CC BY
15
Актуальт проблемы сучасноТ медицины
УДК:616.831-018-036.88:612.822:615.21
М1Т0ПР0ТЕКТИВН1 ТА НЕЙР0ПР0ТЕКТИВН1 ЕФЕКТИ П0Х1ДНИХ БЕН30Т1А30ЛУ EX VIVO
Кравченко К.О.
Днтропетровська державна медична академ1я
У роботi приведенi власн/ дан i пор1вняльних досл/джень м'попротективноУ та нейропротективноУ д'И пох/дних бензот/азолу, а також в/домих антагон/ст/в ЫМОА-рецептор/в рилузолу (основний препарат в л/куванн/ б/чного ам/отроф/чного склерозу) / амантадину (протипарк/нсон/чний препарат). Пох/дн/ бензот/азолу, рилузол / амантадин блокують МФТПчндуковане в/дкриття м/тохондр/альних пор нейрон/в в р/зн/й м/р/. На вид/лених збагачених фракциях нейрон/в в умовах моделювання глу-таматноУ "ексайтотоксичностГ in vitro додавання до /нкубащйноУ сум/ш/ препарат/в (10 мкм) запоб— гало кл'пиншй загибелзменшуючи розвиток як апоптозу, так / некрозу.
Ключов1 слова: м1тохондр1альна дисфункцт, глутаматна "ексайтотоксичнють", noxiflHi бензетазолу, рилузол, амантадин.
При захворюваны мозку деструктивного \ дегенеративного генезу вщбуваеться порушення дихального ланцюга м1тохондрш, енергетичного обмшу, ¡онного гомеостазу кл1тини з пщвищеним вмютом ¡ошв кальцш, розвиток глутаматноТ ек-сайтотоксичност1 та ушкоджувальноТ дй ытрозу-ючого й оксидативного стресу, ¡нщ1ац1я нейроа-поптозу \ загибел1 кттини. Активащя нейроапоп-тозу, на думку багатьох дослщнимв, е першо-причиною розвитку стшких порушень когштивно-мнестичних функцш ЦНС. 1снують переконлив1 докази того, що центральна роль в подальшому розвитку апоптозу \ некрозу належить м1тохонд-р1ям, зм1н1 проникност1 IX мембран в результат! формування специф1чного комплексу м1тохонд-р1альних пор та ¡нщ1ацй м1топтозу [1, 7].
Все вищевикладене е обфунтуванням для пошуку високоефективних церебропротективних препарате, здатних запоб1гати негативним про-цесам м1тохондр1альноТ дисфункцй в кл1тиш, тим самим надаючи церебропротективну дш. В да-ний час з метою корекцп м1тохондр1альноТ дис-функцп здшснюються спроби використовувати препарати енерготрошв — коензим О10, карнтн, вп"амши групи В, похщш янтарноТ кислоти \ т! [5]. Проте рацюнальы основи для Тх застосуван-ня погано розроблеш, часто недостатньо вико-ристовуються ефективш пщходи або переоцн нюються неефективш, лки застосовуються хаотично, без достатшх знань про Тх можливосп \ особливосп, без планування стратегй лкування з позицш доцшьносп.
Кр1м того, при м1тохондр1альнш дисфункцп, що вже сформувалася, \ «запуску» апоптотичних процеав ц1 препарати малоефективы, осктьки не здатш брати участь в регуляцй' тих тонких ланок енергетичного метабол1зму, ¡нтермед1атами яких вони е. Розглядаеться й ¡нший напрям ко-рекцЛ м1тохондр1альноТ дисфункцй — застосу-вання тюльних антиоксидант1в, що конкурують з БИ-групами цистеТнзалежноТ дтянки бтка внут-р1шньоТ мембрани м1тохондрш (АТФ/АДФ-антипортер) за активы форми кисню (АФК) \ пе-роксиштр1т та створюючих з останшм стшк1 ком-плекси. Це дозволяе запоб1гти вщкриттю м1тохо-ндр1альноТ пори в умовах оксидативного \ ытро-
зуючого стресу [9, 10]. Цкавим i заслуговуючим особливоТ уваги представляеться застосування препарат1в, що е л^андами нейропептщних ре-цептор1в i здатних регулювати апоптоз, експре-сш фактор1в транскрипцш, синтез фермент1в, що регенерують м1тохондр1альну ДНК, i ферме-нт1в, що катал1зують енергетичш реакцп [11, 12].
