CC BY
4Е.В. Антоненко, В.А. Лемеш, Е.М. Кременевская, Н.М. Ермишина, О.И. Зайцева
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ЛОКУСОВ ХРОМОСОМЫ 5А У ПШЕНИЦЫ И ТРИТИКАЛЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ SSR-МАРКЕРОВ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Использование клеточных технологий, основанных на культивировании in vitro органов и тканей высших растений, позволяет значительно облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс. Метод культуры пыльников, достаточно широко используемый в настоящее время, имеет значительные перспективы, поскольку может быть направлен не только на создание линий удвоенных гаплоидов, но и на предотвращение элиминации рекомбинантных гамет под давлением естественного стабилизирующего отбора [1, 2]. Именно на стадии гаметогенеза действие естественного отбора приводит к значительному сужению спектра доступной селекционеру генотипической изменчивости, а также обуславливает формирование средних по адаптивности форм. В условиях культуры in vitro возможно не только вовлечение в искусственный отбор огромного числа генотипов, но и создание высокой жесткости отбора в строго контролируемых условиях [3, 4].
Использование биотехнологических подходов представляется весьма перспективным для ускоренного создания новых сортов важнейших сельскохозяйственных культур - пшеницы и тритикале. Пшеница (род Triticum) является одной из наиболее широко выращиваемых продовольственных культур, занимая третье место после кукурузы и риса, и основной зерновой культурой многих стран мира. Из общего мирового производства зерна на долю пшеничного приходится около 27%. Особое положение пшеницы среди злаков как генетического объекта обусловлено различным уровнем плоидности генотипа и их широкой адаптацией в различных экологических условиях. Тритикале (х Triticosecale Wittm.) -еще одна ценная злаковая культура, полученная в результате объединения геномов пшеницы и ржи, с уникальным сочетанием целого ряда хозяйственно-биологических особенностей,
присущих исходным видам. К их числу относятся высокий потенциал урожайности зерна и зеленой массы, повышенные адаптивные свойства (высокая зимостойкость, засухоустойчивость, нетребовательность к почвам), комплексный иммунитет к грибным заболеваниям, высокое содержание лизина и крахмала в зерне, а также основных питательных веществ в зеленой массе, отсутствие мякинной оболочки и т.д. [5].
Однако, несмотря на достигнутые успехи, обе культуры нуждаются в серьезной селекционной доработке. В частности, недостаточно пластичные сорта тритикале иногда снижают продуктивность даже при небольших погодных отклонениях [1], а низкая пластичность сортов связана, прежде всего, с ограниченным генетическим разнообразием исходного материала.
Для улучшения сортов и селекционных форм необходимо обогащать генофонд этих культур и повышать эффективность их селекции различными, в том числе и биотехнологическими, методами. Сложность заключается в том, что злаки, по сравнению с другими сельскохозяйственными растениями, характеризуются особенно низкой способностью к пролиферации в условиях in vitro [6, 7]. Хотя у некоторых из них, в частности рода Hordeum, выход гаплоидных растений-регенерантов достаточно высок [8, 9], для большинства видов получение гаплоидов представляет собой весьма трудоемкий процесс. Масштабы использования биотехнологических подходов при создании линий удвоенных гаплоидов остаются ограничеными, в том числе и из-за того, что до настоящего времени не идентифицированы гены, контролирующие признаки, характеризующие способность растений к перестройке морфогенетических процессов в культуре гаметофитных тканей и последующей регенерации растений.
Анализ литературы свидетельствует о том, что имеются лишь отрывочные данные о генетическом контроле отзывчивости растений к культивированию тканей, в частности, о генах, контролирующих пыльцевой эмбриогенез. Tuvesson et al., определяя частоту регенерации зеленых растений в культуре пыльников, донором которых были родительские формы пшеницы и гибриды, полученные путем реци-прокных скрещиваний, установили, что генотип определяет 85% изменчивости по данному признаку [10].
