систему предполагается использовать для оценки влияния на эффекторную функцию NK-клеток различных углеводных структур — таких, как опухолеассоциированные антигены, групгюспецифичес-кие антигены, N-цепи гпикопротеинов, сульфатированные и фукозилированные углеводные лиганды.
Данная работа выполнена при поддержке РФФИ (фант 97-04-49766-а).
Индукция апоптоза тимоцитов человека при их взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса
Шарова Н.И., Дзуцев А.Х., Комогорова В. В., ЯрилинА.А.
ГНЦ— Институт иммунологии Минздрава России Москва, Россия
Введение. Сообщалось о возможной индукции апоптоза тимоцитов мышей при их совместном культивировании с тимусными эпителиальными клетками (ТЭК) (Schreiber et al., 1996), в связи с чем обсуждается возможная роль ТЭК в отрицательной селекции клонов тимоцитов (Vucmanovic et.al., 1994). Поэтому важно исследовать условия проявления и механизмы индукции апоптоза тимоцитов (в особенности тимоцитов человека) при их взаимодействии с ТЭК.
Цель исследования состояла в изучении способности ТЭК человека индуцировать апоптоз тимоцитов и условий его реализации in vitro.
Материал и методы. Источником материала для исследований служили фрагменты тимуса, иссеченные у детей в процессе операций на сердце. Использовали 1-1,5-месячную первичную культуру ТЭК (“нативные ТЭК”) с минимальной примесыо (<8%) клеток, не содержащих кератин, а также ТЭК, трансформированные вирусом SV40, дающие суспензионный или адгезивный рост. Формирование розеток ТЭК с тимоцитами определяли в смеси этих клеток (1:20), подвергнутой мягкому центрифугированию. Апоптоз оценивали цитофлуоро-метрически по численности гиподиплоидных клеток (McCloskey et al., 1994). Мембранный фенотип тимоцитов оценивали также методом проточной цитофлуоро-метрии с одновременным выявлением CD4 и CD8.
Результаты. При смешивании ТЭК и нефракциони-рованных тимоцитов около 75% ТЭК (нативные и трансформированные — в равной степени) образует розетки с тимоцитами. Через 1 сутки после начала совместного
