CC BY
7УДК :575.133.018.634:[633.11+633.14]
О.И. Зайцева, В.А. Лемеш, Г.В. Мозгова, А.В. Кильчевский
ИЗМЕНЕНИЯ В ХЛОРОПЛАСТНОМ ГЕНОМЕ АЛЬБИНОСНЫХ РАСТЕНИЙ ЯРОВОГО ТРИТИКАЛЕ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ
ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Культивирование изолированных пыльников в условиях in vitro является одним из наиболее перспективных современных методов при создании гаплоидных и дигаплоидных линий растений. Использование данного биотехнологического подхода позволяет получить полностью гомозиготные линии в течение одного цикла культивирования, что существенно ускоряет селекционный процесс. Главной проблемой, препятствующей широкому практическому применению культуры пыльников in vitro у злаков, является высокая частота формирования хлорофилл-дефектных растений, достигающая у отдельных генотипов пшеницы, ячменя, риса, тритикале и других злаков 100% [1, 2]. Известно, что на увеличение выхода зеленых растений-регенерантов влияет характер предобработки, состав питательных сред, условия культивирования. Однако на сегодняшний день не подобрано единых условий, обеспечивающих высокую частоту формирования зеленых регенерантов у всех злаков. Поэтому важным является более детальное исследование процессов, которые приводят к андроге-нетичекому альбинизму.
Существует ряд гипотез о первичных причинах и механизмах возникновения альбиносного фенотипа в культуре пыльников in vitro [3, 4, 5]. Известно, что генотип растений - доноров пыльников оказывает достоверное влияние на выход зеленых и альбиносных растений-регенерантов [2]. Выявлено, что в культуре пыльников мягкой пшеницы сорта Chinese Spring геном А достоверно влияет на регенерацию зеленых растений, а геном В - на общую регенерацию и формирование альбиносных растений-регенерантов [6]. Поиск генетических маркеров, связанных с процессами регенерации
растений, позволил установить локусы количественных признаков, влияющих на число зеленых и альбиносных растений в культуре пыльников злаков [7, 8, 9, 10].
Выявлено также участие плазмогенов в контроле признаков, характеризующих пыльцевой эмбриогенез [2]. Предполагается, что одной из главных причин формирования альбиносных растений в культуре пыльников являются мутации пластидных генов, возникающие в микроспорах пыльника в ходе их культивирования или регенерации растения [4, 5]. Молекулярные исследования выявили широкий спектр перестроек, в основном делеций, в пластидном геноме альбиносных растений-регенерантов пшеницы, ячменя и риса [5, 11, 12]. Целенаправленное отключение пластидных генов табака, а именно гро-генов, кодирующих пластидную РНК-полимеразу, позволило получить альбиносные растения-регенеранты в культуре пыльников [13]. Это указывает на то, что делеции пластидно-го генома могут приводить к образованию хлорофилл-дефектных растений. Предполагается, что основой для внутримолекулярных перестроек пластома могут служить короткие прямые повторы, АТ-богатые последовательности или псевдогены [12].
При этом исследования Wang et al. показали, что фрагментация ДНК происходит в развивающихся пыльниках, в которых микроспоры находятся на стадии средней и поздней одноядерной микроспоры. Это позволило выдвинуть предположение, что альбинос-ные растения in vitro могут происходить от микроспор, пластиды которых дифференцируются в амилопласты и постепенно дегенерируют [14].
У альбиносных растений показаны нарушения транскрипционной и трансляционной активности хлоропластного генома [4, 15]. При этом не у всех хлорофилл-дефектных растений выявляются изменения пластид-ной ДНК. Hofinger et al. выявили изменения транскрипции и трансляциии пластома у аль-биносных регенерантов как с перестройками пластидного генома, так и без них [15]. Было показано, что у растений альбино-фенотипа снижается уровень транскрипции пластидных генов фотосинтетического аппарата и рибосо-мальных РНК, в то время как остальные гены функционируют без изменений. Эти данные позволяют предположить, что у альбиносных растений наблюдается нехватка работающих пластидных рибосом, что приводит к нарушениям трансляции и транскрипции. Недостаток функционирующих рибосом по-видимому, обусловлен влиянием ядерного генома на процессы развития пластид.