Мета нашого дослщження - дослщження ней-ропротективного ефекту похщних бензот1азолу в пор1вняны з вщомими антагонютами NMDA-рецептор1в рилузолом (основний препарат в лн куванш бокового амютроф1чного склерозу) [2] та амантадином (протипаркшеошчний препарат) [4] на видтених збагачених фракц1ях нейроыв в умовах моделювання глутаматноТ
,,ексайтотоксичностГ.
Матер/али та методи досл1дження
У дослщах використовувалися 61л1 щури ма-сою т1ла 200 - 250 г. Мозок вид1ляли i промива-ли 0,15 М KCl (4 °С), гомоген1зували в 10-ти кратному oö'eMi розчину для гомоген1зац1Т (250 мм сахароза, 20 мм трюамшометан, 1 мм ЕДТА, рн 7,4). Для видтення м1тохондр1й гомогенат центрифугували 7 хв при 700 g. Осад в1дкидали, супернатант центрифугували 15 хв при 11000 g (4 0С). Отриманий осад суспендувався в невеликому oö'eMi середовища без ЕДТА i збер1гався при 0 - +1 0С. Для проведения фармаколопчних досл1джень в ¡нкубац1йну cyMirn вносили суспен-з1ю м1тохондр1й (3 мг б1лка в npo6i). 1нкубацшна cyMirn: 120 мм KCl, 0,5 мм КН2Р04, 2 мм глутама-та, 1 мм малата, 20 мм трю-амшометана, рн 7,4. Перед дослщом до проб вносилися дослщжуваш речовини в концентрац1Т 10 мкм i ¡нкубувалися 2 хв.
МФТП - ¡ндуковане в1дкриття м1тохондр1аль-них пор: в ¡нкубац1йне середовище додавали 0,4 мм МФТП i через 5 хв 50 мкм CaCl2. М1топротек-тивна д1я вивчаеться по здатносл речовини, що вивчаеться, запоб1гати в1дкриттю м1тохондр1аль-них пор (МП). Вщкриття МП визначали при Л = 540 нм при 25 0С при пост1йному перем1шуванн1 на протяз1 25 хв [8].
Осктьки нервова тканина гетерогенна, класи-4Hi модел1 патолог1й мозку i 6ioxiMi4Hi п1дходи
* Робота виконана при nidmpuMiji МОЗ УкраГни (НДР «Пошук та вивчення нових noxiöHux бензот^азопу в якост/ потенц/й-них HeonioföHux аналгетитв та нейромед1аторних церебропротектор1в», № держ. реестрацп 0107U003072).
