CC BY
19
Цель: разработка модельной системы для оценки влияния углеводов поверхности клетки-мишени на цитотоксичность МК-клеток человека, включающая в себя выявление оптимальных условий для встраивания нео-гликоконыогатов в мембрану клеток-мишеней.
Задачи: подобрать оптимальные условия для встраивания пли кокон ыогата (ГК) в клетки-мишенн различных линий и оценить влияние содержания липидного компонента в ГК на его встраивание; изучить кинетику элиминации ГК с поверхности клеток-мишеней и охарактеризовать механизм его взаимодействия с клеточной мембраной; оценить пространственную доступность углеводных остатков после встраивания ГК. С помощью разработанной модельной системы выявить влияние трисахарида Ых на цитотоксическую активность МК-клеток человека.
Материалы и методы. В работе использовали синтетические полимерные ГК типа Оус-РАА-РЕ и 01ус-РАА(Пи)-РЕ (где 01ус — остаток сахарида, РА — полимер, РЕ — фосфатидилэтаноламин, Р1и — флуоресцеип). В качестве углеводного лиганда был выбран трисахарид Ье* (СО 15). Для оптимизации встраивания были синтезированы ГК, с разным количеством РЕ (0.5,1,2.5,5,10 и 20 мол.%). Мишенями служили клеткиэритролейкемической линии К562 и лимфобластоидных линий и ОаисК. Факт встраивания
ГК в мембрану доказывали цитофлуориметрически. Пространственную доступность остатков Ье* на клетках-мишенях определяли с помощью флуоресцентно-меченых моноклональных антител. Цитотоксичность оценивали в ци-тотоксическом тесте с помощью флуоресцентных красителей (кальциин АМ, этидиум гомодимер-1). В качестве клеток-эффекторов использовали периферические моно-нуклеары без прилипающих клеток, выделенные по стандартной методике из крови здорового донора.
Результаты. Подобраны оптимальные условия для встраивания ГК типа 01ус-РАА(Р1и)-РЕ в клетки-мишени разных линий (К562, 11а.Н, ОаисП). Определено содержание в нем липидного компонента (5 мол. % РЕ), приводящее к максимальному уровню встраивания для всех использованных линий. ГК с 20 мол.% РЕ в наименьшей степени взаимодействовал с клеточной поверхностью, что можно объяснить его способностью к мицеллооб-разованию. Необходимость липидного компонента в конъюгате была доказана безуспешной попыткой встроить ГК, не содержащий РЕ, в мембрану клеток. Показано, что с течением времени ГК активно элиминируется с поверхности клеток-мишеней, и исследована кинетика этого процесса. Для клеток К562 отмечено уменьшение интенсивности флуоресценции с течением времени (через 4 часа приблизительно в 2 раза и через сутки в 7,5 раз). Выявлены различия по эффективности встраивания и элиминации ГК с поверхности клеток-мишеней разных линий, что, по-видимому, обусловлено различиями в свойствах их клеточных мембран. Доказано, что при взаимодействии ГК с мембранами клеток-мишеней имеет место истинное встраивание. Также продемонстрирована пространственная доступность углеводных лигандов (Ьех), необходимая для МК-клеточного узнава-
ния клеток-мишеней, модифицированных гликоконъюгатом. С помощью разработанной модельной системы выявлено позитивное влияние трисахарида Lex на цитотоксическую активность NK-клеток человека.
Заключение. Таким образом, нами создана модельная система для оценки влияния углеводов на цитотоксическую активность NK-клеток, включающая в себя встраивание липофильных неопликоконыогатов в клетки-мишени. Разработанную модельную систему предполагается использовать для оценки влияния на эффекторную функцию NK-клеток различных углеводных структур — таких, как опухолеассоциированные антигены, групгюспецифичес-кие антигены, N-цепи гликопротеинов, сульфатированные и фукозилированные углеводные лиганды.
Данная работа выполнена при поддержке РФФИ (фант 97-04-49766-а).
Индукция апоптоза тимоцитов человека при их взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса
Шарова Н.И., Дзуцев А.Х., Комогорова В. В., ЯрилинА.А.
ГНЦ— Институт иммунологии Минздрава России Москва, Россия
Введение. Сообщалось о возможной индукции апоптоза тимоцитов мышей при их совместном культивировании с тимусными эпителиальными клетками (ТЭК) (Schreiber et al., 1996), в связи с чем обсуждается возможная роль ТЭК в отрицательной селекции клонов тимоцитов (Vucmanovic et.al., 1994). Поэтому важно исследовать условия проявления и механизмы индукции апоптоза тимоцитов (в особенности тимоцитов человека) при их взаимодействии с ТЭК.
Цель исследования состояла в изучении способности ТЭК человека индуцировать апоптоз тимоцитов и условий его реализации in vitro.
Материал и методы. Источником материала для исследований служили фрагменты тимуса, иссеченные у детей в процессе операций на сердце. Использовали 1-1,5-месячную первичную культуру ТЭК (“нативные ТЭК”) с минимальной примесыо (<8%) клеток, не содержащих кератин, а также ТЭК, трансформированные вирусом SV40, дающие суспензионный или адгезивный рост. Формирование розеток ТЭК с тимоцитами определяли в смеси этих клеток (1:20), подвергнутой мягкому центрифугированию. Апоптоз оценивали цитофлуоро-метрически по численности гиподиплоидных клеток (McCloskey et al., 1994). Мембранный фенотип тимоцитов оценивали также методом проточной цитофлуоро-метрии с одновременным выявлением CD4 и CD8.
