CC BY
0УДК 577.21:[633.Ш.1+633.14]:633.ШЛ
Е. В. Лагуновская
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ МАРКЕРЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ПАРАМЕТРАМИ АНДРОГЕНЕЗА IN VITRO, У ТРИТИКАЛЕ (х TRITICOSECALE WITTM.) И ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM)
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: e.antonenko@igc.by
Для идентификации микросателлитных локусов и аллелей, ассоциированных с параметрами андрогенеза in vitro у гексаплоидного тритикале (х Triticosecale Wittm.) и мягкой пшеницы (Triticum aestivum), проведен скрининг по пяти микросателлитным локусам (Xgwm312, Xbarc318, Xgwm291, Xgwm156, Xgwm540) 192 индивидуальных растений F2 тритикале и по трем микросателлитным локусам (Xgwm291, Xgwm371, Xgwm595) 95 растений F2 пшеницы. С использованием анализа молекулярной дисперсии (AMOVA) установлено, что все исследованные локусы тритикале вносят статистически значимый вклад в изменчивость параметров андрогенеза in vitro «частота регенерации зеленых растений» и «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений». У мягкой пшеницы локусыXgwm371 иXgwm595 вносят значимый вклад в изменчивость параметров «способность к эмбриогенезу» и «выход новообразований» (локус Xgwm371). Для установления ассоциации между определенной комбинацией аллелей каждого локуса тритикале и пшеницы и способностью к андрогенезу in vitro рассчитывали х2 Пирсона. Установлена значимая связь между наличием аллелей 219 п. н. (Xgwm312), 290 п. н. (Xbarc318), 146 п. н. (Xgwm291), 310 п. н. (Xgwm156), 121 п. н. (Xgwm540) и высокой частотой регенерации зеленых и хлорофилл-дефектных растений тритикале. Для мягкой пшеницы обнаружена связь между наличием аллеля 169 п. н. локусаXgwm371 и высоким выходом новообразований в культуре пыльников in vitro.
Ключевые слова: тритикале, пшеница, х Triticosecale Wittm, Triticum aestivum, гибриды F2, культура пыльников in vitro, параметры андрогенеза in vitro, микросателлитные локусы.
Введение
Зерновые злаки, к которым относятся тритикале (х Triticosecale Wittm.) и пшеница (Triticum aestivum), являются важными сельскохозяйственными культурами во многих странах мира, в том числе и в Республике Беларусь. Выведение высокопродуктивных сортов тритикале и пшеницы считается основной задачей селекции, однако низкое генетическое разнообразие данных культур и большое количество времени, затрачиваемое на создание сорта методами классической селекции, значительно усложняет данный процесс [1, 2]. Одним из способов ускоренного создания новых сортов является использование биотехнологических методов, в частности, культуры пыльников in vitro. Применение данной методики позволяет в сжатые сроки, за один этап, получить полностью гомозиготные линии удвоенных гаплоидов из гетерозиготных
гибридов ранних поколений [3] и на их основе создать новые высокопродуктивные сорта, тогда как при использовании традиционных методов селекции для получения генетически выровненного селекционного материала используется самоопыление в течение многих поколений. Однако повсеместному и широкому применению данного метода препятствует достаточно низкая отзывчивость тритикале и пшеницы в культуре пыльников in vitro. Количество гаплоидных клеток в пыльнике, в зависимости от вида и сорта, составляет от нескольких тысяч до миллионов, но при этом выход гаплоидных растений-регенерантов у злаков часто исчисляется долями процентов [4]. К тому же наблюдается слабая выживаемость регенерантов и высокое количество хлорофилл-дефектных растений, неспособных расти и развиваться вне культуральных условий [5, 6]. Поскольку основным
фактором, определяющим эффективность андрогенеза in vitro, является генотип донорного растения [7-9], одна из важнейших задач исследователей — поиск молекулярно-генетических маркеров, позволяющих на ранних этапах, до введения в культуру in vitro, идентифицировать высоко- и низкоотзывчивые генотипы. Это позволит значительно повысить эффективность метода и сократить затраты труда и ресурсов для получения нового генетического материала.
Микросателлитные повторы, широко распространенные в растительных геномах, являются молекулярными маркерами, применяемыми для идентификации генов, ассоциированных с желательными признаками. Высокий уровень аллельной вариабельности, кодоминантное наследование и возможность автоматического анализа делают их высокоинформативными молекулярными маркерами в таких исследованиях, как генотипирование, картирование или позиционное клонирование генов [10]. Метод, основанный на использовании SSR-маркеров, обладает высокой разрешающей способностью, хорошей воспроизводимостью и достаточно прост в использовании. Его применение для нахождения генов и генетических систем, связанных с высоким эмбриогенным потенциалом в культуре пыльников in vitro, позволяет прогнозировать отзывчивость генотипов, вводимых в культуру клеток и тканей, что ведет к повышению эффективности метода культуры пыльников.
Используемые в данном исследовании расщепляющиеся популяции F2 были созданы нами на основе родительских генотипов тритикале и пшеницы, контрастных по параметрам андрогенеза in vitro. Для подбора родительских пар для скрещивания в культуру пыльников in vitro были введены 23 генотипа тритикале и 22 генотипа пшеницы, оценен их эмбриогенный потенциал и отобраны генотипы тритикале и пшеницы, наиболее различающиеся по значениям параметров андрогенеза in vitro [11-13].