Таким образом, существует ряд гипотез, объясняющий механизмы возникновения хлорофилл-дефектных растений в культуре пыльников in vitro. При этом до конца не вы-
явлена роль пластидного и ядерного геномов и их совместного действия на выход альбиносных растений в данной культуре. Вместе с тем, явление альбинизма в культуре пыльников может быть тесно связано с процессами деградации хлоропластной ДНК, которые происходят в микроспорах в ходе их естественного развития in vivo [3]. Поэтому перспективным направлением в изучении данной проблемы является исследование структурных перестроек ДНК, затрагивающих конкретные хлоропластные гены, связанные с процессами фотосинтеза, и поиск участков хлоропластного генома, в которых с высокой частотой могут происходить изменения, ведущие к формированию мутантного фенотипа.
Следует отметить, что установление причин альбинизма проводилось на относительно небольшом числе объектов, в основном на ячмене и пшенице [16, 17]. В связи с этим целью работы являлось изучение изменений в хлоропластном геноме альбиносных растений-регенерантов сортов, линий и гибридов ярового тритикале, полученных в культуре пыльников in vitro.
Материалы и методы
Объектом исследования служили альбинос-ные и зеленые растения-регенеранты, полученные в культуре пыльников 19 генотипов ярового тритикале, включая 5 сортов, 3 сортообразца, 7 гибридов первого поколения, 1 гибрид второго поколения, 3 гибрида третьего поколения. Культивирование пыльников проводилась в соответствии с ранее описанной методикой [18].
Для выявления изменений использовались 7 пар праймеров к 7 генам хлоропластного генома (табл. 1) [19].
ДНК выделяли по методике Дорохова и Клоке с модификациями [20]. Полимеразную цепную реакцию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 2,5 мкл ПЦР-буфера (75 мМ трис-HCl, pH 8,3, 20мМ (NH4)2SO4, 0,1 %-ный твин-20) 2мМMgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 1 мкМ каждого праймера, 1 U Taq-полимеразы и 50 нг тотальной ДНК. Амплификация проходила в термоциклере MJ mini Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad) по ранее описанным программам [19].
Таблица 1
Исследованные пластидные гены
Название гена Прямая и обратная последовательность праймеров (5/-3/) Продукт гена Размер гена (п.о.) Размер ДНК-фрагмента (п.о.)
psaA CCAGAAGGTAATGGGTTACTCC GCCATTTCTCAAGAACACTAGC Р 700 апопротеин 1а 2252 2109
atpB TTTCTGCGATTTGTTCTCCTCT GTACAGGTCGTATCGATCAAAT Р-субъединица СБ1-комплекса АТФ-азы 1496 1439
atpE AATCCAATTGACAGCCTCGATT TGTACTGACTCCTAAGCGAATT 8-субъединица СБ1-комплекса АТФ-азы 413 382
rbcL ACTAAAGCAGGTGTTGGATTTA ATCAATAGTATCTACCGGCTCG Большая субъединица РБФК 1433 1410
cemA GGTCTCTTCCTCATTTAACAAA GAATGATAAATGACTACAAGCG Белок мембраны оболочки 692 612
petA CTTGGGTAAAGGAACAGATAAC GTAATGGATCCTGAAGCACGAT Цитохром { 962 831
trnE CCCTATCGTCTAGTGGTTCAGG GCTGCCTCCTTGAAAGAGAGAT тРНК§1и 72 46
Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 3%-ном (ген trnE) и 1%-ном (остальные гены) агарозном геле.
Оценка выхода альбиносных растений проводилась в пересчете на количество изученных генотипов, а также на совокупное число всех
полученных хлорофилл-дефектных растений, так как процессы, приводящие к андрогенетиче-кому альбинизму, по-видимому, не генотипиче-ски специфичны, а характеризуют вид в целом. Статистическая обработка данных проводилась при помощи статистического пакета MS Excel.
Результаты и обсуждение
При установлении причин и механизмов альбинизма в культуре пыльников большое внимание уделяется хлоропластному геному. Изучение пластидной ДНК альбиносных растений-регенерантов пшеницы и ячменя показало наличие делеций и перестроек 40-80% пластома по сравнению с зелеными регене-рантами [15]. Альбиносные растения часто лишены хлоропластов и содержат их предшественники - пропластиды [21].
