CC BY
38УДК 633.6. 3: 575.2
doi.org/10.24412/2413-5518-2021-3-37-39
Микросателлитные маркеры в селекции сахарной свёклы
А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук (e-mail: arpnal@rambler.ru) Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук Н.Р. МИХЕЕВА, мл. научн. сотрудник А.В. КОРНИЕНКО, д-р с/х. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
В настоящее время ДНК-технологии становятся важным инструментом селекции растений и находят всё более широкое применение в мире для изучения генетического разнообразия популяций, подвидов, видов. Эти же методы могут стать основой генетической паспортизации сортов, линий и гибридов различных культурных растений [1]. Сейчас в целях ускорения селекционного процесса растений в качестве наиболее значимых направлений рассматриваются так называемые маркер-опосредованная селекция (Marker-Assisted Selection, MAS) и геномная селекция GS (Genomic Selection) [2], в основе которых также лежит исследование ДНК-маркеров. Одной из важнейших задач селекции сахарной свёклы является оценка генетического разнообразия, благодаря которой снижаются трудоёмкость и затраты на определение родительских линий для гибридизации. Чтобы повысить эффективность создания линий и гибридов, необходима разработка технологии генетического анализа на основе молекулярных маркеров, позволяющей проводить достоверную оценку их подлинности и однородности на всех этапах селекционного процесса [3]. Эффективным методом изучения генетического разнообразия является использование микросателлитных маркеров, так как они равномерно распределены в геноме растений, характеризуются специфичным
расположением на хромосоме, высокой вариабельностью, точностью воспроизведения результатов и кодоминантным типом наследования, что позволяет выявлять гомозиготное или гетерозиготное состояние локусов. Выявлением полиморфизма длин SSR-локусов устанавливается индивидуальная характеристика каждого отдельного генотипа — ДНК-профиль [4].
Исследования генетического разнообразия важны для выбора родителей с высокой комбинационной способностью, которые при скрещивании увеличивают шансы получения превосходящих генотипов. Так, голландскими учёными было использовано более 20 полиморфных SSR-праймеров при изучении генетического разнообразия более 100 образцов сахарной свёклы [5].
Целью данного исследования является проведение идентификации селекционного материала Beta vulgaris L. с помощью анализа полиморфизма длин микросателлит-ных фрагментов и отбор перспективных линий в целях создания высокопродуктивных гибридов.
Материалы и методы
Исследование проводили на 10 селекционных линиях сахарной свёклы (Beta vulgaris L.), в состав которых входили МС-линии и линии О-типа. Для эксперимента использовали листовой аппарат сахарной свёклы, выращенный в течение двух недель. ДНК выделяли с применением стандартного протокола экстракции 7,5 М аце-
татом аммония [6]. Качество образца оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в TBE-буфере (0,1 М трис; 0,1 М борная кислота; 0,05 М ЭДТА; рН 8,08,2) и определяли концентрацию ДНК с использованием набора HS QubitR (Thermo Fisher Scientific, США). Классическая полиме-разно-цепная реакция была проведена на амплификаторе Genius (Великобритания). В работе были использованы следующие 9 локус-специфичных праймеров: Unigene 27833, Unigene 24552, Unigene 2305, Unigene 17623, Unigene 14805, Unigene 22373, Unigene 7492, Unigene 16898, Unigene 18963 [7].
Результаты исследований
и их обсуждение
В результате молекулярно-ге-нетических исследований нами было проведено генотипирование 10 селекционно-ценных образцов лаборатории исходного материала по SSR-маркерам. Всего в изученных генотипах выявлено 107 ДНК-ампликонов. На основе полученных данных рассчитан PIC (показатель информационного полиморфизма) каждого маркера. Чем выше PIC, тем «ценнее» маркер, так как он отражает способность маркера устанавливать полиморфизм в популяции в зависимости от числа обнаруживаемых аллелей и распределения их частот. Величина PIC была рассчитана по следующей формуле:
piq=i -¿рД
/= 1
где г — г-и аллель у-го маркера, n — число аллелей у-го маркера, Р — частота аллелей [8].
Так, по локусу Unigene 22373 обнаружено от 1 до 7 ПЦР-продуктов длиной от 100 до 800 п. н. (рис. 1). По данному SSR-локусу установлено всего 30 ампликонов. Этот микросател-литный локус оказался высокополиморфным, PIC 0,76.
По праймерам для SSR-маркера Unigene 7492 в изученных селекционных образцах выявлено от 1 до 3 ПЦР-продуктов длиной 250— 1300 п. н. (рис. 2). Полиморфизм составляет 0,44.
