CC BY
28
УДК 616.831-005.1:616.8-009:616-08:577.112.6
Дейко Р.Д., Штриголь С.Ю., Лар'яновська Ю.Б., Горбач Т.В., Губна-Вакулик Г.1., ДевЯткна Н.М., Штриголь Д.В.
ХРОН1ЧНА БЛОКАДА ЦЕНТРАЛЬНИХ МУСКАРИНОВИХ РЕЦЕПТОР1В У ЩУР1В В1ДТВОРЮ6 ПЕРВИНН1 ПАТОГЕНЕТИЧН1 ЛАНКИ ХВОРОБИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Нацiональний фармацевтичний уыверситет, м. XapKiB Харкiвський нацiональний медичний уыверситет, м. XapKiB Укра'шська медична стоматолопчна aкaдемiя, м. Полтава Харшський нaцiонaльний унiвеpситет iм. В.Н. КаразЫа, м. Xapкiв
Хвороба Альцгеймера (ХА) - найрозповсюджен'ше нейродегенеративне захворювання, патогенез якого до кнця не в'домий. 1снуе припущення, що тривала блокада центральних М-хол1норецептор1в призводить до розвитку первинних ланок цього захворювання, проте прямих св'дчень бракуе. Мета досл'дження - встановити вплив тривало'У блокади центральних М-ХР на гстоструктуру, накопи-чення бета-ам'шоУдного блка (в-АБ) та нейромед'аторний профль головного мозку (ГМ) щур'в. У щур'т зi скополам'тчндукованою ХА досл'джували когн1тивн1 функцИ у тестах в1дкритого поля, екс-траполяц1йного вивльнення та умовного рефлексу пасивного уникнення, визначали артеро-венозну рiзницю за глюкозою у церебральному басейн'!, коеф^ент маси мозку. Вимiрювали рiвень ацетилхолну (АХ) та активнсть ацетилхолнестерази у синаптосомах нейронiв, у цлому ГМ -вм'ют АТФ, ГАМК, серотонну, глутамату та аспартату. Морфолог'чно досл'джували сенсомото-рну кору (СМК) великих пвкуль та СА1 i СА3 зони гпокампа на предмет нейродегенерацИ. У нейро-nrni визначали в-АБ. У щур'т зi скополам'тчндукованою ХА встановлено виразне порушення когшти-вних функ^й, енергетичного обмну ГМ (зменшення споживання глюкози та р'вню АТФ), патолог'ч-ну оверекспресю АХЕ та усх мед'атор'в о^м АХ, р'вень якого значно знижуеться. Морфологiчно виявлено нейродегенера^ю СМК та гпокампа, в-ам'шоУдну iнфiльтрацiю нейроплю та стiнок др'б-них церебральних артерiй. Таким чином, тривала блокада центральних М-Хр у щур'в призводить до розвитку первинних ланок ХА, що варто враховувати як в експериментальнiй фармакологи, так i при лкуванн пацiентiв холiнолiтичними засобами. Ключовi слова: хвороба Альцгеймера, патогенез, М-холЫоблокатори, експеримент
Виконано за планом наукоео-до^дно)' роботи НФаУ «Фармакологiчне вивчення бiологiчно активних речовин та лкарських засобiв» (№ державно)'реестрацп 0114U000956)
Хвороба Альцгеймера (ХА) - хрошчне нейродегенеративне захворювання, етюпатогенез якого остаточно не встановлений. Згщно з кла-сичними уявленнями, первинною ланкою ХА е протеТнопа™, що виявляеться накопиченням бляшок бета-амтоТдного бтка (р-АБ) та нейро-фiбрилярних клубов. Згодом розвиваються ней-родегенера^я (страждають насамперед холше-рпчш нейрони кори великих швкуль та ппокам-па), порушення центрально'' холшерпчноТ тран-смiсil та слабоумство [1]. У патогенезi ХА встановлено вагоме значення багатьох регулюваль-них систем ГМ (нейротрансм^ерних, нейротро-фiчних факторiв, бтш-шаперошв, цитоюыв то-що) [2]. Перш за все, привертае увагу холшерп-чна система мозку (ХСМ), ключова роль якоТ встановлена понад 40 рош тому [3]. Тодi з'ясувалося, що холшонегативш засоби (зокре-ма, нейролептики з виразними холшол^ичними властивостями) попршують когштивш функцп па^етчв, тодi як холшопозитивш (наприклад, ш-пбтор ацетилхолшестерази ^АХЕ) фiзостигмiн) покращують Т'х. Сьогодн це спостереження роз-винулося до рiвня «холшерпчноТ парадигми» ХА. Одыею зi складових ^еТ парадигми е ппоте-за про те, що негативна регуля^я ХСМ призводить до розвитку первинних ланок ХА, зокрема, нейродегенерацп та амтоТдозу [4,5,6]. Ця ппо-теза заснована на низц експериментальних та
Вступ
клшмних даних, отриманих при вивченш холшо-позитивних засобiв ^АХЕ, орто- та алостеричних агошслв, позитивних алостеричних модуляторiв мускаринових (М-ХР) та шкотинових холшоре-цепторiв), як зменшують нейродегенерацш та амiлоТдоз за ХА. Але прямих свщчень того, що блокада ХСМ призводить до розвитку первинних ланок ХА, наразi немае. Постае питання про причинно-наслiдковi зв'язки: накопичення р-АБ та нейрофiбрилярних клубов порушуе ХСМ чи первинна блокада М-ХР здатна викликати ц структуры порушення нейрошв? Для вiдповiдi необхщно безпосередньо дослiдити стан ГМ на ™ блокади М-ХР на предмет розвитку первинних патогенетичних ланок ХА. Вщомо, що такими е не лише нейродегенера^я та вщкладення амтоТду. Одним iз патершв патогенезу ХА е так званий «нейротрансм^терний зсув» - змiна вмн сту низки нейромедiаторiв ГМ при ХА. Вш вини-кае унаслщок того, що ХСМ е функцюнально взаемопов'язаною iз багатьма iншими нейротра-нсмiттерними системами, а холiнергiчнi нейрони експресують рецептори, лiгандами яких е гамма-амiномасляна кислота (ГАМК), серотонш, глута-мiн тощо [7,8]. Тому метою дослщження стало з'ясування впливу хрошчноТ блокади ХСМ на стан ГМ щурiв, а саме його пстолопчну структуру, накопичення р-АБ, змши енергетичного обмн ну та основних нейротрансм^ерних систем, що залучаються до патогенезу ХА.
Матерiали та методи дослщження
В експеримент^ як одну з моделей когштив-ного дефiциту у щурiв, що розвиваеться при ХА, використовують хронiчну блокаду центральних М-ХР скополамшом [9,10]. Скополамiн е опти-мальним для моделювання ХА блокатором М-ХР, оскiльки добре проникае у ГМ та блокуе ус види М-ХР, роль кожного з яких у формуванн нейродегенерацп та протеТнопатп остаточно не встановлено [11].
Моделювання хвороби Альцгеймера. Згщно з методичними рекоменда^ями [10], для вщтво-рення когштивного дефiциту щурам вiком 1-1,5 року щоденно протягом 20 дыв внутршньооче-ревинно (в/о) вводять скополамш у дозi 1 мг/кг у виглядi водного розчину 1 раз на день. Осктьки зазвичай холшонегативний вплив (наприклад, лiкування психiчних розладiв пацiентiв iз ХА нейролептиками з холшол^ичними властивос-тями) е тривалим, у нашому дослiдженнi перiод введення скополамшу подовжено до 27 дыв.