Исследование процессов пыльцевого эмбриогенеза in vitro у гибридов первого поколения, реципрокных гибридов и аллоплазма-тических линий позволило установить, что у пшеницы, ячменя, риса, тритикале основные признаки андрогенеза (частота возникновения эмбриогенных структур, каллусов, регенерация альбиносных и зеленых растений и их соотношение) наследуются независимо друг от друга. Для культуры пыльников пшеницы и ячменя был отмечен, в основном, аддитивный тип взаимодействия генов, контролирующих признак «выход эмбриоидов» и, как правило, эпистатический контроль регенерационной способности. Анализ результатов диаллель-ных скрещиваний дал возможность предположить участие двух генов в индукции эмбриои-дов и 1-2 генов - в контроле регенерационной способности растений [11]. Tuvesson et al. показали, что на частоту возникновения потенциальных зеленых структур в культуре пыльников пшеницы влияют два или более генов [10].
В настоящее время для определения локализации генов используется ряд различных молекулярно-генетических маркеров. Наиболее широко в исследованиях генетического полиморфизма применяются микросателлиты, широко распространенные в эукариотических геномах и представляющие собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК.
Среди злаков микросателлиты достаточно хорошо изучены и широко используются в качестве молекулярных маркеров у представителей родов, имеющих важное сельскохозяйственное значение, таких, как пшеница (Triticum L), рожь (Secale L.), ячмень (Horde-um L.). У злаков на повторяющиеся последовательности приходится от 15% до 80% генома,
в частности, молекулярно-генетическая карта T. aestivum содержит более 1500 SSR-маркеров [12, 13]. Они могут образовывать тандемные кластеры либо иметь дисперсную локализацию в геноме.
Согласно общепринятой точке зрения, полиморфизм микросателлитов обусловлен ошибками (эффект «проскальзывания») в процессе репликации или репарации ДНК [14]. Средний темп мутирования динуклеотидных повторов оценивают примерно в 6,9*10-4 [15], хотя эти оценки могут существенно различаться [16]. Аллельные варианты микросателлитного локу-са оцениваются как продукты амплификации разной длины (разное количество повторов) при использовании пары праймеров к его флангам. Для таких локусов типичен высокий уровень полиморфизма (мутируют в 1000 раз чаще, чем структурные гены) и наличие специфических механизмов возникновения аллельных вариантов (ошибки репликации, ошибки кроссингове-ра). По микросателлитным локусам обнаруживается высокий уровень гетерозиготности [17].
Таким образом, несмотря на то, что индукция пыльцевого эмбриогенеза у растений лежит в основе многих современных биотехнологий, эффективность применения этого метода существенно снижена. Одной из причин является тот факт, что хотя в последнее время появляется все больше научных работ, посвященных поиску генетических маркеров, связанных с индукцией морфогенеза в культуре in vitro, информация о возможной локализации генов, отвечающих за процесс реализации программы пыльцевого эмбриогенеза in vitro достаточно противоречива. Не созданы и информативные молекулярно-генетические маркеры, необходимые для их картирования. Дополнение метода пыльцевого андрогенеза эффективными приемами обнаружения, сохранения и оценки ценных генотипов позволит расширить его применение в селекции растений.
В связи с этим, целью данного научного исследования является поиск молекулярных маркеров генов пшеницы, связанных с процессом морфогенеза в культуре in vitro, для последующего определения их хромосомной локализации и изучение возможности использования маркеров, разработанных для пшеницы для аналогичного исследования генома тритикале.
Материалы и методы
Объектом исследования являлись 2 сорта мягкой яровой пшеницы белорусской селекции (Ростань, Рассвет), обладающие низкой андрогенетической способностью в культуре пыльников, и 2 линии удвоенных гаплоидов мягкой яровой пшеницы (Dh 52-02-06, Dh 4802-06), полученные методом культуры пыльников в лаборатории генетики и клеточной инженерии растений ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» и показавшие высокий андрогенетический потенциал в культуре in vitro, а также 65 растений отдаленных гибридов F4 и F5 гексаплоидного тритикале и мягкой пшеницы и их родительские формы: тритикале (сорта: Лана, Лотас, сортообразец КСИ 18/05) и пшеница (сорт Рассвет, сорто-образцы: Р-2, Р-19). Гибриды были представлены в следующих комбинациях:
1) Лотас х Р-2 (F4) - 3 растения;
2) КСИ 18/05 х Ростань (F4) - 10 растений;
3) КСИ 18/05 х Ростань (F5) - 36 растений;
4) Лана х Р19 (F5) - 6 растений;
5) Лотас х Рассвет (F4) - 10 растений.