Показано, что с наибольшей частотой изменения в пластидном геноме у хлорофилл-дефектных растений, полученных путем прямого эмбриогенеза в культуре пыльников, происходят в LSC-области [11]. В данном участке расположена большая часть хлоро-пластных генов, кодирующих компоненты тилакоидных мембран пластид: гены фотосистем 1 и 2, цитохромного комплекса b/f, АТФ-синтазы. Ogihara et al. [22] выделили в хлоропластном геноме пшениц и эгилопсов,
выращенных в естественных условиях, так называемые «горячие» области, в значительной степени подверженные структурным мутациям. В особенности это касается участка размером 16 т.п.о., включающего гены rbcL и petA. Поскольку данный участок располагается в LSC-области хлоропластного генома, нами предполагалось, что структурные перестройки, которые могли бы быть причиной андрогенетического альбинизма, происходят в таком эволюционно нестабильном участке с наибольшей частотой. На основании этого исследования изменений ДНК альбиносных растений проводились в двух районах генома хлоропластов, с высокой частотой подверженных структурным мутациям (D и G-области по Ogihara et al.) [22]. Для анализа перестроек из первой области были выбраны пять генов, участвующих в процессе фотосинтеза: ген rbcL, кодирующий большую субъединицу ри-булозобифосфаткарбоксилазы (РБФК), и гены
компонентов тилакоидных мембран пластид (фотосистемы 1 - рэаЛ, комплекса цитохром Ь/Я - рйА, АТФ-синтазы - а1рБ и а1рЕ); и один ген, кодирующий белок мембраны оболочки хлоропласта, - сетА.
Для оценки изменений во второй области был проанализирован ген 1тЕ. Продуктом данного гена является тРНК глутаминовой кислоты (тРНК§1и). тРНК§1и принимает участие в синтезе АЛК - первого специфического предшественника всех тетрапирролов, в том числе и хлорофилла. При этом известно, что все ферменты, принимающие участие в синтезе АЛК,
закодированы в ядерном геноме, в то время как тРНК§1и кодируется хлоропластной ДНК [3].
В результате проведенного молекулярно-генетического анализа выявлено присутствие исследуемых генов хлоропластной ДНК в листьях зеленых растений, полученных методом культуры пыльников, у всех изучаемых генотипов тритикале. В то же время шесть из семи генов пластидной ДНК не выявлялись у исследованных альбиносных растений (табл. 2). При этом перестройки наблюдались у 36 из 38 изученных альбиносных растений-регенерантов ярового тритикале.
Таблица 2
Генотип Количество растений Количество растений с изменениями генов
atpB petA psaA atpE cemA rbcL trnE
(Аист х Згода) х Матейко 5 4 4 4 2 4 0 0
Мешко х Banti 5 5 3 4 2 0 1 0
Садко 5 5 3 4 1 1 2 0
Узор х Матейко 3 3 1 3 0 0 0 0
WS-102 x Дублет 3 3 2 2 1 0 0 0
Дублет 2 2 0 2 0 0 0 0
(Аист х Полюс) х Матейко 1 0 0 0 0 0 0 0
(Лана х BOR 25115) x Лотос 1 1 0 0 0 0 0 0
(Лана х Ростань) х Лана 1 0 0 0 0 0 0 0
(Матейко х Presto) x WS-102 1 1 1 1 0 0 0 0
(Ульяна х BOR 25115) x BOR 25115 1 1 1 1 0 0 1 0
Cume x Дублет 1 1 0 1 0 0 0 0
WS-102 1 1 1 1 0 0 1 0
МАН 17569 1 0 1 0 1 1 0
Матейко 1 1 0 1 0 1 1 0
Мешко 1 1 0 1 0 0 1 0
Ульяна 1 1 1 0 0 0 0 0
Ульяна х Дарья 2 1 0 0 0 0 0 0
Лотас х Матейко 2 2 0 0 0 0 0 0
Молекулярный анализ перестроек хлоропластного генома у альбиносных
растений-регенерантов тритикале
Наиболее часто не выявлялся ген афВ, кодирующий Р-субъединицу СБ^комплекса АТФ-азы. У изученных генотипов данный ген присутствовал с частотой 5,3%, при этом он не обнаружен у 84,2% хлорофиллдефектных регенерантов (у 33 из 38 изученных растений) (Табл. 3). В свою очередь генpetA не детектировался у 12 генотипов (68,4%) и 17 индивидуальных растений. Ген psaA не обнаружен у 47,4% изученых форм и 44,7% растений-регенерантов, а ген гЬ^ - у 36,8% генотипов и 8 хлорофиллдефектных растений (21,1%). Продукты амплификации генов atpE и cemA не выявлялись у 21,1%
исследованных форм, а также у 6 (15,8%) и 7 (18,42%) альбиносных растений-регенерантов, соответственно. Ген trnE детектировался у всех изученных растений. Таким образом, результаты анализа изменений хлоропластного генома альбиносных растений-регенернатов ярового тритикале в целом согласуются с данными, полученными на дигаплоидных линиях пшеницы [19]. Однако у альбиносных растений мягкой пшеницы, изученные гены, как правило, детектировались с более высокой частотой. В частности ген atpE обнаруживался у всех хлорофиллдефектных растений [23].