В результате скрещиваний отобранных родительских генотипов нами получено по четыре популяции гибридных растений F2 мягкой пшеницы (DH 48-02-06 х Ростань, DH 52-02-06 х Ростань, Ростань х DH 48-02-06, Ростань х DH 52-02-06) и гексаплоидного
тритикале (DH 3-1-09 х DH 27-1-08-1, DH 27-108-1 х DH 3-1-09, DH 11-2-09 х DH 12-1-09, DH 12-1-09 х DH 11-2-09), которые использовались в данном исследовании.
Для выявления микросателлитных локусов, ассоциированных с отзывчивостью в культуре пыльников in vitro, у родительских генотипов пшеницы и тритикале, контрастных по параметрам андрогенеза in vitro, был проанализирован полиморфизм 35 SSR-локусов (для тритикале) и 20 SSR-локусов (для пшеницы) и выделены полиморфные локусы. Для тритикале полиморфизм выявлен по локусам Xgwm312, Xbarc318, Xgwm291, Xgwm156, Xgwm540; для пшеницы — по локусам Xgwm291, Xgwm595 и Xgwm371 [12, 14-16].
Целью данного исследования являлось выявление связи между аллельными вариантами микросателлитных локусов и параметрами андрогенеза in vitro у тритикале (х Triticosecale Wittm.) и пшеницы (Triticum aestivum) с использованием расщепляющихся гибридных популяций F2.
Материалы и методы
Объектом исследования служили гибриды F2 тритикале (DH 3-1-09 х DH 27-1-08-1, DH 271-08-1 х DH 3-1-09, DH 11-2-09 х DH 12-1-09, DH 12-1-09 х DH 11-2-09) и пшеницы (DH 4802-06 х Ростань, DH 52-02-06 х Ростань, Ростань х DH 48-02-06, Ростань х DH 52-02-06), полученные нами с использованием родительских генотипов, контрастных по параметрам андрогенеза in vitro [11-13].
Для культивирования пыльников срезанные колосья выдерживали в течение 21 дня для тритикале и 7 дней для пшеницы при +4 °С, пыльники изолировали на стадии поздних одноядерных микроспор и культивировали по методике [17]. Отзывчивость в культуре пыльников определяли отдельно для каждого индивидуального растения. Эффективность морфогенетических процессов оценивали по следующим параметрам: «способность к эмбриогенезу»; «способность к регенерации» (наличие хотя бы одного новообразования либо растения-регенеранта считалось как «1», отсутствие — как «0»); «выход новообразований» (эмбриоидов и каллусов) и «выход растений-регенерантов» — процент от числа иноку-лированных пыльников; «частота регенерации
зеленых растений» и «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений» — процент от числа полученных новообразований.
Выделение геномной ДНК проводили из флаговых листьев стандартным фенольно-хлороформным методом [18]. Анализ качества и количества выделенной ДНК проводили
в 1%-ом агарозном геле и на спектрофотометре «Ultrospec 3300 pro» (Amersham Biosciences).
Для индивидуальных растений в популяциях F2 определяли аллельное состояние SSR-локусов, полиморфных у родительских генотипов [12, 14], различающихся по отзывчивости в культуре пыльников in vitro (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика микросателлитных локусов, использованных в исследовании
Локус Культура Размер фрагмента, п. н. Количество аллелей Температура отжига, °С Флуоресцентная метка
Xgwm312 тритикале 195;219 2 60,0 R6G
Xbarc318 тритикале 260;290 2 50,0 R6G
Xgwm291 тритикале 146;170 2 64,0 TAMRA
пшеница ОО ЧО О 2
Xgwm156 тритикале 287; 290; 310 3 60,0 ROX
Xgwm540 тритикале 121; 132 2 57,0 R6G
Xgwm595 пшеница 146; 182 2 64,0 R6G
Xgwm371 пшеница 169;185 2 64,0 ROX
Последовательности праймеров подбирали с использованием базы данных GrainGenes [19]. Для получения анализируемых фрагментов ПЦР с мечеными праймерами к выбранным локусам (табл. 1) проводили в объеме 25 мкл, содержащем из расчета на одну реакцию: MgCl2 — 2 мМ; прямого и обратного праймеров — по 0,2 пМ; дНТФ — 80 мкМ; Taq-полимеразы — 1 ед.; деонизированной стерильной воды — до достижения конечного объема. Концентрация геномной ДНК составляла 100 нг на 25 мкл. Программа амплификации: 94,0 °С — 3 мин; 40 циклов: 94,0 °С — 1 мин, отжиг — 2 мин; 72,0 °С — 10 мин. Температуру отжига выбирали в зависимости от последовательности праймера (табл. 1).
Размеры полученных продуктов амплификации определяли с помощью капиллярного электрофореза, который проводили на генетическом анализаторе 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). В лунки платы вносили 1 мкл полученного ПЦР-продукта, 9 мкл деионизированного формамида и 0,5-1 мкл внутреннего стандарта Orange-500 DNA Size
Standard (NimaGene) в качестве маркера молекулярного веса. Анализ полученных данных осуществляли с помощью программы GeneMapper v.5.0.
