CC BY
14
УДК 617.21: 617.735: 617.731: 617.7-005.4: 576.35
ВИКОРИСТАННЯ НЕЙРОМАРКЕР1В (Б1ЛОК S 100) ТА МЕТОДУ ПРОТОКОВО1 ЦИТОМЕТРП ДЛЯ ПОР1ВНЯЛЬНО1 ОЦ1НКИ ВПЛИВУ БЛОКАТОР1В NMDA-РЕЦЕПТОР1В НА НЕЙРОПРОЛ1ФЕРАТИВН1 ПРОЦЕСИ В С1ТК1ВЦ1 ТА ЗОРОВОМУ НЕРВ1 В УМОВАХ МОДЕЛЬНО1 1ШЕМП-РЕПЕРФУЗП ОКА
Метою дано! роботи було, використовуючи протоковий цитометричний аналiз та вимiри активаци нейромаркер!в, дослiдити змiни у процесах прол!фераци клiтин сiткiвки i зорового нерву в постреперфузшний перiод гостро! шемп ока та оцiнити ефективнiсть блокаторiв NMDA-рецепторiв при данiй патологи. Под!бне дослiдження переслiдуe цiль не тшьки впровадження нових методiв для докгашчного вивчення препаратiв нейротропного вектору фармаколопчно! активности а й дасть змогу оцшити можливiсть використання вже вщомих у неврологiчнiй практицi препаратiв за новим призначенням, а саме в якост нейроретинопротекторiв.
В ходi проведеного дослщження встановлено, що модельна 60 хв. iшемiя-реперфузiя ока в юнщ першо! доби спостереження характеризуеться вiрогiдним пiдвищенням вiдсоткового спiввiдношення клiтин у фазi синтезу ДНК (фаза S) до !х загально! кiлькостi у суспензп в середньому у 7,46 разу при паралельному зростаннi титру маркера нейрогаально! прол!ферацп бiлка S 100 в середньому в 32,6 разу (7 доба). Пор!вняльна ощнка впливу дослщжуваних блокаторiв NMDA-рецепторiв на нейропролiферативнi процеси в сiткiвцi та зоровому нервi в умовах модельно! шемп-реиерфузи ока iз використанням в якост нейромаркеру змiни титри бшка S 100 в комплекс! з методом протоково! цитометрп показала, що иайбшьш суттевий вплив на окреслеш процеси мае адемол. Цей препарат вiрогiдно переважае мемантин та розчин магшю сульфату за даними ензиматичного дослщження, спiвставляючись з останшм препаратом за цитологiчном показником прол!феративно! активностi (iнтенсифiкацiя фази S клопиного циклу). Для дослiдження величини та масштабу iшемiчного ураження сiткiвки та зорового нерву доцшьиим та обгрунтованим е використання запропонованих методiв та маркерiв, а дослiджуванi блокатори NMDA-рецепторiв е перспективними для клтачно! ощнки за новим призначенням в якост нейроретинопротекторiв.
Kjiiohobí слова: адемол, мемантин, машю сульфат, блокатори NMDA-peu,enTopÍB, нейроретинопротекщя.
Роботу е фрагментом НДР «ДоклШчна оцтка ефективностi потенцшних органопротекторiв» (№ держ. реестраци 0115U007126).
Останшми роками, поява на в!тчизняному фармацевтичному ринку велико! к!лькост! нових метабол!тотропних л!карських засоб!в !з цитопротекторним впливом на нейрони (цитикол!н, кортексин, корв!тин, т!отриазол!н, мексидол та !н. пох!дн! янтарно! кислоти) не знайшло оч!куваного в!ддзеркалення у зменшенн! показник!в !нвал!дизацп хворих з нейроретинопат!ею, доводячи тим самим, що питання створення еталонного препарату !з зазначеною д!ею ще далеке в!д свого остаточного вир!шення [3].