Використано 14 бiлих рандомбредних щурiв-самцiв вiком до 1,5 року, отриманих iз вiварiю Центрально' науково-дослщноТ лабораторп НФаУ, яких утримували у стандартних умовах вiварiю за природного св^лового режиму «день-жч». Дослщження виконано вщповщно до поло-жень Директиви 2010/63/Еи европейського Парламенту i Ради еС «Про охорону тварин, вико-ристовуваних з науковою метою» (2010). Щурiв розподiляли на групи штактного контролю (1К) та модельноТ патологи (МП) по 7 у кожнш. Твари-нам групи МП протягом 27 джв уводили скополамш як описано вище, щурам групи 1К - ешва-лентний об'ем iзотонiчного розчину №С1 в/о. З 28 по 38 день уа тварини отримували iзотонiч-ний розчин NaCl (вiдмивочний перюд). Надалi дослiджували стан психiчних функцш у тестах умовного рефлексу пасивного уникнення (УРПУ, на 1 i 10 день пiсля вiдмивочного перiоду), вщк-ритого поля (ВП, на 1 день) та екстраполяцшно-го вивтьнення (ЕВ, на 1 день) [10,12]. У тест УРПУ визначали латентний час входу до затем-неного вщаку приладу та кiлькiсть тварин, що досягли критерш навченостi (перебування в осв^леному вiддiлi протягом щонайменше 180 с).
На 10 добу пюля останньоТ перевiрки УРПУ у цiльнiй артерiальнiй (загальна сонна артерiя) та венознш (каротидний синус твердо'' мозковоТ оболонки Гм) кровi, яку брали жд тiопенталовим наркозом, глюкозооксидазним методом вимiрю-вали рiвень глюкози та розраховували артерю-венозну рiзницю (АВР, маркер споживання глюкози ГМ). Тварин декажтували, виймали та зва-жували ГМ. Розраховували коефiцiент маси моз-ку (КММ) у % до маси тта тварини. Надалi ГМ роздтяли на пiвкулi. Лiвi пiвкулi частини щурiв консервували 96% розчином етанолу, шшоТ частини - 10% розчином формалшу для пстолопч-
них дослiджень. npaBi пiвкулi заморожували рщ-ким азотом для бiохiмiчних дослiджень.
Бюх1'м1'чн1' досл'дження ГМ. У синаптосомах холшерпчних нейронiв, видiлених за методом Хаеша [13], спектрофотометрично визначали вмют ацетилхолiну (АХ) та активнють ацетилхо-лiнестерази (АХЕ) [14,15]. У тканиж цiлого мозку вимiрювали вмют аденозинтрифосфорно'1 кис-лоти (АТФ) методом [16], серотоншу [17], ГАМК, глутамшово'Г та аспарагшово'Г кислот [18,19].
Пстолог1чн1 досл'дження ГМ. Дослщжували стан сенсомоторно'Г кори (СМК) великих пiвкуль та вентрального ппокампа. На фiксованому спиртом ГМ робили фронтальний надрiз на рiвнi переднiх кра'Гв скронево'Г долi (для дослiдження СМК) та на рiвнi медiального скроневого вiддiлу пiвкулi (для дослiдження гiпокампа). Отриманi зразки заливали в парафш за стандартною методикою, зрiзи фарбували гематоксилш-еозином та тiонiном за методом Нюсля [20]. Здiйснювали морфометричний аналiз. На забарвлених тюж-ном зрiзах у V шарi СМК та жрамщному шарi СА1 та СА3 зон вентрального ппокампа визначали ктькють нормохромних (рiвномiрний розподiл базофтьно'Г речовини у нейроплазмО, ппохром-них (зниження ктькосл базофтьно'Г речовини), гiперхромних зi зморщуванням та гiперхромних без зморщування нейрожв, а також клiтин iз вог-нищевим хроматолiзом (дiлянки просв^лення нормально!' базофтьно'Г речовини). Аналiзували у полi зору мiкроскопа (окуляр 10, об'ектив 40) у 4-5 повтореннях iз перерахунком на 100 кл^ин. На виконаних за допомогою програми Toupcam Granum фотознiмках (окуляр 10, об'ектив 20) забарвлених гематоксилш-еозином зрiзiв визначали площу тт нейрошв V шару СМК та жрамщно-го шару СА1 та СА3 зон гiпокампа (мкм2).
Консервоваж 10% розчином формалiну жв-^i заливали в парафiн та робили поперечж зрiзи на рiвнi тм'яно'Г долi ГМ товщиною 5-6 мкм. Фарбували специфiчним для р-АБ барвником -конго червоним [21]. Препарати фотографували за допомогою камери Granum ДСМ 310.
Статистична обробка результат/е. Ре-зультати обробляли статистично за допомогою програм Statistica 8.0. Використовували однофа-кторний дисперсшний аналiз (one-way ANOVA) або кутове перетворення Фшера ф при ураху-ванж результатiв в альтернативнiй формi. Вщ-мiнностi вважали статистично значущими при p<0,05.
Результати та ïx обговорення
Результати тесту ВП наведено у табл. 1. За умов тесту у щурiв зi скополамiн-iндукованою ХА орiентовно-дослiдницька активнiсть зменшуеть-ся у 2,1 разу (р<0,05 проти 1К). Оскiльки орiенто-вно-дослщницька активнiсть е одним iз проявiв жзнавально'Г дiяльностi тварини, ïï зменшення свiдчить про погiршення останньо'Г за умов хро-нiчного введення скополамшу.
Таблиця 1
Показники тесту вiдкритого поля iнтактних щу^в та тварин зi скополамiн-iндукованою моделлю хвороби Альцгеймера
Показники (за 3 хв) 1нтактний контроль (п=7) Модельна патологiя (п=7)
Рухова активнють (квадрати) 15,29±3,68 14,29±3,18
Орiентовно-дослiдницька активнють:
- Стшки 5,71±1,17 2,43±0,57*
- Отвори 12,43±1,57 6,29±1,39*
Сума показниюв 18,00±2,08 8,71±1,76*
Емоцшш реакцп:
- Фекальнi болюси 1,00±0,69 0,86±0,86
- Уринацп 0,71±0,29 1,14±0,40
- Грумiнг 4,14±0,67 2,29±0,78
Сума показниюв 5,86±0,60 4,29±0,97
Сума усiх показникiв тесту 39,15±5,83 27,29±4,50 (- 30,3)
Примтка. У дужках - % змн до групи контролю; * - вiдмiнностi статистично значущ (р<0,05) проти нтактного контролю.
Прикметно, що зниження орiентовно-дослщницькоТ активносп вщбуваеться на ™ збе-реженоТ руховоТ функци. Таким чином, хроычне введення скополамшу пригнiчуе у тварин здебть-шого когнiтивний, проте не моторний компонент активносп ГМ, що характерно для ХА.
Як видно з табл. 2, ус тварини обох дослн джуваних груп виконують завдання ЕВ, шрнаючи пiд край цилiндру приладу впродовж 180 с. Проте, у щурiв групи КП час вивтьнення статистично значущо зростае на 38% порiвняно з показни-ком 1К (р<0,05). Це свщчить про порушення ада-птивноТ поведшки у ситуацп гострого стресу, що вказуе на попршення штегральноТ розсудковоТ дiяльностi [22]. Таким чином, тривале введення скополамшу щурам формуе виразний когштив-ний дефщит, що виявляеться порушенням Тх ш-знавальноТ та штегральноТ розсудковоТ дiяльно-стi.