Растения выращивали на экспериментальном поле Биологической опытной станции Института генетики и цитологии НАН Беларуси. Образцы высевались вручную. Посев осуществлялся в трех повторностях. Площадь учетной делянки - 1м2. Высевали 5 рядов по 20 зерен на ряд для пшеницы и 15 зерен для тритикале, ширина междурядий - 20 см.
Молекулярно-генетическая оценка аллельно-го состава генов. Выделение ДНК. Выделение ДНК проводили из листьев растений пшеницы по методике Дорохова и Клоке [18] с модификациями в 5 повторностях. Около 100 мг навески свежих листьев тщательно растирали до гомогенного состояния непосредственно в микропробирке объемом 2 мл с добавлением 400 мкл экстракционного буфера и инкубировали 15 минут при 65 ° С и 5 минут на ледяной бане. Супернатант отделяли путем центрифугирования в течение 10 мин при 12000g. ДНК очищали в 400 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, затем - в 400 мкл смеси хлороформ-изоамиловый спирт. Для осаждения ДНК в пробирки с супернатантом добавляли двойной объем 96% этилового спирта, охлажденного при -20 °С и оставляли пробирки при +4 °С на 20 ч. Осадок промывали сначала 70%-ым, затем 96%-ым этиловым спиртом, охлажденными до -20оС и подсушивали. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл стерильного ТЕ-буфера. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре и1й^рес 3300рго.
Для анализа полиморфизма использовали праймеры к микросателлитным локусам, расположенным на 5 хромосоме А генома мягкой яровой пшеницы, указанные в табл. 1. Последовательности праймеров и условия проведения ПЦР подобраны с использованием базы данных GrainBase 2.0 [19].
Таблица 1
Последовательности праймеров к микросателлитным локусам, расположенным на хромосоме 5А мягкой пшеницы
Локус Последовательность праймеров
Xgwm304 5' AGGAAACAGAAATATCGCGG 3' 5' AGGACTGTGGGGAATGAATG 3'
Xgwm415 5' GATCTCCCATGTCCGCC 3' 5' CGACAGTCGTCACTTGCCTA 3'
Xgwm154 5' TCACAGAGAGAGAGGGAGGG 3' 5' ATGTGTACATGTTGCCTGCA 3'
Xgwm293 5' TACTGGTTCACATTGGTGCG 3' 5' TCGCCATCACTCGTTCAAG 3'
Xgwm205 5' CGACCCGGTTCACTTCAG 3' 5' AGTCGCCGTTGTATAGTGCC 3'
Продолжение табл. 1
Локус Последовательность праймеров
Xgwm156 5' CCAACCGTGCTATTAGTCATTC 3' 5' CAATGCAGGCCCTCCTAAC 3'
Xgwm595 5' GCATAGCATCGCATATGCAT 3' 5' GCCACGCTTGGACAAGATAT 3'
Xgwm186 5' GCAGAGCCTGGTTCAAAAAG 3' 5' CGCCTCTAGCGAGAGCTATG 3'
Xgwm126 5' CACACGCTCCACCATGAC 3' 5' GTTGAGTTGATGCGGGAGG 3'
Xgwm291 5' CATCCCTACGCCACTCTGC 3' 5' AATGGTATCTATTCCGACCCG 3'
Программа для проведения ПЦР: Для праймеров к локусам Xgwm304, Xg-wm415, Xgwm154, Xgwm293:
3 минуты при 94 °C; 1 минута при 94 °C, 1 минута при 55 °C, 2 минуты при 72 °C (45 циклов); 10 минут 72 °C [19].