Зм!ни метабол!зму нейрон!в в умовах гостро! редукц!! кровоб!гу в головному мозку та с!тк!вц! ока схож! i в!дбуваються стад!йно, що дозволяе розробити !нтегрован! п!дходи до терап!! цереброваскулярно! патолог!! та ретинопат!й р!зного генезу [10]. Зокрема, глутаматна ексайтотоксичн!сть, яка опосередкована надм!рною активац!ею NMDA-рецепторiв, ! е ключовою ланкою у початку деструктивно-дегенеративних явищ при !шем!чних ураженнях мозку та с!тк!вки ока, являе собою потенц!йну м!шень щодо можливих розробок напрямк!в патогенетично! терапп цих стан!в.
У л!тератур! точаться чисельн! дискус!! стосовно можливо! ефективност! деяких пох!дних адамантану (наприклад мемантину), яким притаманна антагон!стична д!я на NMDA-рецептори при !шем!чних ураженнях с!тк!вки, однак опубл!кован! дан! не узагальнен! та м!стять суттев! протир!ччя [3]. До перспективних ретинопротектор!в з класу адамантанових пох!дних, теоретично можна в!днести модулятор пол!ам!нового сайту NMDA-рецептор!в 1-адамантилетилокси-3-морфол!но-2-пропанолу г!дрохлорид - адемол (рис. 1), якому притаманний широкий спектр фармаколог!чних властивостей.
Результати попередн!х досл!джень св!дчать про те, що адемол як ! мемантин, волод!е захисною д!ею на !шем!зований головний мозок, яка реал!зуеться за рахунок його модулювального впливу на активн!сть NMDA-рецепторiв [7]. При оц!нц! фармаколог!чних характеристик аспартат-активованих струм!в на !зольованих п!рам!дних нейронах г!покампу 15-денних б!лих щур!в л!н!! В!стар WAG\GS було встановлено, що адемол е антагон!стом/агон!стом пол!ам!нового сайту NMDA-рецептор!в [4]. За рахунок цього в!н гальмуе розвиток
нейродеструктивних процешв, опосередкованих глутаматною ексайтотоксичшстю. Бюлопчно-активш речовини i3 подiбним механiзмом ди мають нейротрофiчну складову та здатш пiдвищувати експресiю молекул пам'ятi CREB. Варто вщм^ити, що препарати i3 модулювальною дieю на полiамiновий сайт NMDA-рецепторiв не призводять до появи небажаних побiчних ефектiв з боку ЦНС, якi притаманнi повним блокаторам фенциклщинового сайту i проявляються у виглядi когнiтивно-мнестичних розладiв [6]. Наведет дат дають пiдстави сподiватись на можливе виявлення у адемолу захисно' ди на сiткiвку та зоровий нерв в умовах ix iшемiчного ураження.
Також перспективним у нейроретинотопротекци може бути використання iонiв магшю (магнiю сульфату) [2], якi блокують канали NMDA-рецепторiв потенцiал-залежнiм способом, що захищае головний мозок при його шеми.
Метою роботи було вивченняя активнiстi нейромаркерiв, дослiдити змiни у процесах пролiферацii клiтин сiткiвки i зорового нерву в постреперфузiйний перюд гостро! шеми ока, а також ощнити ефективнiсть блокаторiв NMDA-рецепторiв при данш патологи.
Матерiал та методи дослщження. Оцiнку ступеня активаци нейропролiферативниx процесiв в сiткiвцi та зоровому нервi на тлi модельно! шеми-реперфузи (1Р) ока у дослiджуваниx блокаторiв NMDA-рецепторiв проведено на 61 щуру-самцю лши Вiстар масою 160-190 г. Yd тварини знаходились у вiварii Вiнницького нацiонального медичного унiверситету (ВНМУ) iменi М.1. Пирогова на стандартному водно-харчовому рацюш та вiльному доступ до води та корму. Щд час роботи з лабораторними тваринами дотримувались методичних рекомендацiй Державного фармаколопчного центру Мiнiстерства охорони здоров'я (МОЗ) Укра'ни i вимог бiоетики зпдно до Нацiональниx «Загальних етичних принцитв експериментiв на тваринах» (2001), що вщповщають положенням «Свропейсько! конвенци про захист хребетних тварин, як використовуються для експериментальних та iншиx наукових цшей» [11]. Дотримання бiоетичниx норм засвщчено комiсieю з бiоетики ВНМУ iменi М.1. Пирогова (висновок № 2 вщ 05.02.2015). Дослiдження проводили в лаборатори кафедри фармакологи по доктшчному вивченню фармакологiчниx речовин (свщоцтво МОЗ Укра'ни про переатестацiю № 023/13 вщ 05.03.2013 р.), у клшно^агностичнш лаборатори кафедри бiоxiмii (свщоцтво МОЗ Укра'ни про переатестацiю №002/10 вщ 11 сiчня 2010 р.) та Науково-дослщнш лаборатори функцюнально' морфологи та генетики розвитку ВНМУ iменi М.1. Пирогова (свiдоцтво МОЗ Укра'ни про переатестацiю №003/10 вiд 11 ачня 2010 р.).