У тварин групи 1К електробольове подраз-нення формуе стiйкий УРПУ, що виявляеться зростанням латентного часу входу до затемне-ного вщаку як через 24 год, так i через 10 дiб ш-сля навчання (табл. 3). У щурiв зi скополамш-iндукованою моделлю ХА значно попршена фу-нкцiя запам'ятовування, осктьки латентний час входу до затемненого вщаку зменшуеться як на 1 добу (у 2,4 разу, р<0,05), так i на 10 добу (у 2,6 разу, р<0,05) порiвняно з показником групи 1К. До того ж iз табл. 3 видно, що ктькють тварин групи МП зi сформованим УРПУ значно нижча за вiдповiдний показник групи 1К (14,3% проти 71,4%). Збер^аючись протягом тривалого часу (10 дiб вiдмивочного перiоду та 10 дыв - перiод тестування), таке виразне попршення мнестич-них функцш у щурiв зi скополамiн-iндукованою ХА може свщчити про формування не лише фу-нкцiональних, а й оргашчних порушень ГМ.
Таблиця 2
Показники тесту екстраполя^йного вивльнення нтактних щурiв та тварин з скополам'т-Ыдукованою моделлю хвороби Альцгеймера
Показники (за 3 хв) 1нтактний контроль (п=7) Модельна патологiя (п=7)
Час екстраполяцшного вивiльнення, с 37,17±8,51 51,29±3,12*
% тварин, що виконали завдання 100% 100%
Примiтка. * - вiдмiнностi статистично значущ (р<0,05) проти iнтактного контролю.
Таблиця 3
Показники тесту умовного рефлексу пасивного уникнення iнтактних щу^в та тварин зi скополамiн-iндукованою моделлю хвороби Альцгеймера
Група,п Латентний час входу в затемнений вщЫк приладу, с (% тварин, що досягли критерто навченостi УРПУ)
Вихiдний Через 24 год Через 10 дiб
1нтактний контроль (п=7) 18,71±3,52 167,86±11,49* (71,4%) 99,86±17,06* (14,3%)
Контрольна патолопя (скополамш) (п=7) 20,29±5,54 70,29±16,44* (0,0%*) 38,86±11,62* (0,0%)
Примiтка. У дужках - % тварин з'1 сформованим УРПУ; в'дм'п лем, * - з вихiдним показником всерединi групи.
Когштивш порушення, виявлен у тестах ВП, ЕВ та УРПУ, супроводжуються виразними змн нами енергетичного обмшу ГМ, а саме збть-шенням АВР за глюкозою та зменшенням рiвня АТФ (рис. 1).
На ™ зростання АВР за глюкозою (у 1,5 разу) тенденцш до збтьшення на 16,7% у груш КП виявляе КММ (рис. 1). Ктькють АТФ у тварин цн
V статистично значущ (р<0,05): # - з iнтактним контро-
еТ групи зменшуеться статистично значущо у 1,5 разу порiвняно з показником 1К (р<0,05). Порушення метаболiзму глюкози й фолдингу бтка при ХА взаемопов'язан та корелюють iз виразш-стю когштивного дефщиту [23].
Модельна патолопя характеризуеться також виразними змшами медiаторного профтю ГМ (рис. 2-4). Зокрема, у синаптосомах холшерпч-
них нейрошв ГМ щурiв i3 моделлю ХА зростае активнiсть АХЕ (на 30,6%, р<0,05 проти 1К) та зменшуеться кiлькiсть АХ (на 29,0%, р<0,05 проти 1К). Як видно i3 рис. 3 та 4, у цтому ГМ тварин 3i скополамiн-iндукованою ХА зростають рiвнi ГАМК, глутамату, аспартату та серотоншу. Вмют
гальмiвного медiатора ГАМК збтьшуеться ста-тистично значущо на 55%, а збуджувальних (глутамату та аспартату) - на 64,8% та 61,5% Bi-дповщно (р<0,05 проти 1К); серотонiну - на 69,1% (р<0,05 проти 1К).
ж Шч
1,5 »¿о^ ¿¿УЛ
Р1 ) 1111
0
КММ, % АВР глюкози, АТФ, ммоль/г
ммоль/л ткнини
■ Ттттактгтий контроль, п=7 □ Модельна патолопя, п=7
Рисунок 1. Коеф^ент маси мозку, apmepio-венозна pi3HUця вмсту глюкози у Kpoei церебрального басейну та вмст АТФ у головному мозку iнтактних щу^в i за скополамнчндуковано'/'моделi хвороби Альцгеймера.
Примтка. * - вiдмiнностi статистично значущi (p<0,05) проти нтактного контролю.
АХ, мкг/г тканини АХЕ, мкмоль/г бшка/год ■ 1нтактний контроль, п=7 □ Модельна патолопя, п=7
Рисунок 2. Вмст ацетилхолну та активнсть ацетилхолiнестерази у синаптосомах холiнергiчних нейронiв головного мозку нтактних щу^в та за скополамнчндуковано'/' моделi хвороби Альцгеймера.
Примтка. * - вiдмiнностi статистично значущi (p<0,05) проти нтактного контролю.
Рисунок 3. Вм/'ст гамма-ам/'номасляноГ кислоти, глутамату та аспартату у цтому головному мозку нтактних щур'в та за
скополамнчндуковано'/'моделi хвороби Альцгеймера.
Примтка. * - вiдмiнностi статистично значущi (p<0,05) проти нтактного контролю.
Рисунок 4. Вмют серотонiну у цлому головному мозку iнтактних щу^в та за скополамтчндукованоТ моделi хвороби Альцгеймера.
Примтка. * -вiдмiнносmi статистично значущ (р<0,05) проти нтактного контролю.
Отримаш дан дозволяють стверджувати, що скополамшчндукована ХА призводить не лише до порушень психiчних функцш тварин, але й до виразних змш енергетичного метаболiзму ГМ (зростання кiлькостi неспожитоТ глюкози та зме-ншення вмiсту основноТ макроерпчно'Т сполуки -АТФ), дизрегуляцп холiнергiчноТ та функцюна-льно пов'язаних iз нею ГАМК-, глутамат- та се-ротонiнергiчноТ нейротрансмiттерних систем.
За результатами морфометричного аналiзу встановлено, що хрошчна блокада М-ХР скопо-ламшом призводить до виразноТ дегенерацiТ нейрошв V шару СМК та трамщного шару СА1 i СА3 зон ппокампа. Як видно з табл.4, у щурiв групи КП статистично значущо зменшуеться кн лькiсть функцюнально повноцiнних (нормохром-них) нейронiв та зростае кшьмсть дегенерованих (гiпо- та пперхромних). Нейродегенерацiя вияв-ляеться також статистично значущим зменшен-ням площi тiл нейронiв: на 10,1% у СМК, на 19,% та 21,2% у шрамщному шарi СА1 i СА3 зон ппо-кампа вщповщно (р<0,05 вiдносно 1К).
На мiкропрепаратах ГМ щурiв групи 1К речо-
вина мозку мiстить уа облiгатнi шари нейронiв, якi варшють за розмiром, об'емом нейроплазми, щтьнютю розташування. Контур тiл нейронiв чн ткий та рiвний. Розташоване у центрi ядро окру-глоТ форми, хроматин неконденсований. Глюци-ти розташоваш як поодиноко, так i групами по 23. lнодi перинейронально зус^чаються ^тини-сателiти. Цитоплазма нейрошв рiвномiрно запо-внена тигроТдом, бтьшють клiтин V шару нор-мохромна (рис. 5).