Для праймеров к локусам Xgwm205, Xgwm156, Xgwm595, Xgwm186, Xgwm126, Xgwm291:
Результаты
Чтобы полностью понять механизмы индуцированного андрогенеза, необходимо идентифицировать гены, участвующие в перестройке программы развития со спорофитного на гаме-тофитный путь развития. В настоящее время информация по этому вопросу крайне ограничена. Решить эту проблему могут современные методы картирования геномов. Одним из них является метод определения сцепления микросателлитных маркеров и исследуемых признаков в популяциях родителей и гибридов второго поколения, позволяющий определить хромосомную локализацию целевого гена с точностью до нескольких сМ [20].
Выявлено, что на эффективность индукции каллуса в культуре пыльников пшеницы оказывают влияние хромосомы 2А, 2В, 4В, 6D [21, 22, 23]. Анеуплоидный анализ обнаружил влияние отдельных плеч (L - long, S - short) хромосом 1BS, 1BL, 3AS, 3AL, 5AS, 5AL, 5BS, 5BL, 7DS, 7DL на частоту эмбриогенеза в культуре пыльников мягкой пшеницы. При этом было показано, что наличие практически всех
3 минуты при 94 °C; 1 минута при 94 °C, 1 минута при 60 °C, 2 минуты при 72 °C (45 циклов); 10 минут 72 °C [19].
Электрофорез полученных продуктов амплификации проводили в 6% полиакриламидном геле при напряжении 40-100 В. Окраска геля проводилась в растворе бромистого этидиума. Размер полученных фрагментов рассчитывался с использованием программы Quantum-Capt.
и обсуждение
перечисленных хромосомных плеч стимулирует выход эмбриоидов, и только 1BS и 1BL -снижают [21]. В работе Agache et al. с использованием моносомиков сорта Chinese Spring по хромосоме 1D и линий, полученных при замещении хромосомы 5B или плеча 5BL сорта Chinese Spring в шесть других сортов, показано, что гены, расположенные на 1D хромосоме и 5BL хромосомном плече Chinese Spring, увеличивают частоту индукции эмбриогенеза [11].
В культуре пыльников мягкой пшеницы сорта Chinese Spring геном А достоверно влияет на регенерацию зеленых растений, геном В - на общую регенерацию и формирование альбиносных растений-регенерантов, геном D - на все перечисленные показатели [22]. Использование гибридов F гетерозиготных по 1B хромосоме, позволило выявить, что увеличение общей регенерационной способности происходит в присутствии 1В/Ж замещений в хромосомном наборе мягкой пшеницы. При этом отсутствие плеч 1BL и 1BS не изменяет общую регенерационную способность рас-
тений, в то время как присутствие 1RS плеча стимулирует увеличение частоты образования растений-регенерантов [11]. В культуре пыльников мягкой пшеницы показано, что гены хромосомы 2D способствуют увеличению выхода зеленых растений-регенерантов, а гены хромосомы 1BL - альбиносных [23].
В последнее время появляется все больше работ, посвященных поиску генетических маркеров, связанных с процессами регенерации растений в культуре in vitro [14, 15]. В работах Mano et al. и Bregitzer et al. с использованием линий удвоенных гаплоидов от скрещивания сортов ячменя Steptoe и Morex были найдены пять локусов QTL, влияющих на число зеленых растений-регенерантов в культуре пыльников, а также два QTL, связанные с регенерацией альбиносных растений [24, 25]. В исследованиях Torp et al. c использованием пятидесяти линий удвоенных гаплоидов от скрещивания двух сортов пшеницы Ciano и Walter, на хромосомах 2AL, 2BL и 5BL было найдено четыре QTL, влияющих на частоту формирования зеленых растений-регенерантов [26]. Три аллеля, выявленные на хромосомах 2AL и 2BL, были получены от отзывчивого сорта Ciano. Благоприятствующий формированию зеленых растений локус количественных признаков, расположенный на хромосоме 5BL, был передан от низко отзывчивого родителя Walter. Вместе с тем не было
показано достоверного влияния исследованных локусов на формирование эмбриоидов, что еще раз подтверждает независимый контроль отдельных параметров пыльцевого эмбриогенеза.