По праймерам для SSR-маркера Unigene 16898 в изученных селекционных образцах выявлено от 1 до 6 ПЦР-продуктов длиной 200-800 п. н. (рис. 3). Общее количество идентифицированных ПЦР-фрагментов составило 16. Полиморфизм составляет 0,73, что свидетельствует о возможности использования данного маркера в целях генотипирования.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M К-
1 234567 89 10 M К-
Рис. 1. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к SSR-локусу Unigene 22373 Обозначения: 1 - РФ О-тип 090012Б; 2 - РФ О-тип 017009:3 - РФ О-тип 09001; 4 - МС 090012Б (раст. 2);
5 -МС017010 (раст. 2);
6 - МС709 017004 (раст. 1);
7 - МС 090012Б (раст. 1);
8 - МС 090012Б (раст. 3);
9 - МС017010 (раст. 1);
10 - МС709 017004 (раст. 2).
М - маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (ThermoScientiflc, США), К - контроль, без ДНК
Заключение
Итак, на основе проведённых ПЦР-анализов возможно создание электронных генетических паспортов и штрих-кодов изучаемых селекционных материалов сахар-123456789 10 МК-
Рис. 2. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к SSR-локусу Unigene 7492 Обозначения: 1 - РФ О-тип 090012Б; 2 - РФ О-тип 017009; 3 - РФ О-тип 09001; 4 - МС 090012Б (раст. 2);
5 - МС017010 (раст. 2);
6 - МС709 017004 (раст. 1); 7- МС 090012Б (раст. 1);
8 - МС 090012Б (раст. 3);
9 - МС017010 (раст. 1);
10 - МС709 017004 (раст. 2).
М - маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (ThermoScientific, США), К - контроль, без ДНК
Так, ампликоны длиной 200 п. н. выявлены у № 6, 7; фрагмент 250 п. н. отмечен у № 1, 2, 4, 6, 7, 9. ПЦР-продукт длиной 300 п. н. установлен у всех образцов. У № 1 обнаружен дополнительный ам-пликон 400 п. н. ДНК-фрагмент длиной 600 п. н. выявлен у № 2 и 5, а 800 п. н. - у № 2, 3, и 9.
Амплификация с Unigene 24552 в изученных селекционных образцах выявила от 1 до 3 ПЦР-продуктов длиной 150-600 п. н. (рис. 4). Общее количество идентифицированных ПЦР-фрагментов составило 20. Полиморфизм составляет 0,62, что свидетельствует о возможности использования и данного маркера при паспортизации.
По результатам молекулярного анализа составлены мультило-кусные генетические паспорта и штрих-коды исследованных материалов, что позволило идентифицировать их для применения в селекционном процессе (табл. 1, 2) [9].
Рис. 3. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к SSR-локусу Unigene 16898 Обозначения: 1 - РФ О-тип 09001 2Б; 2 - РФ О-тип 017009; 3 - РФ О-тип 09001; 4 - МС 090012Б (раст. 2);
5 - МС017010 (раст. 2);
6 - МС709 017004 (раст. 1); 7- МС 090012Б (раст.1);
8 - МС 090012Б (раст. 3);
9 - МС017010 (раст. 1);
10 - МС709 017004 (раст. 2).
М - маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (ThermoScientific, США), К~ - (контроль, без ДНК)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M К-
Рис. 4. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к SSR-локусу Unigene 24552 Обозначения: 1 - РФ О-тип 09001 2Б; 2 - РФ О-тип 017009; 3 - РФ О-тип 09001; 4 - МС 090012Б (раст. 2);
5 - МС017010 (раст. 2);
6 - МС709 017004 (раст. 1);
7 - МС 090012Б (раст. 1);
8 - МС 090012Б (раст. 3);
9 - МС017010 (раст. 1);
10 - МС709 017004 (раст. 2).
М - маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (ThermoScientific, США), К~— контроль, без ДНК
38 САХАР № 3 • 2021
ной свёклы по микросателлитным маркерам.
Таким образом, применение технологии генотипирования ДНК на основе SSR-анализа позволяет отбирать для гибридизации генетически однородный материал и контролировать селекционную работу, что имеет большое значение в практической селекции сахарной свёклы.
Список литературы
1. Сухарева, А.С. ДНК-маркеры для генетического анализа сортов культурных растений / А.С. Сухарева, Б.Р. Кулуев // Биомика. — 2018. — Т. 10. - № 1. - С. 69-84.