1Р ока моделювали шляхом накладання ретробульбарно' лпатури щурам термiном 1 год. Через 60 хв. шсля шеми, лпатури обережно розпускали i знiмали. Кровобп вiдновлювався самостiйно. Стан очного дна контролювали за допомогою прямо' офтальмоскоп^' (попередньо наносили на рогiвку гель) через покривне скло, що використовусться для виготовлення гiстологiчниx препаратiв [8].
В якосп предмету дослiджень у ролi модуляторiв активностi NMDA-рецепторiв ми обрали мемантин («Мема» Актавю-Украша, Укра'на) та розчин магнiю сульфату(«Магшя сульфат-Дарниця», Дарниця, Укра'на). Поряд iз цим проводили порiвняльну оцiнку ефективност промислового зразка ампульного, 1,0 % розчину адамантилетилокси-3-морфолшо-2-пропанолу гiдроxлориду («Адемол», Дарниця, Укра'на) для внутрiшньовенниx iн'eкцiй.
Дослщжуваш лiкарськi засоби вводили однократно кожш 24 год в лiкувальному режимi (термiн терапи 1 та 7 дiб) за умови першого застосування через 30 хв. шсля накладання ретробульбарно' лпатури в умовно-ефективних дозах, як згiдно даних лiтератури е достатшми для блокади NMDA-рецепторiв нейронiв головного мозку щурiв. Для мемантину умовно-ефективна доза складае 20 мг/кг внутршньошлунково (в/ш) [9], а для розчишв адамантану i магнiю сульфату вщповщно 2 мг/кг внутрiшньоочеревинно (в/о) та 250 мг/кг внутршньовенно (в/в) [2, 8]. Для в/ш введення мемантину через металiчний орогастральний зонд ^аметр 22 G), готували його суспензда iз твiном-80, розраховуючи концентращю таким чином, щоб и загальний об'ем, який уводився в/ш, становив 2 мл/кг. Розчин магшю сульфату вводили в/в у попередньо катетеризовану (катетер, ERG 22 G, Польща) стегнову вену за допомогою шфузоматно' системи упродовж перших 2 год з моменту накладання лпатури за методитою, розробленою О. А. Ходаювським [7]. Група контрольно' патологи (тварини з 1Р без цитопротекторно' терапи) отримувала 0,9 % розчин №С1 iз розрахунку 2 мл/кг в/в. Груш псевдооперованих щурiв накладали ретробульбарш лпатури без послщуючого затягування. Будь-яю травматичнi машпуляци та евтаназiю тварин шляхом декаштаци виконували в умовах пропофолового наркозу (60 мг/кг внутршньоочеревинно, «Fresenius Kabi», Австрiя).