Спостер^аеться типова морфолопчна структура пiрамiдного шару СА1 i СА3 зон вентрального ппокампа (рис. 6), що вщповщае даним л^ера-тури [24]. Як видно iз рис. 6, у щурiв групи 1К зона СА1 утворена середнiми за розмiром, компактно розташованими, рядами нейронiв. Ядра кттин округлi, ядерце чiтке, форма перикарюну - на-ближена до округлоТ. Зона гiпокампа СА3 (рис. 7) утворена крупшшими, але менш щтьно розташованими рядами нейронiв пол^онально'Т (набли-женоТ до трикутноТ) форми, що мютять ядро з ядерцем та мають чiткi апiкальнi дендрити. Тигро-Тд рiвномiрно розподiлений у нейроплазмк
Таблиця 4
Морфомеmричнi показники нейронiв V шару сенсомоторноТкори переднього мозку та пiрамiдного шару СА1 i СА3 зон гпока-
мпа Ытактних щур'в та щур'в з моделлю скополам/'нч'ндуковано'Тхвороби Альцгеймера
Група тварин, п Показники Репон головного мозку
Сенсомоторна кора Гiпокамп
СА1 СА3
1нтактний контроль, п=7 Нормохромш нейрони, % 51,96±2,01 96,52±0,21 97,79±0,81
Ппохромш нейрони,% 4,66±0,50 0,68±0,09 0,33±0,17
З вогнищевим хроматстзом, % 19,59±0,75 1,27±0,11 1,18±0,22
Пперхромш зi зморщуванням, % 4,98±0,77 0,55±0,11 0,18±0,18
Пперхромш без зморщування, % 18,79±1,79 0,98±0,11 0,51±0,31
Площа тт нейронiв, мкм2 120,03±0,73 112,17±0,90 130,9±0,79
Контрольна патоло-пя, п=7 Нормохромш нейрони, % 30,33±1,30* 57,76±0,29* 67,75±0,95*
Ппохромш нейрони, % 13,83±0,33* 7,33±0,34* 6,07±0,80*
З вогнищевим хроматстзом, % 23,75±1,40* 10,09±0,29* 8,47±0,44*
Пперхромш зi зморщуванням, % 17,41±1,51* 11,31±0,13* 7,98±0,12*
Пперхромш без зморщування, % 14,81 ±3,51 13,47±0,13* 9,73±0,27*
Площа тт нейрошв, мкм2 107,96±1,71* 90,0±1,79* 103,13±2,14*
Примiтка. * - вiдмiнностi статистично значущ (р<0,05) проти iнтактного контролю.
Рисунок 5. Сенсомоторна кора переднього мозку щура групи ¡нтактного контролю: а - типова арх1тектонжа шар/в (х 100), б - нормальний стан кл1тин нейроплю та глп (х 250), в - нормохромн нейрони V шару (х 400); а, б - гематоксил'т-еозин, в - т1он1н за Нсслем.
Рисунок 6. Зона СА1 вентрального гшокампа щура групи ¡нтактного контролю: а - компактно розмщен1 ряди нейрон1в округлоТ форми (х 200),
б - нормальний стан нейрон1в (х 250), в - нормальний стан тигроТду в нейроплазм/' (х 400) ); а, б - гематоксилн-еозин, в - т1он1н за Н'тсслем.
Рисунок 7. Зона СА3 вентрального гпокампа щура групи ¡нтактного контролю: а - пухкше розташування нейрон1в пол1гональноТ' форми (х 200), б - незмнений стан тл та апкальних дендрит1в нейрон1в (х 400), в - нормальний стан тигроТду в нейроплазм/' (х 400); а, б - гематоксилн-еозин, в - тонн за Нюслем.
На тл скополамш-шдуковано''' ХА у ГМ зрос-тае кiлькiсть «штин-тшей», випадкiв нейроно-фаги' (кпiтини глiï руйнують нейрон), збтьшуеть-ся caTeniT03 клтин. Мае мiсце виразний перика-птярний та перицелюлярний набряк мозково!' тканини (рис. 8 а-г), збтьшення кшькосп гiпо- та гiперхромних кпiтин, нейрошв i3 вогнищевим хроматопiзом (рис. 8, ^-д, табл. 4). Пiкнотичнi п-перхромнi кпiтини (3i зморщуванням) утворюють конгломерати. Кiпькiсть гiпохромних нейронiв у СМК ГМ щурiв 3i скополамшчндукованою ХА зростае статистично значущо у 2,97 разу, пперхромних - у 3,5 разу, а кл^ин iз вогнищевим хроматолiзом - на 21,2% (р<0,05 проти |К). За даними л^ератури [25,26], такi змши вказують на необоротну нейродегенерацiю.
Хрошчне введення скопопамiну призводить
до дезоргашзацп рядiв нейронiв у пiрамiдному шарi СА1 та СА3 зон вентрального ппокампа, а мюцями - до значного зменшення щiпьностi !'х розташування (рис. 9).
Мiсцями спостерiгаеться часткове спусто-шення нейрональних рядiв («випадання» нейро-нiв). Пiрамiднi нейрони зазнають дегенератив-них змiн рiзного ступеню - вiд незначного пому-тншня та змiни оптично!' щiпьностi нейроплазми до повно!' втрати ядерця, гомогенност хроматину, пiзису або пкнозу ядра. Тiпа деяких кпiтин втрачають чiткiсть контурiв, деформуються. Аш-кальш дендрити багатьох пiрамiдниx нейронiв СА3 зони вентрального гiпокампа мають «ампу-тований» вигляд
Рисунок 8. Сенсомоторна кора переднього мозку щура з моделлю скополамШчндуковано)'хвороби Альцгеймера:
а - перикаптярний та перицелюлярний набряк, б - «кл1тини-т1н1» ( 1) та нейронофагия (2), в, г - виразний сател1тоз кл1тин, Г1, Г2 - г1похромн1 нейрони, д - г1перхромн1 клтини; а-г - гематоксилн-еозин, Г,д - тонн за Нсслем; а - х 200, в-г - х 250, б, Г; д - х 400.
Рисунок 9. Зона СА1 (а-в) та СА3 (г-д) вентрального г'токампа щура 3Í скополам'тчндукованою хворобою Альцгеймера: а, г -дезорганiзацiя та зменшення щiльностi розташування нейронiв у рядах, в, f - «випадання» нейронiв, в, д - дистрофiчно-деструктивнi змни нейронiв; гематоксилн-еозин, а, б, г - х 200, f - х 250, д - х 4О0.
Рисунок 10. Зона СА1 (а-б) та СА3 (в-г) вентрального гпокампа щура з моделлю хвороби Альцгеймера: а, в - гiпохромнi нейрони, б,г - гiперхромнi нейрони; тонн за Нiсслем, х 400.
На зрiзах, пофарбованих тiонiном за методикою Нюсля, встановлено виразнi полiморфнi змши хроматофтьно'Т речовини нейронiв шрамн дного шару СА1 та СА3 зон вентрального ппока-мпа (рис. 10).
Ктькють нормохромних нейронiв у СА1 та СА3 зонах вентрального ппокампа у щурiв iз мо-деллю ХА зменшуеться вiдповiдно у 1,67 та 1,44 разу порiвняно з показником тварин групи 1К (р<0,05), тимчасом як ктькють дегенеративних -значно зростае (табл. 4).
При фарбуванн зрiзiв амiлоTд-специфiчним барвинком
ГМ щурiв групи 1К вiдсутнi бляшки р-АБ (рис. 11).