Для идентификации генов, определяющих способность растений к индукции пыльцевого эмбриогенеза, и их картирования с помощью микросателлитных маркеров необходимо осуществить корректный подбор соответствующих праймеров. Мягкая пшеница (T. aestivum L.) является достаточно трудным объектом для генетических исследований, в силу сложности строения генома. Данный вид имеет аллогексаплоидный геном естественного происхождения (2n=6x=42, AABBDD), в образовании которого участвовали диплоидные виды T. urartu (геном А), Aegilops speltoides (геном В) и Ae. tauschii (геном D) [27]. Из-за большого числа хромосом не представляется возможным вести поиск соответствующих маркеров по всему геному. Поскольку к настоящему времени несколькими группами исследователей получены данные о том, что на эффективность индукции пыльцевого эмбриогенеза и регенерации растений пшеницы оказывают заметное влияние хромосомы 5 гомеологической группы [10, 11, 12], основное внимание в данном исследовании было сосредоточено на изучении генов, локализованных на хромосоме 5А. Хромосома с картированными микросателлитными последовательностями представлена на рис. 1.
5A
7.7 10,8 -
4.8 4,6
5.9
10,9
7,9 20,7
-Xgwm304
-Xcda7S5 -Xbcd1355 -Xcdo412
-Xcdo57 -Xbcd10SS -Xmwg522 -Xmwg524
Xgwm415 Xgwm129 Xgwm205 Xgwm154 Xgwm293
Xgwm156
Xgwm617* -Xbcd1S3 I Xgwm666*
—Xrz395 -Xcdo1326
-Xwg114 Xgwm126
Xgwm179
Xgwm596 Xgwm291 Xgwm410*
Xbcd1S71
Xgwm186
Xgwm639
Xabg391
Рис. 1. Генетическая карта хромосомы 5А мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) [13]
Отобранные нами для использования в дальнейшем исследовании маркеры микро-сателлитных локусов представлены в табл. 2. Детальный анализ имеющейся в литературе информации показал, что основное число
микросателлитов имеет сходные локусы в нескольких хромосомах генома. Чтобы повысить точность исследований, нами были подобраны 10 маркеров, локализованных исключительно на хромосоме 5А.
Таблица 2
Микросателлитные локусы хромосом 5A мягкой пшеницы
Локус Положение Локус Положение
Xgwm304 Xgwm156
Xgwm415 Xgwm595
Xgwm154 5AS Xgwm186 5AL
Xgwm205 Xgwm126
Xgwm293 Xgwm291
Как видно из рис. 1 и табл. 2, отобранные микросателлитные локусы равномерно расположены в различных районах хромосом 5А. Все они представлены единичными копиями на соответствующей хромосоме. Для каждого локуса были подобраны соответствующие праймеры и оптимизированы условия проведения ПЦР : снижена концентрация праймеров до 2,5 пмоль на
реакцию, снижена концентрация дезоксирибо-нуклеотидфосфатов до 80 мкмоль на реакцию.
Полученные данные свидетельствуют о наличии межлинейного полиморфизма по ло-кусам Xgwm186 (рис. 2), Xgwm291 (рис. 3), Xgwm595 (рис. 4) у изучаемых генотипов пшеницы. Для остальных исследованных локусов полиморфизм выявлен не был.
186.1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
't 186.1.' 2 ' S1 4 6.7 л . » 10 ;>1, j.12) 13 14 15 Ii > U ' ' 19 3t
- . )
il 4
te* 4
200 п.о.
100 п.о.
f > ♦*■•■♦» 'f* * * * UI LÀ é~4 Ы
ь * * a. « •«•«
ввввваввав;
■ 159 п.о.
■ 147 п.о.
■ 138 п.о.