Статистическую оценку проводили с использованием программ Microsoft Excel, GenAIEx v.6.5 (Microsoft Corporation, США) и SPSS v.20.0 (IBM, США). Для выявления микросателлитных локусов, позволяющих статистически значимо дифференцировать группы с низкими и высокими значениями параметров андрогенеза in vitro («способность к эмбриогенезу», «способность к регенерации», «выход новообразований», «выход растений-регенерантов», «частота регенерации зеленых растений», «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений»), и расчета вклада каждого локуса в дифференциацию выделенных групп, различающихся по параметрам андрогенеза, проводили анализ молекулярной дисперсии AMOVA (Analysis of Molecular Variance) с помощью GenAIEx v.6.5. Принцип данного метода состоит в расчете генетических дистанций FST как меры диффе-
ренциации субпопуляций (групп), на основании частот встречаемости аллелей по каждому локусу у изучаемых групп. Считали, что локус вносит статистически значимый вклад в диф-ференцировку групп при p <0,05; при этом большим дифференцирующим потенциалом обладает локус с большим значением FST. Для анализа связи между аллельными вариантами исследуемых микросателлитных локусов и способностью к андрогенезу in vitro у растений F2 тритикале и пшеницы прибегали к построению таблиц сопряженности, затем рассчитывали х2 Пирсона с использованием SPSS v.20.0. Уровень статистической значимости p при множественных сравнениях вычисляли экспериментально для каждого сравнения в процессе моделирования, использовали точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали данные при p <0,05.
Результаты и обсуждения
Для идентификации микросателлитных локусов, ассоциированных с параметрами андро-генеза in vitro у мягкой пшеницы и гексаплоид-ного тритикале, растения F2 вводили в культуру пыльников in vitro и оценивали отзывчивость для каждого индивидуального растения. Затем для индивидуальных растений F2 определяли аллельный состав микросателлитных локусов, полиморфных у контрастных по параметрам андрогенеза in vitro родительских генотипов, и анализировали связь между наличием определенного аллеля и параметрами андрогенеза in vitro. Выбор локусов, использованных в исследовании, был обусловлен их расположением на хромосомах, для которых показана ассоциативная связь с процессами андрогенеза in vitro (2А, 2В, 5А, 5В) [20, 21].
Для оценки эмбриогенного потенциала в культуру пыльников in vitro были введены 192 индивидуальных растения F2 из четырех популяций тритикале (DH 3-1-09 х DH 271-08-1, DH 27-1-08-1 х DH 3-1-09, DH 11-209 х DH 12-1-09, DH 12-1-09 х DH 11-2-09), и 95 растений из четырех популяций пшеницы (DH 48-02-06 х Ростань, DH 52-0206 х Ростань, Ростань х DH 48-02-06, Ростань х DH 52-02-06) [12, 14]. В результате каждое растение было отнесено к одной из двух групп, характеризующихся наличием или отсутствием способности к эмбриогенезу и ре-
генерации растений, а также низким или высоким значением параметров андрогенеза in vitro. Для обеих культур по параметру «выход новообразований» низкими считали значения 0-10,0%; высокими — более 10,0%; по параметру «выход растений-регенерантов» низкими считали значения 0-2,0%; высокими — более 2,0%; по параметру «частота регенерации зеленых растений» низкими считали значения 0-2,0%; высокими — более 2,0%. По параметру «частота регенерации хлорофилл-дефек-тных растений» для тритикале низкими считали значения 0-10,0%, высокими — более 10,0%, для пшеницы низкими считали значения 0-5%, высокими — более 5% [22].
Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) изученных микросателлитных локусов образцов тритикале показал статистически значимые различия по частоте встречаемости аллельных вариантов данных локусов между группами генотипов с низкими и высокими значениями параметров андрогенеза in vitro «частота регенерации зеленых растений» и «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений» (табл. 2). Не установлено статистически достоверной разницы по частотам аллелей изученных локусов между группами образцов, различающихся по параметрам андрогенеза in vitro «способность к эмбриогенезу», «способность к регенерации», «выход новообразований», «выход растений-регенерантов».
Согласно данным таблицы 2, все исследованные локусы позволяют дифференцировать образцы с низкой (0-2,0%) и высокой (>2,0%) частотой регенерации зеленых растений, а также образцы с низкой (0-10,0%) и высокой (>10,0%) частотой регенерации хлорофилл-дефектных растений тритикале в культуре пыльников in vitro. В группах с высокой частотой регенерации зеленых и хло-рофилл-дефектных растений аллель 219 п. н. (Xgwm312) встречался соответственно, в 4,03 и 6,08 раз чаще, чем аллель 195 п. н. Также в данной группе преобладали аллели 290 п. н. (Xbarc318), 146 п. н. (Xgwm291), 290 и 310 п. н. (Xgwm156), 121 п. н. (Xgwm540). Аллели 260 п. н. (Xbarc318), 170 п. н. (Xgwm291), 287 п. н. (Xgwm156) и 132 п.н. (Xgwm540) были выявлены только в группах с низкими значениями указанных параметров.