В1СНИК Украгнсъког' медичног' стоматологгчног академгг
дають лише усереднену картину вщповщ1 нер-вово1 тканини на кл1тинш стимули \ подальшу церебропротективну терашю. Розроблеш мето-ди отримання нервових кштин в ¡ндивщуальному сташ дозволяють отримати якюно нову \ достов1рну ¡нформацш про стан нервовоТ тканини в умовах моделювання патолопчних процеав. Експериментальна частина виконана на бтих щурах-самцях у вщ1 4 тижня \ масою 80-100 г. Видтення збагачених фракцш нейрошв \ нейроглп проводилося в два етапи. На першому етап1 мозкова тканина дезинтегру-валася з метою отримання кл1тинноТ суспензп, на другому - здшснювалося диференц1альне ультрацентрифугування в град1ент1 щтьносп сахарози \ фкколу. Для отримання нейрошв \ нейроглп щур1в декаштували, швидко витягува-ли мозок. Кору головного мозку вщокремлювали вщ бтоТ речовини, подр1бнювали \ переносили в розчин, що мютить 7,5% пол1вштп1ррол1дона (ПВП), 1% бичачий сироватковий альбумш (БСА) \ 10 мм СаС12. Отриману суспензш фтьтрували через три сита пщ незначним тис-ком для зменшення втрат нейрональних кттин. Пюля послщовного пропускания через сита кл1тинну суспензш напластовували на град1ент, що складаеться з 1 М \ 1,75 М сахарози. Цен-трифугування проводили при 60000д в рефрижераторнш центрифуз1 УАО-25. В результат! центрифугування отримували два шари \ щтьний осад. Верхнш шар був представлений залишками м1елшових оболонок, другий шар складався з гл1альних \ нейрональних кл1тин. Осад представлений ттами нейрошв вщповщав ступеню чистоти 90%. Надал1 проводили додаткове очищения другого шару шляхом другого фтьтрування \ ультрацентрифугування. Видтеш нейрональш кл1тини вщмивали вщ сахарози \ альбумша охолодженим ф1зюлопчним розчином [8]. Отриману таким чином кл1тинну суспензш роздтяли на серп: перша - ¡нтактна, друга - суспенз1я, в якш ¡ндукували розвиток
Вплив похЮних бензот/азолу на
глутаматноТ «ексайтотоксичносп» додаванням глутамшовоТ кислоти (100 mkM), третя - нейро-нальна суспенз1я, в якш ¡ндукували глутаматну «ексайтотоксичнють», з додаванням речовин, що вивчаються. Суспензи ¡нкубували на протяз1 1 години при температур! 370с. Для вивчення морфофункцюнального стану нейрошв готували мазки, як1 фарбували меттеновим сишм. Зоб-раження нервових кл1тин отримували на MiKpocKoni Axioskop (Zeiss, Ымеччина) i за допо-могою 8-6iTOBOi CCD-камери COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в комп'ютерну систему анал1зу зображень VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Н1меччина).
Об'ектами фармаколог1чних досл1джень були 3 орипнальних пох1дних 2-ам1но-6-бензот1азолу (найб1льш активы ¡з 7 у проведених ран1ше скрин1нгових дослщженнях нейропротекторноТ активност1 [3, 6]), синтезованих дослщно-впроваджувальною лаборатор1ею (кер1вник -к.х.н. A.C. Шаламай) ЗАТ НВЦ "Борщапвський ХФЗ", Украша. В якост1 препарат1в пор1вняння використовували таблетки боризолу (МНН рилу-зол, ЗАТ НВЦ "БХФЗ", Украша), як1 також вщно-сяться до ряду бензот1азолу, i таблетки неом1-дантану (МНН - амантадин, "Olfa", Латв1я). Ста-тистична обробка результат1в проводилась ¡з використанням пакету статистичних програм «Statistica 4.0» (Statistica Inc. USA).
Результати та i'x обговорення
Наш1 результати по дослщженню м1топротек-торних властивостей похщних бензот1азолу показали, що найкраще блокуе МФТП-1ндуковане в1дкриття м1тохондр1альних пор нейрошв речо-вина п1д шифром №1 - на 63% (р<0,05) (табл. 1). Похщне рилузолу №5 знижував цей показник на 44% (Р<0,05). Амдифлузол показав недостов1рн1 змши - зменшення на 17,5%. Препарати nopiB-няння рилузол i амантадин гальмували вщкрит-тя м1тохондр1й нейрошв на 32% (Р<0,05) i 50% (Р<0,05) в1дпов1дно.