Рис. 2. Межлинейный полиморфизм по локусу Х^т186 у сортов и линий мягкой яровой пшеницы. 1-5 - Ростань, 6-10 - Рассвет, 11-15 - Dh 52-02-06, 16-20 - Dh 48-02-06
При изучении полиморфизма локуса Х^ш186 у сорта Ростань и удвоенного гаплоида БЬ 4802-06 был выявлен фрагмент размером 113 п.о. У сорта Рассвет и удвоенного гаплоида БЬ 5202-06 выявлялось 3 фрагмента размером 159,
147 и 138 п.о. Полиморфизм по локусу Х^ш291 проявился в наличии дополнительного фрагмента размером 139 п.о. у линий удвоенных гаплоидов, отсутствующего у исследованных сортов. Анализ полиморфизма локуса Х^ш595 выявил
113 п.о
наличие 3 фрагментов у обоих исследованных 52-02-06 и Dh 48-02-06. Таким образом, из 10 сортов (размер 216, 199, 181 п.о.) и единствен- исследуемых локусов на хромосоме 5А наличие ного фрагмента размером 302 п.о. для линий Dh полиморфизма было выявлено лишь по 3 из них.
Рис. 3. Межлинейный полиморфизм по локусу Xgwm291 у сортов и линий мягкой яровой пшеницы. 1-5 - Ростань, 6-10 - Рассвет, 11-15 - БИ 52-02-06, 16-20 - БИ 48-02-06
595.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
п
м
200 п.о.
JINHhHÜ Й!
~0BBöäBöai
4PJ 1 ps -J It
Ti 1 pw^ "161 p* p»'!
ИНИН Hi MhHNHHHI
МЫЫ »«4 M k—4i
-216 п.о.
Рис. 4. Межлинейный полиморфизм по локусу Xgwm595 у сортов и линий мягкой яровой пшеницы. 1-5 - Ростань, 6-10 - Рассвет, 11-15 - БИ 52-02-06, 16-20 - БИ 48-02-06
Гексаплоидное тритикале (х Triticosecale Wittm.) является синтетическим амфиди -плоидом (2n=6x=42, AABBRR), полученным в результате скрещивания твердой пшеницы (T. durum L.) с рожью (Secale sp.). Одной из трудно решаемых задач селекции тритикале является повышение пластичности культуры. У тритикале нет естественных центров происхождения, где можно было бы черпать исходный материал для селекции по улучшению этой культуры, поэтому первоочередной задачей в селекции является увеличение генетического разнообразия тритикале. Методика культуры пыльников эффективно справляется с данной
задачей, но, как и большинство злаков, тритикале характеризуется очень низкой эффективностью пыльцевого эмбриогенеза in vitro. Информация по генетическому контролю данного процесса у тритикале практически отсутствует, так как тритикале в эволюционном отношении еще очень молодая культура и многие вопросы ее биологии и генетики недостаточно изучены. Однако, поскольку 2/3 генома тритикале представлено геномом пшеницы (ААВВ), а данные литературы свидетельствуют о том, на эффективность пыльцевого эмбриогенеза у пшеницы влияют в основном гены, расположенные на хромосомах А и В геномов [11, 21-23], пред-
300 п.о
302 п.о
100 п.о
ставляется вполне возможным использование подобранных для пшеницы SSR-маркеров при изучении генома тритикале.
Изучен полиморфизм локусов Xgwm186, Xg-wm595, Xgwm291, расположенных на хромосоме 5А пшеничного генома у 74 генотипов (65 отдаленных гибридов и 6 родительских форм (пшеница: Рассвет, Р-2, Р-19; тритикале: Лана, Лотас, КСИ 18/05)). Установлено, что по ло-кусу Xgwm595, полиморфному у исследован-
ных генотипов пшеницы, у изучаемых форм тритикале полиморфизм отсутствует. Анализ локуса Xgwm291 выявил крайне высокую степень полиморфизма у исследуемых генотипов, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. Только анализ полиморфизма локуса Xgwm186 позволил получить результаты, сопоставимые с полученными при исследовании генома пшеницы. Полученные данные представлены на рис. 5.