Критерiями активаци пролiферативних ироцешв в сiткiвцi було, перш за все, Bipor^He зростання вiднoснo групи контрольно! патологи piB^ маркера активаци нейрогли! - титру бшка S 100 у сироватщ венозно! кpoвi на 7 день шсля моделювання патологи, який визначали методом твердофазного iмунoфepмeнтнoгo аналiзу з використанням набору ELISA KIT (Fujirebio Diagnostics Inc., Швещя) [1]. 1ншим кpитepieм цього процесу стало визначення особливостей клiтиннoгo циклу сiткiвки за допомогою методу протоково! цитометри, який дозволяе визначити вiдсoткoвe спiввiднoшeння кттин iз пpoлiфepативнoю активнiстю, що перебувають у фазi синтезу ДНК (фаза S) до вах клiтин у дослщному зразку. Iнтeнсифiкацiя пpoлiфepативнo! активносп, зокрема пoдiл нейрогли, що oкpiм гшерензими S 100 пiдтвepджуеться тдвищенням реплшацшно! активнoстi ДНК при цитометричному аналiзi - е закoнoмipнoю патоморфофункцюнальною вiдпoвiддю тканини на пошкодження кл^ин внаслiдoк некротичних або апоптотичних процешв [1, 8].
Для проведення цитометричних дослщжень через 7 дiб шсля реперфузи виконували eнуклeацiю. Очнi яблука щуpiв позбавляли залишок кон'юнктиви та м'язiв i за допомогою мiкpoхipуpгiчнoгo iнстpумeнтаpiю видалявся пepeднiй вiддiл ока i кришталик. Залишки очного яблука розправлялись таким чином, щоб до огляду було доступне очне дно. Парапапшярно за допомогою мiкpoхipуpгiчнoгo трепана дiамeтpoм 2 мм пoмiчались i видалялись дiлянки сiткiвки.
Вмiст ДНК в ядрах клггин сiткiвки щуpiв визначався методом протоково! цитометри [5]. Суспензи ядер з клiтин ситавки отримували за допомогою набopiв для дослщження ядерно! ДНК, вiдпoвiднo, CyStain DNA Step 1 (Partee, Шмеччина) до складу яких входить дiамiдинoфeнiлiндoл (DAPI). У пpoцeсi виготовлення нуклеарних суспензш використовувались oднopазoвi фiльтpи CellTrics 50 мкм (Partee, Нiмeччина).
Протоковий аналiз виконували на багатoфункцioнальнoму науково-дослщному проточному цитoмeтpi "Partee PAS" (Partee, Шмеччина). Для збудження флуоресценци DAPI застосовували ультpафioлeтoвe випpoмiнювання. Якiсть промаркованих ядерних суспeнзiй пepeвipяли за допомогою флуоресцентного мшроскопу ЛЮМАМ Р-8 (ЛОМО, СРСР) (ультрафюлетове збудження), цифрово! камери TSView (TUCSEN, Китай) з роздшьною здатнiстю матpицi 8 Мп. 1з кожного зразка нуклеарно! суспензи аналiзували 20 тис. обекпв, що мютять ДНК. Визначали наступнi показники: G0G1 - вщсоткове спiввiднoшeння ядер, як перебувають у фазi G0G1 кттинного циклу iз вмiстoм ДНК = 2c (с - content - «вмют») до !х загально! дослщно! кiлькoстi; S - вiдсoткoвe сшввщношення ядер, якi перебувають у фазi синтезу ДНК iз !! вмютом > 2c та < 4c до !х загально! дoслiднo!' кшькосп; G2 + M - вщсоткове спiввiднoшeння ядер, якi перебувають у фазi G2 + M кттинного циклу iз вмiстoм ДНК = 4c до !х загально! дослщно! кiлькoстi.
Кiлькiснi данi обробляли за допомогою програми статистично! обробки StatPlus 2009. Використовували параметричний кpитepiй t Ст'юдента у випадках нормального розподшу ваpiацiйнoгo ряду, непараметричний кpитepiй W Уайта - за його вщсутность Аналiз ДНК гiстoгpам виконували засобами програмного забезпечення проточного цитометру FloMax (Partec, Нiмeччина). Вiдмiннoстi вважали статистично значущими при p<0,05.