Таким образом, локусы Xgwm312, Xbarc318,
Таблица 2
Идентификация локусов, обладающих дифференцирующим потенциалом по параметрам
андрогенеза in vitro у тритикале
Локус FST; р (уровень значимости) Аллель, п. н. Частоты аллелей в группах, различающихся по параметрам андрогенеза, %
Xgwm312 FST = 0,178; p = 0,005 195 низкая частота регенерации зеленых растений (0-2,0%) высокая частота регенерации зеленых растений (>2,0%)
96,4 3,6
219 85,5 14,5
Xbarc318 FST = 0,136; p = 0,007 260 100,0 0
290 92,4 7,6
Xgwm291 FST = 0,353; p = 0,001 146 88,5 11,5
170 100,0 0
Xgwm156 FST = 0,238; p = 0,001 287 100,0 0
290 89,9 10,1
310 86,7 13,3
Xgwm540 FST = 0,170; p = 0,007 121 91,9 8,1
132 100,0 0
Xgwm312 FST = 0,301; p = 0,002 195 низкая частота регенерации хлорофилл-дефектных растений (0-10,0%) высокая частота регенерации хлорофилл-дефектных растений (>10,0%)
97,4 2,6
219 84,2 15,8
Xbarc318 FST = 0,132; p = 0,018 260 100,0 0
290 91,0 9,0
Xgwm291 FST = 0,346; p = 0,001 146 89,6 10,4
170 100,0 0
Xgwm156 FST = 0,240; p = 0,001 287 100,0 0
290 91,7 8,3
310 86,7 13,3
Xgwm540 FST = 0,166; p = 0,004 121 92,6 7,4
132 100,0 0
Xgwm291, Xgwm156 и Xgwm540 вносят значимый вклад в изменчивость параметров андрогенеза in vitro «частота регенерации зеленых растений» и «частота регенерации хлоро-филл-дефектных растений» у тритикале. При этом, исходя из рассчитанных значений FST, большим потенциалом по дифференциации групп с низкими и высокими значениями частоты регенерации зеленых и хлорофилл-де-фектных растений обладают локусы Xgwm291 и Xgwm156, а наименьшим — локус Xbarc318.
Для индивидуальных растений F2 пшеницы также был проведен анализ молекулярной дисперсии (AMOVA), который показал
статистически значимые различия по частоте встречаемости аллельных вариантов исследуемых локусов в группах генотипов, различающихся по способности к эмбриогенезу, а также в группах, характеризующихся высоким и низким выходом новообразований в культуре пыльников in vitro (табл. 3). Не установлено статистически значимой разницы по частотам аллелей изучаемых локусов между группами образцов, различающихся по параметрам андрогенеза «способность к регенерации», «выход растений-регенерантов», «частота регенерации зеленых растений», «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений».
Таблица 3
Идентификация локусов, обладающих дифференцирующим потенциалом по параметрам
андрогенеза in vitro у пшеницы
Локус FST; р (уровень значимости) Аллель, п. н. Частоты аллелей в группах, различающихся по параметрам андрогенеза, %
Xgwm291 FST = -0,018; р = 1,000 140 отсутствие способности к эмбриогенезу наличие способности к эмбриогенезу
40,5 59,5
168 39,9 60,1
Xgwm371* FST = 0,038; p = 0,030 169 36,4 63,6
185 45,0 55,0
Xgwm595* FST = 0,044, p = 0,024 146 25,5 74,5
182 44,8 55,2
Xgwm291 FST = -0,014; p = 0,999 140 низкий выход новообразований (0-10,0%) высокий выход новообразований (>10,0%)
43,2 56,8
168 47,1 52,9
Xgwm371* FST = 0,048; p = 0,026 169 40,9 59,1
185 53,8 46,3
Xgwm595 FST = 0,003; p = 0,261 146 38,3 61,7
182 49,0 51,0
Примечание. *— локус вносит статистически значимый вклад в дифференцировку образцов
Установлены значимые различия по частоте встречаемости аллельных вариантов локусов Xgwm371 и Xgwm595 и способностью к эмбриогенезу в культуре пыльников in vitro у исследуемых растений F2 мягкой пшеницы. В группе генотипов, проявивших способность к эмбриогенезу, аллели 169 п. н. локуса Xgwm371 и 146 п. н. локуса Xgwm595 встречались, соответственно, в 1,75 и 2,92 раза чаще, чем в группе генотипов, неспособных к эмбриогенезу в культуре пыльников. Полученные данные совпадают с результатами, полученными нами ранее для локуса Xgwm371 о связи аллеля 169 п. н. со способностью к эмбриогенезу in vitro [12].
Локус Xgwm371 также позволяет статистически значимо дифференцировать группы с низким (0-10,0%) и высоким (>10,0%) выходом новообразований: в группе генотипов с высоким выходом новообразований аллель 169 п. н. встречался в 1,44 раза чаще, чем в группе с низким выходом новообразований и в 1,28 раза чаще, чем аллель 185 п. н. (табл. 3).
Для установления ассоциаций между комбинациями аллелей каждого микросателлитного
локуса тритикале и пшеницы и способностью к андрогенезу in vitro строили модели сопряженности для каждого параметра андрогенеза: «способность к эмбриогенезу», «способность к регенерации», «выход новообразований», «выход растений-регенерантов», «частота регенерации зеленых растений», «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений». Используемые модели распределения аллелей показывают, с какой частотой определенные комбинации аллелей встречаются у генотипов в группах с низким или высоким значением определенного параметра андрогенеза. Сравнивали три основные модели распределения аллелей. В модели 1 рассматривали три комбинации аллелей: генотипы несли либо одну из гомозигот, либо гетерозиготу. В модели 2 рассматривали две комбинации аллелей: генотипы, несущие гомозиготу 1, рассматривали отдельно от генотипов, несущих гомозиготу 2 + гетерозиготу. В модели 3 рассматривали две комбинации аллелей, противоположных модели 2: гомозигота 1 + гетерозигота; гомозигота 2. При отсутствии гетерозигот (локус Xgwm291 тритикале) рассматривали модель
с двумя гомозиготами. Если локус имел более двух аллелей (локус Xgwm156 тритикале), то рассматривали дополнительные варианты комбинаций аллелей. В случае, когда статистически достоверными являлись все три модели для одного микросателлитного локуса, проводили попарное сравнение аллельного соотношения внутри моделей.