186.1 2 3 4 5 6 13 14 15 20 21 22 56 57 58 ^ Лана Р-2 Р-19РассветЛиас
200 п.о.
* ¡4»
145 п.о. 160 п.о. 138 п.о.
.Wfi.c
Рис. 5. Полиморфизм по локусу Xgwm186 у форм тритикале и пшеницы 1-3 - Лотас х Р-2 (F4), 4-6 - КСИ 18/05 х Ростань (F4), 13-15 - Лана х Р19 (F5), 20-22 - КСИ 18/05 х
Ростань (F5), 56-58 - Лотас х Рассвет (F4).
По результатам исследования изученные генотипы разделились на 3 группы: у гибрида Лотас х Р-2 (рД а также сортов Рассвет, Лотас и сортообразца Р-19 выявлялось 3 фрагмента размером 160, 145 и 138 п.о. У сортообразца КСИ 18/05 и гибридов с его участием (КСИ 18/05 х Ростань Р4 и Р5) обнаружен единственный фрагмент размером 110 п.о. Размеры полученных фрагментов согласуются с данными по
полиморфизму этого локуса, полученными нами для пшеницы. Разница в размерах аналогичных фрагментов у пшеницы и тритикале не превышает 2 нуклеотида и может быть объяснена погрешностями при вычислении молекулярного веса фрагментов. Третью группу составили гибриды Лана х Р-19, Лотас х Рассвет, сорт Лана, сортообразец Р-2. У данных генотипов были выявлены 3 фрагмента размером 136, 127 и 119 п.о.
Заключение
Таким образом, анализ полученных данных показал наличие полиморфизма по 3 из 10 исследуемых локусов для изученных генотипов мягкой яровой пшеницы (Xgwm186, Xgwm595, Xgwm291). Поскольку данные генотипы являются контрастными по эффективности пыльцевого эмбриогенеза in vitro (сорта обладают низкой отзывчивостью, линии - высокой), мож-
но говорить о том, что наличие определенных локусов может коррелировать с отзывчивостью генотипов в культуре in vitro.
Показано, что праймеры пшеницы могут использоваться для оценки полиморфизма у тритикале. В частности, у исследованных нами генотипов тритикале сходные с пшеницей фрагменты обнаружены для локуса Xgwm186.
100 п.о
Список использованных источников
1. Высоцкая, И.Б. Культура пыльников in vitro в селекции тритикале: автореф. дис. ... канд. биол. наук / И.Б. Высоцкая. -Ставрополь, 2002. - 20 с.
2. Беккужина, С.С. Экспериментальный ан-дрогенез и клеточная селекция пшеницы на устойчивость к стрессам: автореф. дис. ... канд. биол. наук. / С.С. Беккужина. - М., 1993. - 19 с.
3. Орлов, П.А. Функциональная геномика морфогенеза / П.А. Орлов. - Минск: Право и экономика, 2005. - 518 с.
4. Картель, Н.А. Биотехнология в растениеводстве / Н.А. Картель, А.В. Кильчевский. -Минск, 2005. - 310 с.
5. Vohra, P. Triticale: An alternative cereal grain in broiler starter diets / P. Vohra [et al.] -Calif. Agric. - 1991. - V. 45. - P. 34-37.
6. Круглова, Н.Н.Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков / Н.Н. Круглова, В.Ю. Горбунова, Т.Е. Батыгина // Успехи совр. биологии. -1995. - Т. 115, вып. 6. - С. 692-705.
7. Korzun, V. Cereals breeding and genomics - bridging together / V. Korzun // Intern. sci. conf. Molecular genetics, genomics and biotechnology: Proceedings. - Minsk, 2004. - P. 18.
8. Белинская, Е.В. Наследование способности к андрогенезу in vitro у ярового ячменя / Е.В. Белинская // Цитология и генетика. -2005. - Т. 39, № 2. - С. 27-37.