Результати дослщження та Тх обговорення. Вже наприкшщ першо! доби пoстpeпepфузiйнoгo пepioду експерименту, вiдмiчаеться зростання пpoлiфepативнo! активнoстi ретинальних кл^ин (у тому числi i за рахунок нейрогаальних). На користь пoдiбнoгo твердження вказуе вipoгiднe тдвищення в середньому у 7,46 разу вщсоткового спiввiднoшeння клiтин у фазi синтезу ДНК (фаза S) до !х загально! кiлькoстi у суспензи (табл. 1). Згщно лiтepатуpних даних [8] дoслiджуваний показник е вщповщдю сполучно! тканини на альтepацiйний процес. Тобто, iнтeнсифiкацiя фази S кттинного циклу характеризуе початок замiщeння зруйнованих кл^ин сiткiвки, зокрема нейрональних на сполучнотканинш (нeйpoглiальнi) елементи.
Оцiнка на 7 добу експерименту титру бшка S 100 в сироватщ кpoвi щуpiв групи контрольно! патологи показала, що модельна 1Р ока супроводжуеться вipoгiднoю ескалащею piвня дoслiджуванoгo ензиму вщносно псевдооперованих тварин в середньому в 32,6 разу (табл. 2). Отримаш даш, опосередковано вказують про значне некротичне ураження шаpiв сiткiвки та кттин зорового нерву, а також безпосередньо свщчать про замiщeння цих кттин нeйpoглiею за рахунок штенсивного пoдiлу астрогли. Таким чином, обидва дослщжуваних показники у piзнi перюди пoстpeпepфузiйнoгo пepioду спiввiднoсяться iз штенсившстю iшeмiчнoгo ураження.
Застосування мемантину терапевтично-ефективною дозою 20 мг/кг в/ш перешкоджало ескалаци piвня бiлка S 100 вщносно фонових значень (табл. 2). Так його piвeнь був нижчим пopiвнянo з титрами у тварин групи контрольно! патологи в середньому в 2,88 разу (р<0,05).
Цьому передували певш змши у вщсоткову сшввщношенш клiтин сiткiвки, що перебувають у рiзних фазах клiтинного циклу. Наприкшш першо! доби, пiсля однократного введення мемантину кiлькiсть клiтин у фазi 8 була вiрогiдно меншою порiвняно з контролем в середньому в 1,5 рази, що вказуе про низьку активащю пролiферативних процесiв в цш групi, а значить i меншу (порiвняно iз модельною патолопею) альтерацiю клiтин сiткiвки та зорового нерву (табл. 1). Дещо менше порiвняно iз мемантином (однак не вiрогiдне) пiдвищення титру бiлка 8 100 вщносно вихiдного рiвня шсля моделювання перехщно! шемп ока вiдмiчалось на тлi внутрiшньовенного застосування розчину сульфату магшю (табл. 2).
Таблиця 1
Вплив мемантину, розчинiв магшю сульфату та адемолу на актившсть пролiферативнот
фази 8 клiтин итк^вки щурiв пiсля iшемi'l'-реперфузi'l' ока на 24 год експерименту, М±б
Умови дослщу Вщносна к1льк1сть кл1тин (у %), що перебувають у фаз1 8
Псевдоопероваш щури, п=7 0,13±0,01
1Р + 0,9% р-н №С1, п=7, (контрольна патолопя) 0,97±0,15*
1Р + мемантин, 20 мг/кг в/ш, (п=7) 0,63±0,12*#
1Р + магшю сульфат, 250 мг/кг в/в, (п=7) 0,40±0,05*#л
1Р + адемол, 2 мг/кг в/в, (п=10) 0,38±0,05*#л
Примаки: 1Р - iшемiя-реперфузiя; в/ш - внутршньошлунково; в/о - внутрiшньоочеревинно; в/в - внутршньовенно; * - р<0,05 вiдносно псевдооперованих щурiв; # - р<0,05 вiдносно контрольно! патологiI; л - р<0,05 вiдносно мемантину.