Результаты. При смешивании ТЭК и нефракциони-рованных тимоцитов около 75% ТЭК (нативные и трансформированные — в равной степени) образует розетки с тимоцитами. Через 1 сутки после начала совместного
культивирования тимоцитов с нативными или трансформированными ТЭК регистрируется апоптоз соответственно 37.2% и 82.5% тимоцитов сверх контрольного уровня. Способностью индуцировать апоптоз тнмоци-тов обладают также гуморальные продукты ТЭК; активность супернатанта нативных ТЭК была выше, чем целых клеток (апоптоз 66,4% тимоцитов).
Среди выживающих тимоцитов преобладали клетки фенотипов СТ)4'С08\ СП4*С08' и С04С08\ т.е. наименее и наиболее зрелые формы. Для формирования розеток между ТЭК и тимоцитами требуется сохранение жизнеспособности клетками обоих типов. Ингибиторный анализ показал энергозависимость процесса формирования контактов, важность сохранения нативных элементов цитоскелета в ТЭК (в меньшей степени в ти-моцитах),атакже сохранности биосинтеза белкавтимо-цитах. Розетки не формируются, и апоптоз не происходит в присутствии ЭГГА. Обработка тимоцитов цикло-гексимидом подавляет индукцию их апоптоза.
Заключение. Нативные и трансформированные ТЭК при совместном культивировании с тимоцитами индуцируют апоптоз С04' СГ)8> клеток. Этому предшествует формирование контактов между ТЭК и тимоцитами, однако в индукции апоптоза, наряду с контактами, участвуют гуморальные факторы, выделяемые ТЭК. Формирование кон-
Таблица. ВЛИЯНИЕ АДРЕНАЛИНА И СЕЛЕКТИВНЫХ АНТАГОНИСТОВ <х1- И а2-ДДРЕН0РЕЦЕПТ0Р0В НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ3
Препарат и его конечная Без ФГА, мкг/мл
концентрация митогена 12.5 25 50 100 200
Контроль 3.5864± 3.7002± 4.1060± 4.1450± 3.9181 ± 3.5146±
0.1338 0.2294 0.1543 0,1585 0.1962 0.2046
(3859) (5014) (12764) (13965) (8282) (3271)
Адреналин 3.4576± 3.5314± 3.7668± 3.8997± 3.6303± 3.5198±
1 мкг/мл (4,55*10* М) 0.0757 0.1111 0.1053" 0.1781' 0.1631 0.1305
Йохимбин (2868) (3340) (5845) (7938) (4269) (3310)
3.4378± 3.5113± 3.9906± 3.8597± 3.5287± 3.6983±
10* М 0.1049 0.0717 0.1069 0.2099" 0.3559 ' 0.1458
Йохимбин (2741) (3246) (9786) (7240) (3379) (4993)
3.4653± 3.5103± 3.8015± 3.9532± 3.6617± 3.5108±
10* М+ адреналин 0.0726 0.1214 0.1885'' 0.1646Т 0.2057" 0.1456
1 мкг/мл (2920) (3238) (6331) (8978) (4589) (3242)
Празозин 3.4593± 3.6925± 3.8635± 3.8365± 3.6991 ± 3.5010±
10* М 0.0307 0.1081 0.1136" 0.1963" 0.18021 0.1622
(2880) (4926) (7303) (6863) (5001) (3170)
Празозин 3.4348± 3.5455± 3.9671 ± 3.8556± 3.7168± 3.5303±
10' М+ адреналин 0.0644 0.1098 0.1645 * 0.1881" 0.1862 0.1371
1 мкг/мл (2722) (3512) (9271) (7172) (5210) (3391)
* Приведены значения М+ш для 1од|0 имп/мин (включение 3Н-тимидина), а в скобках — средние геометрические имп/мин (антилогарифм из М 1од10 имп/мин); число наблюдений во всех вариантах культур равно 8;
■ /^О,05; # - р <0,01; ## - /г <0,01 по сравнению с контролем по парному /-критерию Стьюдента; * - р <0,05 по сравнению с контролем по W-критерию суммы рангов Вилкоксона; т - то же по парному знаковому Т-критерию Вилкоксона; • - р<0,05 по отношению к культурам с одним адреналином.
тактов и иидукция апоптоза тимоцитов — энергозависимые процессы, происходящие с участием компонентов цитоскелета и зависящие от биосинтеза белка в тимоцитах.
Влияние адреналина и селективных антагонистов а- и а-адренорецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови
Шилов Ю.И., Гейн С.В.
Институт экологии и генетики микроорганизмов
УрОРАН
Пермь, Россия
В настоящее время общепринято представление о ведущей роли стимуляции Р- адренорецепторов в механизме иммунодепрессивного эффекта адреналина. Роль и а,-адренорецепторов изучена недостаточно.
Цель настоящей работы — изучить эффекты адреналина и селективных антагонистов а, - и аг-адреиорецепто-ров на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови здоровых людей на фитогемагглютинин (ФГА).
Лейкоциты периферической крови здоровых люден в возрасте от 18 до 43 лет культивировали с различными