Таблиця 1
в1дкриття MimoxoHdpianbHQ'i пори HeüpoHie (M ± m)
Експериментальы cepii A a % зниження
Контрольна (МФТП-шдуковане вщкриття м1тохондр1аль-них пор) 0,057 ± 0,0026
[ [ ^NH2 CF O^^^^^S Рилузол 3 0,039 ± 0,0005 -32*
J3:VNH2 Амдифлузол F2HCO s 0,047 ± 0,005 -17,5
f T \^NH2 №1 пох1дне рилузола 3 0,027 ± 0,0063 -63*
l iL Vnh2 F HCS^^^^^S №5 noxiflHe рилузола 2 0,032 ± 0,0049 -44*
Амантадин 0,029 ± 0,0019 -50*
Примака: * - змши достовфы по вщношенню до контролю (р<0,05)
Актуальт проблемы сучасно! медицины
У цш же суспезп визначали продукти окислювальноТ модифкацп бтка (ОМБ) по реакцп з дш1трофе-шлгадразшом за методом В. ИаШшеИ (1999). При взаемоди окислених амшокислотних залишш з 2,4-диштрофешлгидразином (2,4-ДНФГ) утворюються 2,4-диштрофешлгидразони - альдегщш (АФГ) \ кар-боксильш (КФГ) грушровки амшокислотних залишмв.
Наш1 дослщження показали, що пщ впливом нейротоксину МФТП в суспензп м1тохондрш нейрошв контрольно!' групи спостер1галося збтьшення практично у 2 рази ктькост1 нейротоксичних сполук АФГ та КФГ (табл. 2).
Таблиця2
_Вплив похЮних бензот/азолу на вм'ют продукт/в ОМБ в суспензП'м/тохондр/й нейрон1в (М ± т)
Експериментальы серЛ' АФГ % 3MiH КФГ % 3MiH
1нтактна 0,19 ± 0,0068 0,18 ± 0,007
Контрольна (МФТП-¡ндукована деструкц1я бт-кових молекул) 0,34 ±0,012 78,9* 0,36 ± 0,012 100*
Рилузол 0,23 ±0,0075 -33* 0,21 ± 0,0044 -42*
Амдифлузол - похщне рилу-зола 0,28 ±0,012 -18 0,24 ± 0,0051 -36*
№1 похщне рилузола 0,27 ±0,0068 -20* 0,20 ± 0,0051 -45*
№5 пох1дне рилузола 0,28 ±0,011 -18 0,22 ± 0,0081 -40*
Амантадин 0,29 ±0,010 -15 0,26 ± 0,0058 -38*
Примака: * - змши достовфы по вщношенню до контролю (р<0,05)
При додаванш до суспензп речовини пщ шифром №1 вмют токсичних сполук АФГ та КФГ зме-ншуеться на 20% (р<0,05) \ 45% (р<0,05) вщповн дно. Похщне бензот1азолу №5 знижуе ц1 показ-ники на 18% \ 40% (р<0,05) вщповщно. При вве-денш до суспензп рилузолу вмют токсичних продукте ОМБ за такими показниками, як АФГ та КФГ, знижуеться на 33% (р<0,05) та 42% (р<0,05) вщповщно. Введения амдифлузолу сприяло зниженню вмюту АФГ в суспензп' м1то-хондр1й нейрон1в на 18%, КФГ - на 36% (р<0,05). Амантадин зд1йснював також захист м1тохондр1й вщ нейротоксичноТ дИ'МФТП, знижуючи к1льк1сть продукт1в ОМБ - альдегщних та карбоксильних труп амшокислотних залишк1в: АФГ - на 15% та КФГ - на 38% (р<0,05) вщносно контролю.
Метою наступного фрагменту досл1дження е визначення нейропротективного ефекту пох1д-них бензот1азолу на вид1лених збагачених фрак-ц1ях нейрон1в в умовах моделювання глутамат-но1 ,,ексайтотоксичност1".