Натомють у тварин iз моделлю ХА встановлено значну ктькють конгофтьних мас у всiх дн лянках ГМ. Накопичення р-АБ простежуються як у нейропiлi, так i у стiнках дрiбних церебральних артерш (рис. 12). Дифузнi амiлоTднi маси, що ро-зташованi у нейропл мають iнтенсивне забар-влення. Форма скупчень р-АБ неправильна. На дтянках, шфтьтрованих конгофiльними маса-ми, нейропть мае однорiдну структуру, втрача-еться його волокнистють, що також е ознакою нейродегенерацiT.
конго червоним встановлено, що у
1 I
Ш&..М
я ■ Ш
*
б
>
/
Рис. 11. Нейропль великих п1вкуль щура групи ¡нтактного контролю: а - в1дсутнсть накопичення в-амлоТдного блка, б - не-значн конгофльн1 маси у ст1нц др1бноТ артерп; а, б - конго червоний (х 250).
Рисунок 12. Кора великих п1вкуль щура з моделлю скополам1н-1ндукованоТ'хвороби Альцгеймера: а - дрбна церебральна ар-тер1я ¡з потовщеними в-амлоТдним блком ст1нками та звуженим просв1том; нейрони та гл1оцити навколо артерп в1дсутн1 (х 100), б - скупчення шульноТ' гомогенноТ конгофльноТречовини у нейропл1 (х 400); а, б - конго червоний.
Таким чином, тривала блокада центральних М-ХР скополамшом призводить до порушення
енергетичного обмшу, змш нейромедiаторного профтю ГМ, характерних для ХА, виразноТ де-генерацп нейрошв V шару СМК i вентрального ппокампа, а також до значноТ р-амто'ТдноТ шфн льтраци нейроптю в корi великих твкуль та стн нок дрiбних церебральних артерш. Означен
змши нейрошв ГМ мають оргашчний характер та е первинними ланками патогенезу ХА, що за клн шчних умов передують холшерпчному дефщиту.
Зютавлення отриманих результат i даних л^ератури дозволяе виявити iмовiрнi мехашзми розвитку виявлених бiохiмiчних та морфолопч-них змiн на тлi блокади центральних М-ХР. Перш за все, привертае увагу виразне пщви-
щення активност АХЕ шсля тривалого введення скополамшу. Це явище пояснюеться у рамках «ацетилхолшестеразно'Г ппотези», запропонова-но'|' у роботi Shen Z.-H. [27]. Згщно з цiею ппоте-зою, нейрони ГМ, що експресують М-ХР, в^з-няються один вщ одного не лише пiдтипом останшх (М1-М5), але також спiввiдношенням АХЕ та холшацетилтрансферази (ХАТ) - ключо-вих ферментiв синтезу та депонування АХ. За-лежно вiд того, який фермент нервова кл^ина синтезуе у переважнш кiлькостi, розрiзняють АХЕ- та ХАТ-позитивн нейрони. Встановлено, що бтьшють холiнергiчних нейронiв базальних ганглпв, лiмбiко-паралiмбiчноï системи, септаль-них ядер, що проецшють сво'1 волокна на ппо-камп та кору великих швкуль (структури, що найбiльше страждають при ХА), е АХЕ-позитивними. Наслщком альтерацп цих нейронiв е змша активностi АХЕ в бк зменшення або збн льшення, залежно вщ регiону ГМ [28]. У випадку хроычно'Г блокади М-ХР скополамшом оверекс-пресiя АХЕ вiдбуваеться саме внаслщок руйну-вання нейронiв, тобто е вторинним процесом вн дносно нейродегенерацп [29].
lмовiрнi механiзми останньо'Г на тлi негативно!' регуляци' ХСМ е предметом штенсивно'Г нау-ково'Г дискусп. 1снуе широкий спектр припущень щодо цього питання, проте уа вони базуються на положены, що ключовою ланкою цього пато-логiчного процесу е порушений внутршньоклн тинний сигналiнг холiнергiчних нейронiв [3]. Три-герним фактором виступае, зокрема, толерант-нють рецепторiв (downregulation of receptors), що виникае на ™i тривало'1 л^анд-рецепторно'Г вза-емоди' (наприклад, блокади рецептора антагош-стом) [6]. Модифiкований внаслiдок толерантно-стi рецепторiв iмпульс, опосередкований Gq/11 бiлком, знижуе активнiсть протешкшази С (PKC), зокрема, ïï iзоформ PKCa та PKCe. Цi iзоформи ферменту модулюють активнють металопротеаз ADAM10 та ADAM17, шактива^я яких призво-дить до альтернативного процесингу бтка-попередника амтощу (amyloid precursor protein, APP) за учасп p-секретази [5]. Наслiдок такоï змши - утворення р-форми амiлоïдного бтка (рАБ) та зниження активносп а- та Y-секретаз, що за фiзiологiчних умов стимулюють продукцiю нейропротекторного бтка С83 [30]. Агрегуючи з неспецифiчним цитозольним пептидом PrPC, рАБ формуе внутрiшньо- та позакл^инш бляшки.
р-АБ-опосередкована нейродегенерацiя су-проводжуеться пiдвищеним рилiзингом низки медiаторiв, зокрема, ГАМК, аспартату, глутамату та серотоншу. Оверекспреая цих медiаторiв свi-дчить про пошкодження не лише холшерпчних нейронiв, але й ГАМК- та глутаматерпчних [8]. Про пiдвищений рилiзинг серотонiну повiдомля-еться, зокрема, в оглядi [7], де показано, що його оверекспреая при ХА корелюе з виразнютю ког-нiтивного дефщиту та дегенерацiею як холiнер-пчних, так i 5-HT2- та 5-НТ6-серотоншових реце-пторiв.
Останнiм часом дослщжують лiкарськi препа-рати, що здаты активувати а- та Y-секретазний процесинг APP чи зменшувати толерантнiсть М-ХР. Така властивiсть притаманна ендогенним ростовим факторам (NGF, BDNF) та засобам iз нейротрофiчною активнiстю. Мехашзм нейроп-ротекторноï дiï останнiх базуеться на активацп внутрiшньоклiтинного MAPK (mitogen activated protein kinase) сигнального каскаду, а саме його нейропротекторних складових - jNk та p38 [31]. Пщвищенню чутливосп холiнергiчних рецепторiв (upregulation of receptors) також сприяють засо-би, що виявляють цитокiн-опосередкованi про-тизапальнi властивостi. Оскiльки рилiзинг низки цитоюшв (TNFa, IL-1p) регулюеться ХСМ [32], зниження опосередковано'Г останнiми запально'Г реакцiï за принципом зворотного зв'язку пщви-щуе трансдукцiйний потенцiал М-ХР. Важливим фактором, що стимулюе p-процесинг APP та нейродегенерацiю, е пперактива^я гiпоталамо-гiпофiзарно-наднирниковоï (ГГНС) системи, яка характеризуе дистресову ситуацш [6]. В експе-риментi хронiчний iммобiлiзацiйний стрес у щу-рiв спричиняе виразну дегенерацш нейронiв сА1 та СА3 зон гiпокампа [33], виступаючи, таким чином, предиктором когштивного порушення за альцгеймерiвським типом. Тому високий тера-певтичний потенцiал мають стреспротекторш засоби, що нормалiзують активнiсть ГГНС. Отримаш данi дозволяють спрогнозувати клю-човi вимоги до оптимального засобу для терапп ХА. Незалежно вщ механiзму холiнопозитивноï активностi (пригнiчення АХЕ чи модуля^я мус-каринового рецепторного комплексу), такий ней-ропротектор мае поеднувати нейротрофiчнi, ци-токiн-опосередкованi протизапальы та стрес-протекторнi властивостi.