Таблиця 2
Вплив мемантину, розчишв магнiю сульфату та адемолу на рiвень бiлка 8 100 у кровi щурiв
Досл1дн1 групи Р1вень б1лка 8 100 (нг/мл)
Псевдооперован1 щури, (фоновий р1вень), п=5 0,452±0,014
1Р + 0,9% р-н NaC1, (контрольна патолопя), п=5 14,748±0,829*
1Р + мемантин, 20 мг/кг в/ш, (п=5) 5,122±0,065*#
1Р + магн1ю сульфат, 250 мг/кг в/в, (п=5) 4,564±0,359*#
1Р + адемол, 2 мг/кг в/о, (п=10) 2,596±0,169*#л°
Примаки: 1Р - iшемiя-реперфузiя; в/ш - внутршньошлунково; в/о - внутршньоочеревинно; в/в - внутршньовенно. * - р<0,05 вiдносно псевдооперованих щурiв; # - р<0,05 вiдносно контрольно! патологiI; л - р<0,05 вiдносно мемантину; - р<0,05 вiдносно магнiю сульфату.
Його рiвень на 7 добу терапй був вiрогiдно нижчим за показники в груш контрольно! патологи в середньому у 3,23 рази, що е лише в середньому на 11,0 % нижчим за титри у щурiв з пероральним застосуванням амантадину (р>0,05). На противагу цьому, вже на тт першого введення розчину магнезп вiдмiчалось пригнiчення пролiферативноI активностi, яке було не тшьки вiрогiдно меншим нiж у груш контрольно! патологи ( в середньому у 2,43 рази), а й переважало у 1, 58 разу за своею ефектившстю терашю мемантином (р<0,05) (табл. 1). Таким чином, парантеральне застосування канального блокатора NMDA-рецепторiв, певним чином, переважае за нейроретиноцитопротекторною актившстю пероральний прийом блокатора фенциклщинового сайту аналогiчного рецепторно-iонофорного комплексу.
Найбшьш виразнi, достовiрно лiпшi за величиною цитопротекторш та антипролiферативнi властивостi, як у гострий постреканатзацшний перiод, так i на 7 добу експерименту, продемонстрував модулятор полiамiнового сайту NMDA-рецепторiв адемол. На завершальному етапi спостереження на тлi щоденного курсового застосування адемолу, титр нейромаркера бiлка 8 100 був вiрогiдно меншим не тшьки по вщношенню до тварин без фармакотерапп, а й вщносно щурiв, яким окремо вводили мемантин, або розчин магшю сульфату в середньому вщповщно у 5,68, 1,97 та 1,76 разу вщповщно (табл. 2).
Аналопчну за силою та вектором напрямку антипролiферативноI активностi продемонстрував адемол i на початку експерименту, що проявилось вже шсля його першого введення: кшьюсть кттин у фазi 8 клiтинного циклу було вiрогiдно меншою вiдносно контролю в середньому у 2,56, а вщносно мемантину майже удвiчi, спiвставляючись за цим показником iз розчином магшю сульфату (табл. 1).
Рис. 1 Хiмiчна структура адамантилетилокси-3-морфолшо-2-пропанолу пдрохлориду (адемол).
Таким чином, порiвняльна оцшка впливу дослщжуваних блокаторiв NMDA-рецепторiв на нейропролiферативнi процеси в сишвщ та зоровому нервi в умовах модельно! шеми-реперфузи ока. Яка використовуеться в якостi нейромаркера змши титру бiлка 8 100 в комплекс з методом протоково! цитометри показала, що найбшьш суттевий вплив на окреслеш процеси мае адемол, який вiрогiдно переважае мемантин та розчин магшю сульфату за ензиматичним тестом, спiвставляючись з останнiм препаратом за цитолопчном показником пролiферативно! активност визначеному за iнтенсифiкацiею фази 8 кл^инного циклу.
1. За спроможшстю зменшувати вiдсоткове спiввiдношення клггин у фазi синтезу ДНК (фаза S) до !х загально! кшькосп у кл^иннш суспензи сiткiвки через 24 год шсля 60 хв. шеми-реперфузи ока, дослщжуваш препарати можна розташувати у такiй послiдовностi: адемол > магнiю сульфат > мемантин.
2. За спроможшстю зменшувати титр маркеру, що вщображае актившсть нейрогли у постреперфузшний перiод на 7 добу ретинально! iшемi! лiнiйка дослiджуваних блокаторiв активностi NMDA-рецепторiв виглядае наступним чином: адемол > магшю сульфат > мемантин.