2. Kordrostami M. Molecular Markers in Plants: Concepts and Applications / M. Kordrostami, M. Rahimi. ResearchGate: Review Article. — Published On-line. - 2015.
3. Шилов, И.А. Создание современных гибридов сахарной свёклы с применением микросателлитного анализа / И.А. Шилов [и др.] // Сахар. — № 8. — 2020. — С. 32—36.
4. Smulders, M. Characterisation of sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) varieties using microsatellite markers / М. Smulders [et al.] // BMC Genetics. — 2010. — V. 11:41.
5. Spadoni, A. A Simple and Rapid Method for Genomic DNA Extraction and Microsatellite Analysis in Tree Plants / A. Spadoni [et al.] // J. Agr. Sci.
Tech. — 2019. — V. 21(5). — P. 1215— 1226.
6. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein, A.A. Nalbandyan, T.P. Fedulova, N.N. Bogacheva // Russian Agricultural Sciences. — 2014. — V. 40. — Is. 3. — Р. 177—178.
7. Fugate, K.Generation and Characterization of a Sugarbeet Transcriptome and Transcript-Based SSR Markers / K. Fugate [et al.] // The Plant Genome. — 2014. — V. 7. — № 2. — P. 1—13.
8. Nei, M. Sampling variances of heterozygosity and genetic distance / M. Nei, A.K. Roychoudhury // Genetics. — 1974. — V. 76. — P. 379—390.
9. Анискина, Ю.В. Исследование генетического разнообразия сорго с использованием технологии мультиплексного микросателлитного анализа. Биотехнология и селекция растений / Ю.В. Анискина [и др.] — 2019. — Т. 2 (3). — С. 20—29.
Аннотация. В статье рассматриваются вопросы проведения паспортизации селекционного материала сахарной свёклы с использованием SSR локус-специфичных праймеров. Молекулярный анализ 10 селекционно-ценных образцов, представленных мужскостерильными формами и опылителями - закрепителями стерильности О-типа, позволил выявить наиболее полиморфные праймеры. Данные праймеры рекомендованы для использования при генотипировании. На основе проведённых исследований составлены мультилокусные молекулярно-генетические паспорта и штрих-коды изученных генотипов. Ключевые слова: сахарная свёкла, ПЦР-анализ, микросателлитные локусы, полиморфизм, штрих-код, генотипирование. Summary. In the article, questions of possibility to certificate sugar beet breeding material using SSR-loci-specific primers are considered. The conducted molecular analysis of 10 breeding-valuable samples presented as malesterile forms and pollinators maintaining O-type sterility has allowed revealing the most polymorphic primers. These primers are recommended to use for genotyping. Based on the carried out investigations, multiloci molecular-genetic passports and bar-codes of the studied genotypes have been made.
Keywords: sugar beet, PCR, microsatellite loci, polymorphism, bar-coding, genotyping.
Таблица 1. Молекулярно-генетические паспорта
1.150 1.250 2.200 2.250 2.300 2.400 2.600 2.800 3.150 3.400 3.600 4.100 4.200 4.300 4.500 4.600 4.700 4.800 5.300 6.250 6.500 6.1300
1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1
2 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0
3 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0
4 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0
5 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0
6 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0
7 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0
8 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0
9 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0
10 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0
Обозначения
По горизонтали - SSR-праймеры (Unigenes) с размерами идентифицированных ДНК-фрагментов: 1 - 14805; 2 - 16898; 3 - 24552; 4 - 22373; 5- 18963; 6-7492. По вертикали - селекционные материалы: 1 - РФ О-тип 090012Б; 2 - РФ О-тип 017009; 3 - РФ О-тип 09001; 4 - МС 090012Б (раст. 2); 5 - МС017010 (раст. 2); 6 - МС709 017004 (раст. 1); 7- МС 090012Б (раст. 1); 8 - МС 09001 2Б (раст. 3); 9 - МС017010 (раст. 1); 10 - МС709 017004
Таблица 2. Штрих-код 10генотипов сахарной свёклы на основе SSR-анализа
Unigene 14805 Unigene 16898 Unigene 24552 Unigene 22373 Unigene 18963 Unigene 7492
О-тип 1 III III III 1
О-тип II IUI 1 IUI 1
О-тип II II II III 1
МС II II III Hill 1
МС 1 II II 1 1
МС II III II II 1
МС 1 III II Hill 1
МС II 1 II II 1
МС II III II II 1
МС II 1 1 III 1