Отже, результати дослщження переконують, що тривала блокада центральних М-ХР скополамшом вщтворюе практично ва компоненти патогенезу ХА, у тому чи^ накопичення р-АБ та нейродегенерацiю, а не лише когштивний дефi-цит. З шшого боку, результати дають пщставу для висновку, що модель скополамш-iндукованоï ХА дозволяе дослщжувати вплив лi-карських засобiв не лише на когштивш функцiï тварин, але також на енергетичний обмш, ней-ромедiаторний профiль, перешкоджати нейро-дегенерацiю та амiлоïдоз. Насамкiнець, небез-печнi нейротоксичнi властивостi центральних М-холiноблокаторiв аж до нейродегенеративних процеав, очевидно, варто враховувати у прак-тицi фармакотерапiï, уникаючи тривалого засто-сування таких препаратiв.
Висновки
1. Тривала (27 дiб) блокада центральних М-холiнорецепторiв скополамiном призводить до стшкого когнiтивного дефiциту у щурiв, порушення енергетичного обмiну головного мозку, нейротрансм^терного зсуву, а також до попр-шення морфофункцiонального стану нейрошв
СМК та СА1 i СА3 зон ппокампа.
2. Конiтивний дефiцит щурiв 3i скополамш-iндукованою хворобою Альцгеймера виявляеть-ся виразним та тривалим попршенням тзнава-льно'Т, розсудково'Т та мнестично'Т функцiй, вста-новленим за тестами вщкритого поля, екстрапо-ляцiйного вивтьнення та умовного рефлексу пасивного уникнення.
3. Порушення енергетичного обмiну характе-ризуеться зростанням артерю-венозно'Т рiзницi вмiсту глюкози в кровi церебрального басейну у 1,5 разу, що свщчить про зниження ТТ' споживан-ня головним мозком, та ешвалентним за кратш-стю зменшенням кiлькостi АТФ у тканин головного мозку.
4. Змши нейромедiаторного профiлю вияв-ляються гiперактивацiею ацетилхолiнестерази, зменшенням кiлькостi ацетилхолшу у синапто-сомах холiнергiчних нейрошв, реактивною ове-рекспресiею гамма-амiномасляноТ' кислоти, глу-тамату, аспартату та серотоншу.
5. Морфологiчнi змiни головного мозку характеризуются зменшенням кiлькостi функцюна-льно повноцiнних нейронiв V шару сенсомотор-ноТ кори та СА1 i СА3 зон гiпокампа, шфтьтрацн ею нейропiлю та дрiбних церебральних артерш р-амто'Тдним бiлком.
6. Отже, хрошчна блокада центральних мус-каринових рецепторiв скополамiном вiдтворюе як когштивний дефiцит, так i первиннi нейроде-генеративнi ланки патогенезу хвороби Альцгеймера. Це дозволяе використовувати зазначену модель для дослщження нейропротекторних властивостей засобiв для лкування хвороби Альцгеймера.
Лтература
1. Swerdlow R.H. Pathogenesis of Alzheimer's disease / R.H. Swerdlow // Clinical Interventions in Aging. - 2007. - Vol. 2, № 3. -Р. 347-359.
2. De-Paula V.J. Alzheimer's Disease / V.J. De-Paula, M. Radanovic, B.S. Diniz, O.V. Florenza // Subcellular Biochemistry. - 2012. - Vol. 65. - P. 329-352.
3. Bartus R.T. On Neurodegenerative Diseases, Models, and Treatment Strategies: Lessons Learned and Lessons Forgotten a Generation Following the Cholinergic Hypothesis / R.T. Bartus // Experimental Neurology. - 2000. - Vol. 163. - P. 495-529.
4. Perry E.K. Increased Alzheimer Pathology in Parkinson's Disease Related to Antimuscarinic Drugs / E.K. Perry, L. Kilford, A.J. Lees [et al.] // Ann Neurol. - 2003. - Vol. 54, № 2. - P. 235-238.
5. Fisher A. Cholinergic Modulation of Amyloid Precursor Protein Processing with Emphasis on M1 Muscarinic Receptor: Perspectives and Challenges in Treatment of Alzheimer's Disease / A. Fisher // Journal of Neurochemistry. - 2012. - Vol. 120 (Suppl. 1). - P. 2233.
6. Konishi K. Hypothesis of Endogenous Anticholinergic Activity in Alzheimer's Disease / K. Konishi, K. Hori, M. Tani [et al.] // Neuro-degenerative Diseases. - 2015. - Vol. 15. - P. 149-156.
7. Francis P.T. Neurochemical Basis for Symptomatic Treatment of Alzheimer's disease / P.T. Francis, M.J. Ramirez, M.K. Lai // Neuropharmacology. - 2010. - Vol. 59. - P. 221-229.
8. Granger A.J. Cotransmission of acetylcholine and GABA / A.J. Granger, N. Mulder, A. Saunders, B.L. Sabatini // Neuropharmacol-ogy. - 2016. - Vol. 100. - P. 40-46.
9. Gilles C. Pharmacological Models in Alzheimer's Disease Research / C. Gilles, S. Ertle // Dialogues in Clinical Neuroscience. - 2000. -Vol. 2, № 3. - P. 247-255.
10. Воронина Т.А. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия / Т.А. Воронина, Р.У. Островская, Т.Л. Гарибова // Руководство по проведению доклинических исследований лекарствен-
ных средств. Издание: ФГБУ «НЦЭМСП» Минздравсоцразви-тия России. Москва. Часть1. Глава. - 2012. - Т. 17. - С. 276296.
11. Bubser M. Muscarinic Receptor Pharmacology and Circuitry for the Modulation of Cognition / M. Bubser, N. Byun, M.R. Wood, C.K. Jones // Handb Exp Pharmacol. - 2012. - Vol. 208. - P. 121-166.
12. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. / Vogel H. (ed.). - Springer Science & Business Media, 2007. - P. 902-942.
13. Hajos E. An Improved Method for the Preparation of Synaptosomal Fractions in High Purity / E. Hajos // Brain Res. - 1975. - Vol. 93, № 3. - P. 485-489.
14. Способ определения ацетилхолина: пат. 2256920 Российская Федерация : МПК G01N33/50 / Трубицына И.Е., Дроздов В.Н., Лазебник Л.Б., Лычкова А.Э. (RU). - 2003127761/15 ; заявл. 27.03.05 ; опубл. 20.07.05, Бюлл. 20. - 15 с.
15. Ellman G.L. A New and Rapid Colorimetric Determination of Acetylcholinesterase Activity / G.L. Ellman, K.D. Courtney, V.J. Andres, R.M. Featherstone // Biochemical Pharmacology. - 1961. -Vol. 7. - P. 88-95.
16. Ещенко Н.Д. Определение содержания АТФ в тканях // Методы биохимических исследований / Н.Д. Ещенко; Под ред. проф. М.И. Прохоровой. - Ленинград: Из-во ЛГУ, 1982. - с. 256-258.
17. Atack C. A procedure for the isolation of noradrenaline (together with adrenaline), dopamine, 5-hydroxytryptamine and histamine from the same tissue sample using a single column of strongly acidic cation exchange resin / C. Atack, T. Magnusson // Acta Pharmacol Toxicol (Copenh). - 1978. - Vol. 42 (1). - P. 35-57.
18. Joseph M.H. Electrochemical activity of o-phthalaldehyde-mercaptoethanol derivatives of amino acids: Application to highperformance liquid chromatographic determination of amino acids in plasma and other biological materials / M.H. Joseph, P. Davies // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1983. - Vol. 277. - P. 125-136.