Результати, представлен! в таблиц! 3, демон-струють, що ¡нкубац1я нейрон1в у середовищ1 з концентрац1ею глутамату 100 мкМ призводила до активац1| як апоптозу, так \ некрозу, а також до зниження ктькост1 кл1тин, що вижили. Дода-вання до ¡нкубац1йно1 сумЫ пох1дних бензот1а-золу (10 мкМ) запоб1гало кл1тинн1й загибел1, зменшуючи розвиток як апоптозу, так \ некрозу. Введения в ¡нкубацшну сум1ш амантадину (10 мкМ) та рилузолу (10 мкМ) також запоб1гало кл1-тинн1й загибелк
Таблиця3
Пор1вняльна оц1нка нейропротективноУ di'i noxidHux бензот1азолу (n = 20) в умовах глутаматноУ ек-
ca0momoKCU4HOcmi in vitro (M ± m)
1нкубацшне середовище Кл1тини, що вижили, % Кл1тини з ознаками апоптозу, % Кл1тини з ознаками некрозу, %
1нтактна 85,3 ± 3,15 10,3 ± 2,53 4,4 ± 0,62
Глутамат (100 мкМ) (контроль) 60,5 ± 3,13** 23,7 ± 1,48** 16,8 ± 1,65**
Глутамат (100 мкМ) + Боризол (10 мкМ) 70,4 ± 2,32* 22,3 ± 1,16 8,3 ± 1,7*
Глутамат (100 мкМ) + Амдифлузол - noxi-дне рилузола (10 мкМ) 66,0± 3,33 20,0± 1,23 15,0± 1,44
Глутамат (100 мкМ) + №1 пох-е рилузола (10 мкМ) 80,2 ± 3,00* 12,8 ± 0,87* 7,3 ± 1,7*
Глутамат (100 мкМ) + №5 пох-е рилузола (10 мкМ) 78,0± 2,21* 15,2± 1,34 6,7± 0,5*
Глутамат (100 мкМ) + Амантадин (10 мкМ) 78,4 ± 2,11* 14,3 ± 1,15* 8,0 ± 1,0*
Примака: * - P<0,05 - BiporiflHi BiflMiHHOCTi по в1дношенню до Висновки
1. Дослщжено м1топротективн1 властивосп по-х1дних бензот1азолу, як1 блокують МФТП-¡ндуковане в1дкриття м1тохондр1альних пор нейрошв у pi3Hrn Mipi. 3
2. Визначено нейропротективний ефект noxifl-них бензот1азолу на вид1лених збагачених
показнигав контролю; ** - Р<0,05 - к ¡нтактним
фракц1ях нейрошв в умовах моделювання глутаматноТ ,,ексайтотоксичностГ in vitro. Додавання до ¡нкубацшноТ сум1ш1 речовин (10 мкМ) запоб1гало кп1тинн1й загибел1, зменшуючи розвиток як апоптозу, так i некрозу. За активнютю препарати можна розташува-ти наступним чином: сполука №1 > аманта-
BtCHMK Украгнськог' медичног' стоматологгчног академгг
1.
2.
4.
5.
6.
дин > сполука №5 > рилузол > амдифлузол.
Ëireparypa
БекетовА.И. Основы поиска церебропротекторов /
A.И. Бекетов, И.В. Полевик, A.A. Бекетов. - Симферополь, 2009. - 316 с.
Кравченко К.О. Новий погляд на вщомий лкарсь-кий 3aci6 - рилузол / К.О. Кравченко, B.I. Опришко,
B.Й. Мамчур // Лки. - №5-6. - 2007. - С. 3-8. Кравченко К.О. Порвняльна оцнка потенцшних церебропротекторв в ряду похщних бензот1азолу на модел1 гостроТ ¡шемп головного мозку / К.О. Кравченко // ГПки. - №5-6. - 2005. - С. 41-45. Мамчур В.И. Нейрофармакологический профиль действия глутаматергических препаратов / В.И. Мамчур, К.А. Кравченко, В.И. Опрышко // Журнал АМН Украины. - 2009. - Т. 15, №1. - С. 50-69. Митохондриальная дисфункция при церебральной патологии. Нейропротекция цереброкурином / Бе-леничев И.Ф., Колесник Ю.М., Павлов C.B. [и др.] // Ммнародний неврологмний журнал. - 2008. - №4 (20). - С. 20-26.