Для тритикале установлены статистически значимые различия по частоте встречаемости определенных аллельных комбинаций микросателлитных локусов между группами генотипов с низкими и высокими значениями параметров андрогенеза in vitro «частота регенерации зеленых растений» и «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений». В таблице 4 показаны модели распределения аллелей, для которых уровень значимости p <0,05.
При рассмотрении различных моделей распределения аллелей у индивидуальных растений F2 тритикале получены данные, сви-
детельствующие о наличии статистически значимой связи между аллельным состоянием микросателлитных локусов Xgwm312, Xbarc318, Xgwm291, Xgwm156, Xgwm540 и параметрами андрогенеза in vitro «частота регенерации зеленых растений» и «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений».
Установлено, что аллель 219 п. н. локуса Xgwm312 ассоциирован с высокой частотой формирования зеленых и хлорофилл-дефек-тных растений (рис. 1).
При наличии данного аллеля в гомозиготном состоянии (генотип 219/219) количество растений, попадающих в группу с высокой частотой регенерации зеленых растений, увеличивалось как при рассмотрении модели 1 распределения аллелей — с 2,3% (генотип 195/195) до 20,0% (рис. 1А), так и модели 3 — с 4,5% (генотип 195/195 и 195/219) до 20,0% (рис. 1Б). При этом при рассмотрении модели 2 количество генотипов, попадающих в группу с высокой частотой регенерации зеленых растений, уве-
Таблица 4
Оценка связи между аллельным составом микросателлитных локусов и частотой регенерации зеленых и хлорофилл-дефектных растений тритикале в культуре пыльников in vitro
Комбинация аллелей Частоты комбинаций аллелей в группах, % X2 Р Частоты комбинаций аллелей в группах, % X2 Р
низкая частота регенерации зеленых растений (0-2,0%) высокая частота регенерации зеленых растений (>2,0%) низкая частота регенерации хлорофилл- дефектных растений (0-10%) высокая частота регенерации хлорофилл- дефектных растений (>10,0%)
Xgwm312
195/195 97,7 2,3 10,775 0,003 99,2 0,8 17,610 0,0001
195/219 89,1 10,9 87,0 13,0
219/219 80,0 20,0 80,0 20,0
195/195 97,7 2,3 9,029 0,018 99,2 0,8 16,501 0,0002
195/219 + 219/219 86,9 13,1 85,2 14,8
195/195 + 195/219 95,5 4,5 6,135 0,044 96,0 4,0 7,211 0,033
219/219 80,0 20,0 80,0 20,0
Xbarc318
260/260 100,0 0 6,546 0,041 100,0 0,0 5,918 0,063*
260/290 100,0 0 100,0 0,0
290/290 91,1 8,9 91,9 8,1
260/260 + 260/290 100,0 0 6,546 0,008 100,0 0,0 5,918 0,015
290/290 91,1 8,9 91,9 8,1
Окончание таблицы 4
Комбинация аллелей Частоты комбинаций аллелей в группах, % х2 Р Частоты комбинаций аллелей в группах, % х2 Р
низкая частота регенерации зеленых растений (0-2,0%) высокая частота регенерации зеленых растений (>2,0%) низкая частота регенерации хлорофилл- дефектных растений (0-10%) высокая частота регенерации хлорофилл- дефектных растений (>10,0%)
Xgwm291
146/146 88,5 11,5 11,669 0,001 86,9 10,4 10,549 0,002
170/170 100,0 0 100,0 0
Xgwm156
290/290 93,5 6,5 14,138 0,0004 93,5 6,5 12,965 0,001
290/310 85,1 14,9 89,4 10,6
310/310 88,9 11,1 83,3 16,7
287/287 100,0 0 100,0 0
290/310 85,1 14,9 15,034 0,0003 89,4 10,6 10,583 0,003
287 100,0 0 100,0 0
310 88,9 11,1 10,857 0,024 83,3 16,7 16,432 0,003
287 100,0 0 100,0 0
Xgwm540
121/121 89,9 10,1 8,885 0,008 90,8 9,2 8,033 0,018
121/132 100,0 0 100,0 0
132/132 100,0 0 100,0 0
121/121 89,9 10,1 8,885 0,003 90,8 9,2 8,033 0,005
121/132 + 132/132 100,0 0 100,0 0
Примечание. *— значение p близко к границе статистической значимости
личивалось с 2,3% (генотип 195/195) только до 13,1% (генотипы 195/219 и 219/219) (табл. 4).
При анализе параметра «частота регенерации хлорофилл-дефектных растений» установлено, что количество растений, попадающих в группу с высокими значениями данного параметра, также увеличивалось с 0,8 (генотип 195/195) до 20,0% (генотип 219/219; модель 1) Наличие аллеля 195 п. н. статистически значимо приводило к снижению данных параметров (модель 2).
Для остальных исследованных локусов также определены аллели, ассоциированные с высокой частотой регенерации зеленых и хлорофилл-дефектных растений: 290 п. н. (Xbarc318), 146 п. н. (Xgwm291), 310 п. н. (Xgwm156) и 121 п. н. (Xgwm540) (табл. 4).
Аллели 260 п. н. (Xbarc318), 170 п. н. (Xgwm291), 287 п. н. (Xgwm156), 132 п. н.
(Xgwm540) в наших исследованиях обнаруживались только у растений с низкой частотой формирования зеленых и хлорофилл-дефек-тных растений.
Для пшеницы выявлены статистически значимые различия по частоте встречаемости определенных аллельных комбинаций микросателлитных локусов между группами генотипов с низким и высоким выходом новообразований (табл. 5).