19. Kimelberg H.K. Swelling-Induced Release of Glutamate, Aspartate, and Taurine from Astrocyte Cultures / H.K. Kimelberg, S.K. Goderie, S. Higman [et al.] // The Journal of Neuroscience. - 1990. - Vol. 10 (5). - P. 1583-l 591.
20. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. / Г.А. Меркулов - М.: Медицина, Ленингр. отд-е, 1969. - 424 с.
21. Böck P. Färbung von Amyloid mit Kongorot / P. Böck // Der Semi-dünnschnitt. - München, 1984. - P. 106.
22. Крушинский Л.В. Биологические основы рассудочной деятельности. Эволюционный и физиолого-генетический аспекты поведения: монография / Л.В. Крушинский; предисл. Д.К. Беляева, А.Ф. Семиохиной. - 3-е изд. - М.: URSS, 2009. - 270 с.
23. Mark R.J. Amyloid ß-Peptide Impairs Glucose Transport in Hippo-campal and Cortical Neurons: Involvement of Membrane Lipid Peroxidation / R.J. Mark, Z. Pang, J.W. Geddes [et al.] // Journal of Neurosciences. - 1997. - Vol. 17, № 3. - 1046-1054.
24. El Falougy H. The Microscopical Structure of the Hippocampus in the Rat / H. El Falougy, E. Kubikova, J. Benuska // Bratisl. Lek Listy. - 2008. - Vol. 109, № 3. - P. 106-110.
25. Жаботинский Ю.М. Нормальная и патологическая морфология нейрона. / Ю.М. Жаботинский - Л.: Медицина. 1965. - 322 с.
26. Максимова К.Ю. Морфологические изменения нейронов в гип-покампе крыс при преждевременном старении / К.Ю. Максимова, Н.А. Стефанова, С.В. Логвинов // Бюллетень сибирской медицины. - 2014. - Т.13, №1. - С. 56-61.
27. Shen Z.-H. Acetylcholinesterase Provides Deeper Insights into Alzheimer's Disease / Z.-H. Shen // Medical Hypotheses. - 1994. -Vol. 43. - P. 21-30.
28. Kasa P. The Cholinergic System in Alzheimer's disease / P. Kasa, Z. Rakonczay, K. Gulya // Progress in Neurobiology. - 1997. - Vol. 52. - P. 511-535.
29. Park H.R. Fermented Sipjeondaebo-tang Alleviates Memory Deficits and Loss of Hippocampal Neurogenesis in Scopolamine-induced Amnesia in Mice / H.R. Park, Lee H., Cho W.-K., Ma J.Y. // Sci Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 22405.
30. Multhaup G. Alzheimer's Disease / G. Multhaup, L. Munter // Encyclopedia of Molecular Pharmacology. Ed. by S. Offermanns and W. Rosenthal. - Berlin, Heidelberg, New York, 2008. - Р. 65.
31. Haring R. Mitogen-Activated Protein Kinase-Dependent and Protein Kinase C-Dependent Pathways Link the M1 Muscarinic Receptor to Beta-Amyloid Precursor Protein Secretion / R. Haring, A. Fisher, D. Marciano [et al.] // Journal of Neurochemistry. - 1998. - Vol. 71, № 5. - P. 2094-2103.
32. Carnevale D. Microglia-Neuron Interaction and Degenerative Diseases: Role of Cholinergic and Noradrenergic Systems / D. Carnevale, R. De Simone, L. Minghetti // CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. - 2007. - Vol. 6. - P. 388-397.
33. Тверской А.В. Морфологические изменения нейронов областей СА1 и СА3 гиппокампа крыс при хроническом иммобилизацион-ном стрессе (морфометрическое исследование) / А.В. Тверской // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2014. - № 3. - С. 37-41.
Реферат
ХРОНИЧЕСКАЯ БЛОКАДА ЦЕНТРАЛЬНЫХ МУСКАРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ У КРЫС ВОСПРОИЗВОДИТ ПЕРВИЧНЫЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЗВЕНЬЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Дейко Р.Д., Штрыголь С.Ю., Ларьяновская Ю.Б., Горбач Т.В., Губина-Вакулик Г.И., Девяткина Н.Н., Штрыголь Д.В. Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, патогенез, М-холиноблокаторы, эксперимент
Болезнь Альцгеймера (БА) - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание, патогенез которого до конца не известен. Существует предположение, что длительная блокада центральных М-ХР приводит к развитию первичных звеньев этого заболевания, однако прямых доказательств недостаточно. Цель исследования - установить влияние длительной блокады М-ХР на гисто-структуру, накопление бета-амилоидного белка (р-АБ) и нейромедиаторный профиль головного мозга (ГМ) у крыс. У крыс со скополамин-индуцированной БА исследовали когнитивные функции в тестах открытого поля, экстраполяционного избавления и условного рефлекса пассивного избегания. Измеряли уровень ацетилхолина (АХ) и активность ацетилхолинестеразы (ХА) в синаптосомах нейронов, в целом ГМ - уровень АТФ, гАмК, серотонина, глутамата и аспартата. Морфологически исследовали сенсомоторную кору (СМК) больших полушарий, СА1 и СА3 зоны гиппокампа на предмет нейродеге-нерации. В нейропиле определяли р-АБ. У крыс со скополамин-индуцированной БА установлено выраженное нарушение когнитивных функций, энергетического обмена (уменьшение потребления глюкозы и уровня АТФ), патологическую оверэкспрессию АХЭ и всех медиаторов кроме АХ, уровень которого значительно снижается. Морфологически выявлена нейродегенерация СМК и гиппокампа, р-амилоидная инфильтрация нейропиля и стенок мелких церебральных артерий. Таким образом, длительная блокада центральных М-ХР приводит к развитию первичных звеньев БА, что необходимо учитывать как в экспериментальной фармакологии, так и при лечении пациентов холинолитическими средствами.