Пат. 80748 Украши, МПК А61К 31/425. 3aci6 i фа-рмацевтична композиця на ochobî 6-зам1щених пох1дних 2-амЫобензот1азолу та cnociö запо&ган-ня або лкування ептептичних сташв / Кравченко
трук В.Л., Шаламай А.С., Безпалько Л.В., Сова С.О.; ЗАТ НВЦ «БХФЗ» (Украша); заявл. 06.10.2005; опубл. 25.10.2007.
7. Рациональная нейропротекция / [И.Ф. Беленичев, В.И. Черний, Ю.М. Колесник и др.]. - Донецк, 2009. - 262 с.
8. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / [Под ред. М. И.Прохоровой]. - Л. : Изд-во Ленинградского ун-та, 1982. - 272 с.
9. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death / S. Elmore // Toxicol. Pathol. - 2007. - №35. -P.495-516.
10. Illegas J.L. Neurotransmitter aspects of neuron's apoptosis / J.L. Illegas // Apoptosis. Molecular Biology, Neurochemistry, Physiology. - Lancaster : Erwin&Lyonell, 2002. - P. 234-248.
11. Rapidly increased neuronal mitochondrial biogenesis after hypoxic-ischemic brain injury / W. Yin, A.P. Si-gnore, M. Iwai [et al.] // Stroke. - 2008. - №39. - P. 3057-3063.
12. Role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease / Castellani R., Hirai K., Aliev G. [et al.] // Journal of Neuroscience Research. - 2002. - Vol. 70, №3. - P. 357-360.
КО., Нужа Ю.О., Мамчур В.И., Опришко B.I., MaKi-
Реферат
МИТОПРОТЕКТОРНЫЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗОТИАЗОЛА EX VIVO Кравченко К.А.
Ключевые слова: митохондриальная дисфункция, глутаматная "эксайтотоксичность", производные бензотиазола, рилузол, амантадин.
В работе приведены собственные данные сравнительных исследований митопротекторного и ней-ропротекторного действия производных бензотиазола, а также известных антагонистов NMDA-рецепторов рилузола (основной препарат в лечении бокового амиотрофического склероза) и аманта-дина (противопаркинсонический препарат). Производные бензотиазола, рилузол и амантадин блокируют МФТП-индуцируемое открытие митохондриальных пор нейронов в разной мере. На выделенных обогащенных фракциях нейронов в условиях моделирования глутаматной "эксайтотоксичности" in vitro добавление к инкубационной смеси препаратов (10 мкм) предотвращало клеточную гибель, уменьшая развитие как апоптоза, так и некроза.
Summary
MITOPROTECTIVE AND NEUROPROTECTIVE ACTIONS OF BENZOTHYAZOLE DERIVATIVES EX VIVO Kravchenko K.O.
Keywords: mitochondrial dysfunction, glutamate "excitotoxycity'", benzothyazole derivatives, riluzole, amantadine.
The paper presents the data referring to the comparative studies of mitoprotective and neuroprotective action of benzothyazole derivatives, as well as the antagonists of riluzole NMDA-receptors (basic preparation in the therapy of lateral amyotrophic sclerosis) and amantadine (antiparcinsonic preparation). Benzothyazole derivatives, riluzole and amantadine block the MPTP-inductive opening of mitochondrial pores of neurons to a variable degree. On the selected enriched factions of neurons under the modeling of glutamate "excitotoxycity" in vitro the adding to incubation mixture of preparations (10 mkm) prevented cellular death, diminishing the development of both apoptosis and necrosis.