Установлено, что аллель 169 п. н. локуса Xgwm371, расположенного на длинном плече хромосомы 5В, ассоциирован с высоким (>10,0%) выходом новообразований (рис. 2).
В гомозиготном состоянии данный аллель в 2,6 раза чаще встречался у образцов с высоким выходом новообразований как при рассмотрении модели 2 распреде-
195/195
195/219
219/219
195/195 + 195/219
■ низкая частота регенерации зеленых растений (0-2,0%) Комбинация аллелей
высокая частота регенерации зеленых растений (> 2,0%)
80,0%
219/219
Рис. 1. Частота различных комбинаций аллелей локусаXgwm312 в исследованных группах растений тритикале:
А — модель 1, Б — модель 3
Таблица 5
Оценка связи между аллельным составом микросателлитных локусов и выходом новообразований пшеницы в культуре пыльников in vitro
Комбинация аллелей Частоты комбинаций аллелей в группах, % х2 Р
низкий выход новообразований (0-10%) высокий выход новообразований (>10%)
Xgwm291
140/140 42,9 57,1 0,104 1,000
140/168 44,4 55,6
168/168 47,2 52,8
140/140 42,9 57,1 0,079 1,000
140/168 + 168/168 46,9 53,1
140/140 + 140/168 43,5 56,5 0,098 0,813
168/168 47,2 52,8
Xgwm371
169/169 27,6 72,4 6,037 0,052*
169/185 55,8 44,2
185/185 50,0 50,0
169/169 27,6 72,4 5,889 0,025
169/185 + 185/185 54,5 45,5
169/169 + 169/185 45,7 54,3 0,090 0,780
185/185 50,0 50,0
Окончание таблицы 5
Комбинация аллелей Частоты комбинаций аллелей в группах, % X2 Р
низкий выход новообразований (0-10%) высокий выход новообразований (>10%)
Xgwm595
146/146 25,0 75,0 2,609 0,293
146/182 52,2 47,8
182/182 48,3 51,7
146/146 25,0 75,0 2,510 0,134
146/182 + 182/182 49,4 50,6
146/146 + 146/182 42,9 57,1 0,267 0,673
182/182 48,3 51,7
Примечание. *— значение p близко к границе статистической значимости
ления аллелей (рис. 2), так и модели 1, для которой значение точного критерия Фишера находилось на границе статистической значимости (p = 0,052) (табл. 5). Присутствие аллеля 185 п. н. (модель 2, генотипы 169/185 и 185/185) приводило к уменьшению количества растений с высоким выходом новообразований на 26,9%, по сравнению с генотипом 169/169.
Таким образом, с помощью предложенных нами моделей выявлены аллели микросателлитных локусов тритикале и пшеницы, ассоциированные с высокими значениями параметров андрогенеза in vitro. Для тритикале аллели 219 п. н. (локус Xgwm312),
290 п. н. (Xbarc318), 146 п. н. (Xgwm291), 310 п. н. (Xgwm156), 121 п. н. (Xgwm540) ассоциированы с высоким выходом зеленых и хлоро-филл-дефектных растений-регенерантов. Для пшеницы аллель 169 п. н. локуса Xgwm371 ас -социирован со способностью к эмбриогенезу и высоким выходом новообразований. Также данный аллель, как и аллель 146 п. н. локуса Xgwm595, ассоциирован со способностью к эмбриогенезу. Поскольку в исследовании использовались микросателлитные локусы, расположенные на хромосомах 2А, 2В, 5А, 5В, для которых с использованием анеуплоидных и замещенных линий установлена связь с контролем процессов эмбриогенеза и регенерации растений в культуре пыльников in vitro [20,
21], можно предположить, что данные локусы тесно сцеплены с QTL, ассоциированными с соответствующими параметрами андрогенеза,
и могут служить маркерами для отбора высокоотзывчивых генотипов тритикале и пшеницы.
Также в ходе исследования нами были выявлены аллели микросателлитных локусов, ассоциированные со снижением отзывчивости в культуре пыльников in vitro: аллели 195 п. н. (локус Xgwm312), 260 п. н. (Xbarc318), 170 п. н. (Xgwm291), 287 п. н. (Xgwm156), 132 п. н. (Xgwm540) тритикале ассоциированы со снижением частоты реге-
Рис. 2. Частота различных комбинаций аллелей локуса Xgwm371 в исследованных группах растений пшеницы (модель 2)
нерации зеленых и хлорофилл-дефектных растений; аллели 185 п. н. (Xgwm371), 182 п. н. (Xgwm595) пшеницы ассоциированы со снижением способности к эмбриогенезу и выходу новообразований (аллель 185 п. н. локуса Xgwm371). Данные аллели также могут быть использованы в качестве маркеров при скрининге генотипов перед введением в культуру пыльников in vitro, что позволит либо исключить низкоотзывчивые генотипы, либо, в том случае, если генотип представляет высокую селекционную ценность, увеличить объем пыльников, вводимых в культуру in vitro, для повышения вероятности получения эм-бриоидов и зеленых растений-регенерантов тритикале и пшеницы.