9. Foster, B.P. Haploidy in barley / B.P. Foster, W. Powell // Opportunities and problems in plant biotechnology; Eds W. Powell, J.M. Hil-man. - Washington: Washington State Univ., 1998. - P. 99-115.
10. Tuvesson, K.D. Nuclear genes affecting albinism in wheat (Triticum aestivum L.) anther culture / K.D. Tuvesson, S. Pedersen, S.B. Andersen. -Theor. Appl. Genet. - 1989. - V 78. - P. 879-883.
11. Genetic analysis of anther culture response in wheat using aneuploid, chromosome substitution and translocation lines. / S. Agache [et al.] -Theor. Appl. Genet. -1988. - V. 77. - P. 7-11.
12. Адонина, И.Г. Характеристика сател-литных повторов видов Aegilops L. секции Sitopsis и их использование в качестве молекулярных маркеров: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / И.Г. Адонина. -СО РАН, Новосибирск, 2007. - 19 c.
13. Wheat microsatellites in plant breeding-potential and implications. In: Molecular markers in plant breeding / M.S. Roder [et al.] -Springer-Verlag Heidelberg. - P. 255-266.
14. Tautz, D. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation / D. Tautz, M. Trick, G.A. Dover // Nature. - 1986. -V. 322. - P. 652.
15. The Effective Mutation Rate at Y Chromosome Short Tandem Repeats, with Application to Human Population-Divergence Time / L.A. Zhivotovsky [et al.] - Am. J. Hum. Genet. -2004. - V. 74. -№ 1. - P. 50.
16. Mutation rate varies among alleles at a microsatellite locus: phylogenetic evidence / Jin L. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1996. -V. 93. - № 26. - P. 15 285.
17. Глазко, В.И. Современные направления использования ДНК технологий / В.И. Глазко, Н.Н. Доманский, А.А. Созинов / Цитология и генетика. - 1998. - T. 32, № 5. - С. 80-93.
18. Дорохов, Д.Б. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов / Д.Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. -1997. - Т. 33. - № 4. - С. 443-450.
19. GrainGenes 2.0: a data base for Triticeat and Avena [Electronic resource] - Mode of access: http://wheat.pw.usda.gov. - Date of access: 26.09.2012.
20. Linkage mapping of mutant loci in rye (Secale cereale L.) / S. Malyshev [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2001. - V. 103. - P. 70-74.
21. Henry, Y. Genetic analysis of in vitro wheat somatic embryogenesis. / Y. Henry, J. Buyser, L. Marcotte // Euphytica. - 1985. - V. 63. -№ 3. - P. 265-270.
22. Ghaemi, M. Reciprocal substitution analysis of embryo induction and plant regeneration from anther culture in wheat / M. Ghaemi, A. Sarrafi, R. Morris // Genome. - 1995. -V. 38. - P. 158-165.
23. In vitro androgenesis of wheat: from fundamental to practical application / B. Barnabas [et al.] // Euphytica. - 2001. - V. 119. -P. 211-216.
24. Bregitzer, P. Genetic markers associated with green and albino plant regeneration from embryogenic barley callus / P. Bregitzer, R.D. Campbell // Crop Science. - 2001. -V. 41. - P. 173-179.
25. Construction of a genetic map of barley (Hor-deum vulgare L.) cross 'Azumamugi' x 'Kanto Na-kate Gold' using a simple and efficient amplified fragment-length polymorphism system / Y. Mano [et al.] // Genome. - 2001. -V 44. - P. 284-292.
26. Torp, A.M. Chromosomal region associated with green plant regeneration in wheat (Triti-cum aestivum L.) anther culture / A.M. Torp,
A.L. Hansen, S.B. Andersen // Euphytica. -2001. - V. 119. - P. 377-387.
27. Хлесткина, Е.К. Геномная локализация и структурно-функциональные особенности генов биосинтеза флавоноидов пшеницы и ее сородичей: автореф. дис. ... докт. биол. наук: 03.02.07 / Е.К. Хлесткина. - СО РАН, Новосибирск, 2011. - 33 с.
Дата поступления статьи 1 июля 2013 г.