Summary
CHRONIC BLOCKADE OF CENTRAL MUSCARINIC RECEPTORS IN RATS INDUCES PRIMARY PATHOGENETIC LINKS OF ALZHEIMER'S DISEASE
Deiko R.D., Shtrygol' S.Yu., Laryanovskaya Yu.B., Gorbach T.V., Gubina-Vakulik G.I., Devyatkina N.M., Shtrygol' D.V. Key words: Alzheimer's disease, pathogenesis, M-cholinoblockers, experiment
Introduction. Alzheimer's disease (AD) is one of the most common neurodegenerative diseases, which pathophysiological mechanisms are still unclear. The cholinergic hypothesis of AD postulates that the long-term blockade of the central muscarinic receptors results in development of the primary AD links (neurodegeneration, p-amyloidal protein (p-AP) deposition and neurotransmitters imbalance). The aim of our study is to evaluate the influence of long-term muscarinic receptors blockade with scopolamine on the brain morphological structure, energetic metabolism, main AD-related neurotransmitters level and enzymes activity, as well as p-AP deposition. Materials and methods. Scopolamine-induced AD was reproduced in rats by i. p. scopolamine administration (1 mg/kg, once a day for 27 days). After 10 days of the washout period the cognitive functions were determined using open-field test (OFT), extrapolation escape test (EET), and conditioned reflex of passive avoidance test (CRPAT). The two first tests were done once, on the 1st day, and CRPAT was done twice (on 1st and 10th days). Glucose level in the venous and arterial blood of the cerebral pool was measured 10 days after cognitive testing. The arterial-venous difference (AVD) of glucose content was calculated. The rats were killed, and the brains were removed immediately. The level of adenosine triphosphate (ATP), serotonin (5-HT), gamma-aminobutyric acid (GABA), glutamate, and aspartate were measured in the entire brain, while acetylcholine (ACh) and acetylcholinesterase (AChE) were measured in the synaptosomes of the cerebral muscarinic receptors. The number of normochromic and degenerative neurons in motor and sensory regions of cerebral cortex of frontal lobe as well as in CA1 and CA3 regions of hippocampus, p-amyloid protein infiltration of brain tissue were evaluated morphologically. Results. Firstly, it has been shown that the rats with scopolamine-induced AD were characterized by the pronounced cognitive deficit and memory disorders. In particular, the latent time of the avoidance in CRPAT decreased in 2.4 and 2.6 times (on 1st and 10th days respectively) when compared with the intact animals (p<0.05), while the time of escape in EET was considerably longer than the value of animals without modelled AD. The changes found were followed with the energetic metabolism disturbance, namely the AVD was increased in 1.5 times, while ATP level was decreased in 1.5 times (statistically significant versus intact animals indices, p<0.05). Secondly, the significant changes in the brain neurotransmitters system were established by the biochemical studies. Pronounced AChE over expression resulted in the depletion of ACh level that reached 29.0% (statistically significant compared with the intact animals value, p<0.05). On the other hand, the levels of 5-HT, GABA, glutamate and aspartate were reactively increased, the increments ranged from 55% to 69% (p<0.05 vs intact animals indices). The neurotransmitters disturbance might be explained through the cholinergic neurons alterations and death. According to the results of the brain morphological analysis, it was revealed that the number of normochromic neurons was extremely reduced in all investigated brain regions. The number of degenerative neurons (hypochromic and hyperchromic, with focal chromatolysis) was notably increased. Expressive neurodegeneration was manifested in the reduction of the neurons somas square, es-
pecially in CA1 and CA3 regions of hippocampus. p-amyloidal protein deposition was established in the cerebral neuropil and arterial walls, with occasional perivascular plaques. Thus, it can be concluded that sco-polamine-induced AD modulates the major hallmarks of AD such as cognitive and memory impairments, disturbance of brain neurotransmitters system and energetic metabolism, neurodegeneration in motor and sensory sensory regions of cerebral cortex of frontal lobe as well as in hippocampus and, finally, p-amyloid protein deposition. The data obtained confirm the key role of the brain cholinergic system in AD pathogenesis and allow using of scopolamine-induced AD model not only for cognitive enhancers search, but also for the complex investigation of neuroprotectors.
УДК 616.831 - 001:575.1
Зяблцев С. В., Стародубська О. О., Богза С. Л.
ФАРМАКОЛОГ1ЧНА КОРЕКЦ1Я КОГН1ТИВНИХ ПОРУШЕНЬ ПРИ ЧЕРЕПНО-МОЗКОВ1Й ТРАВМ1
Нацюнальний медичний ушверситет iM. О. О. Богомольця, м. КиУв
1нститут фiзико-органiчноï xiMiï та ByrnexiMiï iMeHi Л.М. Литвиненка НАН Укра'ши, м. КиУв
Чисельн!' досл'дження св'дчать про розвиток когштивних порушень при черепно-мозковш травмi (ЧМТ) не тльки в гострому перодi, але й на протяз1 рок'т псля ушкодження. Ушкодження вищих функц1й мозку спостергаеться у третини пац1ент1в з легкою ЧМТ, а у постраждалих з середньо важкою та важкою травмою розвиваються бльш стшкi й вираженi порушення. Карбацетам - це новий модулятор ГлМк-бензод1азеп1нового рецепторного комплексу, пох'дне р-карбол'/ну. Мета ро-боти. Визначення ефективност1 використання карбацетаму з метою в'дновлення когштивних фу-нкц1й при експериментальн1й ЧМТ. Матер1али та методи. Досл1дження проведено на 112 блих безпородних щурах-самцях; моделювання ЧМТ в'дтворювали за методикою В.М. Сльського, С.В. Зяблцева (2005). Контрольну групу склали 16 хибнотравмованих тварин, досл'днi групи з ЧМТ склали по 48 тварин: 1-а група - з введенням карбацетаму (5 мг/кг маси), 2-а група - з введенням 1 мл ф1зюлог1чного розчину, внутршньочеревно протягом 10 д'б псля травми. Когн1тивн1 розлади досл'дженi за методиками: в'дкрите поле, норковий рефлекс, восьмирукавний лаб'ринт через 7 та 30 д'б псля травми. Результати. Внасл'док ЧМТ в'дбуваеться суттеве пригн1чення когштивних функц1й, про що св'дчили показники тест'т обох досл'дних груп як через 7, так i через 30 д'б псля травми. В'дновлення показник'т в'дбувалося пд д1ею карбацетаму, який ефективно полпшував показники ор'ентовно-руховоï активностi до контрольного р'тня через 30 д 'б псля травми. Також спостергалося в 'дновлення навчально-досл'дноï активност'!, емоц1йност1, тривожност1 та пам'ят1 за показниками тест'т з норковим рефлексом та восьмирукавним лаб1ринтом. Висновки. Результати вивчення ефективност1 карбацетаму при експериментальн1й ЧМТ показали в'дновлення протягом 30 д'б показник'т ор'ентовно-руховоï активност'!, навчально-досл'дноï д'яльност'! та пам'ят1.
Ключов1 слова: черепно-мозкова травма, когн1тивн1 порушення,
Черепно-мозковий травматизм поширюеться в рiзних краТнах св^у, при цьому завдяки сучас-ним досягненням медицини та впровадженню бтьш вдосконалених методiв лкування ктькють летальних випадш зменшуеться, але постають проблеми з розвитком ускладнень травми [3,7,9]. В УкраТш щорiчно до 200 000 па^ешчв з ЧМТ потрапляють в лкарш, у 45 % з них вщбу-ваеться втрата працездатност [8,9]. Чисельш дослщження свщчать про розвиток когштивних порушень при черепно-мозковш травмi (ЧМТ) не ттьки в гострому перюд^ але й на протязi рош шсля ушкодження [11,13]. Вираженють когштивних порушень залежить вщ тяжкост травми, ТТ комбшаци з травмами шших оргашв, розвитку ускладнень, а також вку постраждалих та попе-реднього стану (наявност супутньоТ патологи) [7,12]. В гострому пер^ травми можуть розви-ватися таю порушення як непритомнють та посттравматична амнезiя, в подальшому у постраждалих спостер^аються порушення сну, збуджен-ня, афективна лабтьнють [4]. За даними А^.
карбацетам
Rabinowitz та H.S. Levin (2014) ушкодження когштивних функцш спостер^аеться у третини пацн ентв з легкою ЧМТ, а у постраждалих з серед-ньо-важкою та важкою травмою розвиваються бтьш стшк та виражеш порушення [12]. В.В. Захаров та Е.А. Дроздова (2013) стверджують, що порушення вищих мозкових функцш нав^ь при легкш та середньо-важкш травмi мозку роз-виваеться у 100 % випадш, при цьому саме порушення когштивних функцш в бшьшосп випад-ш обумовлюють швалщизацш па^етчв з ЧМТ [3]. Як правило, страждають таю когштивш фун-кци, як пам'ять, увага, процеси мiркування, контролю та прийняття ршень [12].
Залишаються актуальними питання вибору ефективних медикаментозних засобiв лкування ЧМТ, в тому чи^ i з метою попередження когштивних порушень i проведення ефективно! реа-бт^аци па^етчв з травмою мозку та пошук ш-формативних критерив ефективност фармако-лопчних засобiв [7,10,13]. У цьому рядi випдно в^зняеться в^чизняний препарат карбацетам,