Следует отметить, что локусы, ассоциированные в нашем исследовании с частотой регенерации зеленых растений у тритикале, одновременно были ассоциированы и с частотой регенерации хлорофилл-дефектных растений. Подобные результаты получены и другими авторами, в частности, Munoz-Amatriarn с соавторами [23] идентифицировали QTL, связанные с формированием хлорофилл-дефектных растений на хромосомах 3H и 5H ячменя в том же положении, что и QTL, ассоциированные с формированием зеленых растений-регенерантов. Krzewska с соавторами [24] обнаружили, что один из QTL, найденных ими на хромосоме 4R тритикале и ассоциированных с формированием хлорофилл-дефектных растений, расположен в той же области, что и QTL, связанный со способностью к регенерации зеленых растений. Одной из причин может являться то, что на формирование хло-рофилл-дефектных растений, помимо генотипа, значительное влияние оказывают внешние условия, такие как тип и длительность предобработки колосьев, условия культивирования, размер и возраст эмбриогенных структур, пересаживаемых на регенерационную среду и ряд других факторов [6, 9, 25].
Заключение
С использованием расщепляющихся популяций F2 гексаплоидного тритикале и мягкой пшеницы, полученных от скрещивания родительских генотипов, контрастных по параметрам андрогенеза in vitro, выявлены микросателлитные локусы, ассоциирован-
ные с отзывчивостью в культуре пыльников. У тритикале локусы Xgwm312, Xbarc318, Xgwm291, Xgwm156, Xgwm540 ассоциированы с параметрами «выход зеленых растений» и «выход хлорофилл-дефектных растений». У пшеницы локусы Xgwm371 и Xgwm595 ассоциированы со способностью к эмбриогенезу in vitro; локус Xgwm371 ассоциирован с параметром «выход новообразований». Данные микросателлитные локусы могут быть использованы в качестве маркеров для выявления высоко- и низкоотзывчивых генотипов тритикале и пшеницы на ранних стадиях, до введения в культуру пыльников, что значительно сократит объем прорабатываемого материала и повысит эффективность данной методики.
Список использованных источников
1. Bread wheat: a role model for plant domestication and breeding [Electronic resource] / E. Venske [et al.] // Hereditas. - 2019. - Vol. 156. Art.16. - Mode of access: https://hereditasjournal. biomedcentral.com/articles/10.1186/s41065-019-0093-9#citeas. - Date of access: 04.01.2021.
2. Крупин, П. Ю. Использование генетического потенциала многолетних дикорастущих злаков в селекционном улучшении пшеницы / П. Ю. Крупин, М. Г. Дивашук, Г. И. Карлов // Сельскохозяйственная биология. - 2019. -Т 54, № 3. - С. 409-425.
3. Сельдимирова, О. А. Факторы, влияющие на отзывчивость в культуре in vitro изолированных пыльников злаков / О. А. Сельдимиро-ва, В. И. Никонов // Экобиотех. - 2021. - Т 4, № 2. - С. 107-120.
4. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы / Н. Н. Круглова [и др.]. - М.: Наука.
- 2005. - 99 с.
5. Картель, Н. А. Биотехнология в растене-водстве / Н. А. Картель, А. В. Кильчевский. -Мн., 2005. - 310 с.
6. Орлов, П. А. Функциональная геномика морфогенеза / П. А. Орлов. - Мн., 2005. - 518 с.
7. Ahmadi, B. In vitro androgenesis: spontaneous vs. artificial genome doubling and characterization of regenerants / B. Ahmadi, H. Ebra-himzadeh // Plant Cell Rep. - 2020. - Vol. 39.
- P. 299-316.
8. Development of in vitro anther culture for doubled haploid plant production in indica rice (Oryza sativa L.) genotypes [Electronic resource]
/ C. Lantos [et al.] // Plants. - 2023. - Vol. 12(9).
- Art. 1 774. - Mode of access: https://www.mdpi. com/2223-7747/12/9/1774. - Date of access: 18.01.2024.
9. Круглова, Н. Н. Инновационная биотехнология андроклинной гаплоидии пшеницы на основе комплекса эмбриологических и цитофизиологических данных / Н. Н. Круглова // ЭКОБИОТЕХ. - 2019. - Т. 2, № 3 - С. 234-245.
10. Омашева, М. Е. Молекулярные маркеры. причины и последствия ошибок генотипи-рования / М. Е. Омашева, К. П. Аубакирова, Н. А. Рябушкина // Eurasian Jornal of Applied Biotechnology. - 2013. - № 4. - С. 20-28.
11. Лагуновская, Е. В. Эффективность индукции андрогенеза in vitro у гексаплоидного тритикале / Е. В. Лагуновская // Настоящее и будущее биотехнологии растений: материалы Междунар. науч. конф., Минск, 24-26 мая 2023 г. / Национальная академия наук Беларуси; Центральный ботанический сад; Отделение биологических наук НАН Беларуси; Совет ботанических садов стран СНГ при МААН; редкол.: В. Н. Решетников [и др.]. - Минск : ИВЦ Минфина, 2023. - С. 130.
12. Лагуновская, Е. В. Идентификация микросателлитных локусов, ассоциированных с эмбриогенным потенциалом у генотипов пшеницы в культуре пыльников in vitro // Е. В. Лагуновская // Молекулярная и прикладная генетика / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси ; редкол.
A. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2021. -Т. 31. - С. 102-113.
13. Орлов, П. А. Генетические механизмы пыльцевого эмбриогенеза и его использование в селекции растений / П. А. Орлов, Е. В. Антоненко // Сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси. - Минск, 2007. - Т. 5 : Молекулярная и прикладная генетика. - С. 44-71.
14. Лагуновская, Е. В. Влияние аллелей SSR локусов на отзывчивость в культуре пыльников in vitro у генотипов тритикале // Биотехнология: достижения и перспективы развития: сборник материалов V международной научно-практической конференции, УО «Полесский государственный университет», г. Пинск, 25-26 ноября 2021 г. / Министерство образования Республики Беларусь [и др.]; редкол.:
B. И. Дунай [и др.]. - Пинск: ПолесГУ, 2021.
- С. 32-36.