Перспективи подальших дослгджень. У подальшому перспективным е поглиблене вивчення Mexam3Mie нейроретинопротекторноi aктывностi адемолу, магшю сульфату та мемантыну з метою обгрунтування можлывостi впровадження 'ix у практичну офтальмологю.
1. Беленичев И. Ф. Рациональная нейропротекция / И. Ф. Беленичев, В. И. Черний, Ю. М. Колесник [и др.] // - Донецк: Издатель Заславский А.Ю., - 2009. - 262 с.
2. Багаурi О. В. Експериментальна оцшка впливу похщного 3,2'-сшро-шрроло-2-оксшдолу (сполука R-86) на динамку процеав нейродеструкци при гострш церебральнш шеми / О. В. Багаурi // Украшський вiсник психоневрологи. - 2014. - № 2 (79). - С. 22-25.
3. Сердюк В. М. Клшко-експериментальне обгрунтування нейропротекци в комплекс лкування хворих на первинну вщкритокутову глаукому: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня доктора мед. наук / В. М. Сердюк - Одеса., - 2015. -36 с.
4. Ходаювський О. А. П^вняльна оцшка впливу похщних адамантану сполук ЮК-1 та ЮК-4 на актившсть NMDA-рецепторiв / О. А. Ходаювський // Клшчна фармащя. - 2011. - Т. 15, № 4. - С. 60-63.
5. Ходаювський О. А. Дослщження впливу похщного адамантану адемолу на фрагментащю ДНК ядер нейрошв лобних часток кори за шемп-реперфузп головного мозку у щурiв / О. А. Ходаювський, I. Л. Черешнюк // Украшський вюник психоневрологи. - 2013. - Т. 21, вип. 1(74). - С. 26-28.
6. Ходаювський О.А. Характеристика протиiшемiчних та мнемотропних властивостей адемолу при модельному гострому порушенш мозкового кровообшу / О. А. Ходаювський // Фiзiологiчний журнал. - 2013, Т. 59, № 5. - С. 71-77.
7. Ходаювський О. А. Патогенетичне обгрунтування доцшьност використання нових похщних адамантану при експериментальнш терапи гостро! шемй головного мозку та мюкарда: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня доктора мед. наук / О. А. Ходаювський. - Одеса., - 2014. - 32 с.
8. Черешнюк I. Л. Застосування проточно! цитометри для скриншгово! оцшки вмюту ДНК в ядрах кйтин нейронально! Ытювки в щурiв / I. Л. Черешнюк // Вюник морфологи. - 2015. Т. 21, № 1 - С.222-226.
9. Belda X. Acute stress induced sensitization of the pituitary-adrenal response to heterotypic stressors: Independence of glucocorticoid release and activation of CRH1 receptors / X. Belda, N. Daviu, R. Nadal [et al.] // Hormones and Behavior. -2012. - Vol. 62, № 4. - Р. 515-524.
10. Osborne N. N. Topically applied betaxolol attenuates NMDA-induced toxicity to ganglion cells and the effects of ischemia to the retina / N. N. Osborne, L. DeSantis, J. H. Bae [et al.] // Exp. Eye Res. - 1999. - Vol. 69, № 3. - Р. 331-342.
11.Simone F. Biotechnology, animal health and animal welf are within the framework of European Unionlegislation / F. Simone; J. Serratosa // Rev. Sci. Tech. Оiе. - 2005. - Vol. 24, №.1 - Р. 89-99.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕЙРОМАРКЕРОВ (БЕЛОК S 100) И
МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ БЛОКАТОРОВ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ НА НЕЙРОПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В СЕТЧАТКЕ И ЗРИТЕЛЬНОМ НЕРВЕ ПРИ МОДЕЛЬНОЙ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГЛАЗА
Черешнюк И.Л., Повх В.Л., Загорий Г.В., Ходаковский А.А., Остра Е.А.
Целью данной работы является, используя проточный цитометрический анализ и измерение активности нейромаркеров, исследовать изменения в процессах пролиферации клеток сетчатки и зрительного нерва в постреперфузионный период острой ишемии глаза и оценить эффективность блокаторов NMDA-рецепторов при данной патологии. Подобное исследование преследует цель не только
USAGE OF NEUROMARKER (S100 PROTEIN) AND FLOW CYTOMETRY FOR COMPARATIVE ASSESSMENT OF NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS' EFFECT ON NEUROPROLIFERATIVE PROCESSES IN RETINA AND OPTIC NERVE IN CASE OF MODELLED OPHTHALMIC ISCHEMIA-REPERFUSION Chereshnyuk I.L., Povkh V.L., Zagorii G.V.,
Khodakovskyi A.A., Ostra E.A. The purpose of the study is to investigate the changes of the proliferative processes cells in retina and optic nerve during postreperfusional period of acute ocular ischemia using the flow cytometric analysis and measurement of neuromarker activity, and to assess the efficacy of NMDA receptor antagonists in case of mentioned pathology. Such investigation aims not only the implementation of the new
внедрение новых методов для доклинического изучения препаратов нейротропного вектора фармакологической активности, но и позволит оценить возможность использования уже известных в неврологической практике препаратов по новому назначению, а именно в качестве нейроретинопротекторов. В ходе проведенного исследования установлено, что модельная 60 мин. ишемия-реперфузия глаза в конце первых суток наблюдения характеризуется вероятным повышением процентного соотношения клеток в фазе синтеза ДНК (фаза 8) к их общему количеству в суспензии в среднем в 7,46 раза. При этом последовательно возрастает титр маркера нейроглиальной пролиферации (белок 8 100) в среднем в 32,6 раза (7 сутки). Сравнительная оценка влияния блокаторов NMDA-рецепторов на нейропролиферативные процессы в сетчатке и зрительном нерве при модельной ишемии-реперфузии глаза с использованием в качестве нейромаркера изменения титра белка 8 100, в комплексе с методом проточной цитометрии показала, что наиболее существенное влияние на указанные процессы имеет адемол. Данный препарат достоверно превосходит мемантин и раствор магния сульфата по данным энзиматического теста, сопоставляясь с последним за цитологическим показателем пролиферативной активности (интенсификация фазы 8 клеточного цикла). Для исследования величины и масштаба ишемического поражения сетчатки и зрительного нерва целесообразным и обоснованным является использование предложенных методов, а исследуемые блокаторы NMDA-рецепторов являются перспективными для клинической оценки по новому назначению в качестве нейроретинопротекторов.
Ключевые слова: адемол, мемантин, мания сульфат, блокаторы NMDA-рецепторов, нейроретинопротекция.
Стаття надшшла 2.03.2016 р.
methods for pre-clinical research of drugs with neurotropic vector of pharmacological activity, but allows assessment of the possibility for already known drugs used in neurological practice to be applied for the new indication, particularly as neuroretinoprotectors. In the course of research we determined the significant increase of percentage ratio of the cells in DNA synthetic phase (phase S) to their total amount in the tissue suspension for a median of 7,46 times in the modelled 60 minute ophthalmic ischemia-reperfusion at the end of the first day of observation. This is followed by the increase of neuroglial proliferation marker (S100 protein) titer for a median of 32,6 times (7th day). Comparative assessment of the NMDA receptor antagonists' effect on neuroproliferative processes in retina and optic nerve in case of modelled ophthalmic ischemia-reperfusion using the change of S100 protein titer as neuromarker, together with the flow cytometry method, showed that the most significant effect on the mentioned processes was expressed by ademol. The data of enzymatic test show that this drug has significant advantage of memantine and magnesium sulfate solution, and correlates with the last mentioned by the cytological index of proliferative activity (intensification of S-phase of cell cycle). It is reasonable and rational to use the proposed methods and markers for the assessment of the value and grade of ischemic injury retina and optic nerve, and the investigation of NMDA receptor antagonists is prospective for clinical assessment using the new indication - as neuroretinoprotectors.
Key words: ademol, memantine, magnesium sulfate, NMDA receptor antagonists, neuroretinoprotection.
Pe^roeHT 3anopoxe^ T.M.