15. Антоненко, Е. В. SSR анализ локусов 5А хромосомы мягкой пшеницы у генотипов, контрастных по отзывчивости в культуре пыльников / Е. В. Антоненко // «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии» в рамках фестиваля науки». Материалы научных докладов участников всероссийской молодежной конференции в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (Уфа, Россия, 2428 сентября 2012 г.). - Уфа: Башкирский ГАУ, 2012. - С. 3-9.
16. Лагуновская, Е. В. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов хромосом 2А и 2В у удвоенных гаплоидов тритикале / Е. В. Лагуновская, О. И. Зайцева // Экологическая стабилизация аграрного производства. Научные аспекты решения проблемы: сб. докл. Междунар. науч.-практ. конф. мол. уч. и спец., 18-19 марта 2015 г., Саратов, Россия / под общ. ред. д.с.-х.н. А. И. Прянишникова. - Саратов, 2015. - С. 68-72.
17. Лагуновская, Е. В. Эффективность использования различных типов индукционных питательных сред при культивировании пыльников гексаплоидного тритикале // Е. В. Лагу-новская, О. И. Зайцева, В. А. Лемеш // Факторы экспериментальной эволюции организмов: Сб. науч. трудов / Национальная академия наук Украины, Институт молекулярной биологии и генетики, Укр. о-во генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова; редкол.: В. А. Кунах (гл. ред.) [и др.]. - К.: Укр. о-во генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, 2019. - Т. 25. - С. 260-265.
18. Дорохов, Д. Б. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов / Д. Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. -1997. - Т. 33, № 4. - С. 443-450.
19. GrainGenes [Electronic resource]. - Mode of access: https://wheat.pw.usda.gov/GG3/. -Date of access: 19.01.2024.
20. Abd El-Fatah, B. E. S. Genetic analysis of anther culture response and identification of QTLs associated with response traits in wheat (Triticum aestivum L.). / B. E. S. Abd El-Fatah, M. A. Sayed, S. A. El-Sanusy // Mol Biol Rep. -2020. - Vol. 47. - P. 9 289-9 300.
21. Torp, A. M. Chromosomal region associated with green plant regeneration in wheat
(Triticum aestivum L.) anther culture / A. M. Torp, A. L. Hansen, S. B. Andersen // Euphytica. -2001. - Vol. 119. - P. 377-387.
22. Мозгова Г. В. Использование пыльцевого эмбриогенеза в селекционном процессе : метод. рекомендации / Г. В. Мозгова, П. А. Орлов. - Минск: РУП «НПЦ НАН Беларуси по механизации сельского хозяйства», 2008. - 31 с.
23. Identification and validation of QTLs for green plant percentage in barley (Hordeum vulgare L.) anther culture / M. Munoz-Amatriam
[et al.] // Mol Breeding. - 2008. - Vol. 22. -P. 119-129.
24. Quantitative trait loci associated with androgenic responsiveness in triticale (x Triticosecale Wittm.) anther culture / M. Krzewska [et al.] // Plant Cell Reports. - 2012.
- Vol. 31. - P. 2 099-2 108.
25. Bolibok, H. Genetic mapping of QTLs for tissue-culture response in plants / H. Bolibok, M. Rakoczy-Trojanowska // Euphytica. - 2006.
- Vol. 149. - P. 73-83.
E. V. Lagunovskaya
MICROSATELLITE MARKERS ASSOCIATED WITH IN VITRO ANDROGENESIS PARAMETERS IN TRITICALE (x TRITICOSECALE WITTM.) AND WHEAT (TRITICUM AESTIVUM)
State Scientific Institution
“Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus”
27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: e.antonenko@igc.by
To identify microsatellite loci and alleles associated with in vitro androgenesis parameters in hexaploid triticale (x Triticosecale Wittm.) and soft wheat (Triticum aestivum), screening was carried out by 5 microsatellite loci (Xgwm312, Xbarc318, Xgwm291, Xgwm156 andXgwm540) of 192 individual F2 triticale plants and by 3 microsatellite loci (Xgwm291,Xgwm371 andXgwm595) of 95 F2 wheat plants. Using the analysis of molecular variance (AMOVA), it was found that all the triticale loci studied make a statistically significant contribution to the variability of the in vitro androgenesis parameters “the frequency of green plants regeneration” and “the frequency of chlorophyll-deficient plants regeneration”. In soft wheat, theXgwm371 andXgwm595 loci make a significant contribution to the variability of the androgenesis parameter “the ability to embryogenesis” and the parameter “the success of embryoids and callus formation” (locus Xgwm371). To determine the association between a specific combination of alleles at each triticale and wheat locus and the ability to in vitro androgenesis, Pearson's x2 was calculated. A significant relationship was revealed between the presence of alleles 219 bp (locus Xgwm312), 290 bp (locus Xbarc318), 146 bp (locus Xgwm291), 310 bp (locus Xgwm156) and 121 bp (locus Xgwm540) and the high frequency of green and chlorophyll-deficient plants’ regeneration; for soft wheat, a relationship was found between the presence of the 169 bp allele of the locus Xgwm371 and the high output of embryoids in the in vitro anther culture.
Keywords: triticale, wheat, F2 hybrids, in vitro anther culture, in vitro androgenesis parameters, microsatellite loci.
Дата поступления в редакцию: 06 февраля 2024 г.