Таблица 3
Частота изменений генома пластид альбиносных растений ярового тритикале
Гены Число генотипов с изменениями генов
шт. %
rbcL 7 36,8
psaA 10 47,4
petA 12 68,4
atpB 18 94,7
atpE 4 21,1
cemA 4 21,1
trnE 0 0
Ранее проведенные исследования хло-ропластной ДНК альбиносных растений, полученных методом культуры пыльников, показали, что структурные изменения хло-ропластного генома имеют характер делеций [11]. Это позволяет нам говорить о том, что, скорее всего, происходит делеция не детектируемых исследуемых генов или участков пла-стидной ДНК с данными генами.
В культуре пыльников и изолированных микроспор злаков известны две чувствительные стадии, на которых можно изменить соотношение зеленых и альбиносных растений [23]. Это стадия одноядерной микроспоры, на которой с помощью стрессовых воздействий можно произвести переключение с нормального гаметофитного пути развития микроспоры на спорофитный путь развития in vitro, и которая сопровождается процессами деградации и восстановления цитоплазматических органелл и их содержимого. И вторая стадия
- дифференцировка апикальных меристем в морфогенетические структуры в ходе регенерации растений в культуре пыльников. В связи с этим, на основании полученных нами данных по структурным изменениям пластид-ного генома тритикале, мы предполагаем, что изменения исследованных фотосинтетических генов, которые приводят к формированию аль-биносного фенотипа в культуре пыльников in vitro, могут быть связаны с неполной остановкой деградации пластидного генома при переключении гаметофитного пути развития микроспор пыльника in vivo на спорофитный in vitro. Также деградация пластидных геномов в культуре пыльников может происходить в ходе регенерации растений и быть связанной с ошибками репликации, происходящими вследствие экстенсивной амплификации пластид-ной ДНК и пластид, как это было показано для растущих эмбриоидов в условиях in vivo [24]. Следует подчеркнуть, что выявленная нами
высокая частота изменений в хлоропластном Я-генома ржи на стабильность пластидного геноме может являться следствием влияния генома тритикале.
Заключение
Пластидная ДНК хлорофилл-дефектных растений-регенерантов тритикале характеризуется значительными перестройками по сравнению с зелеными регенерантами.
Показано, что изменения пластома затрагивают 6 из 7-ми изученных генов. При
этом, с наибольшей частотой не выявляется ген atpB, кодирующий ß-единицу CF1 комплекса АТФ - азы. Выявленные перестройки могут обусловливать возникновение альбиносных рас-тений в культуре пыльников in vitro.
Список использованных источников
1. Кременевская, Е.М. Андрогенез in vitro у тритикале и секалотритикум: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / Е.М. Кременевская. -Мн., 2005. - 129 л.
2. Eudes, F. An Overview of Triticale Doubled Haploids / F. Eudes, A. Chugh // Advances in Haploid Production in Higher Plants / A. Touraev [et al.]. -Springer Netherlands, 2008. - Ch. 6. - P. 87-96.
3. O'Neill G.P. Transfer RNA and the formation of the heme and chlorophyll precursor 5-aminolevulinic acid / G.P. O'Neill, D. Söll // Bio Factors. - 1990. - Vol. 2. - P. 227-235.
4. Searching for mechanisms leading to albino plant formation in cereals / E. Ankele [et al.] // Acta Phys. Plant. - 2005. - Vol. 27, № 4. - P. 651-665.
5. Anther culture-derived regenerants of durum wheat and their cytological characterization / M. Dogramaci-Altuntee [et al.] // The American Genetic Association. - 2001. - Vol. 92. - P. 56-64.
6. Reciprocal substitution analysis of embryo induction and plant regeneration from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.) / M. Ghaemi [et al.] // Genome. - 1995. - Vol. 38, № 1. - P. 158-165.
7. Bregitzer, P. Genetic markers associated with green and albino plant regeneration from embryogenic barley callus / P. Bregitzer, R.D. Campbell // Crop Sci. - 2001. - Vol. 41, № 5. - P. 173-179.
8. Identification and validation of QTLs for green plant percentage in barley (Hordeum vulgare L.) anther culture / M. Munoz-Amatriain [et al.] // Mol. Breeding. - 2008. - Vol. 22, № 1. - P. 119-129.
9. Torp, A. M. Albinism in Microspore Culture/ A. M. Torp, S. B. Andersen // Advances in Haploid Production in Higher Plants / A. Touraev [et al.] // Springer Netherlands, 2008. - Ch. 12. - P. 155-160.
10. Mapping genes for callus growth and shoot
regeneration in barley (Hordeum vulgare L.) / Y Mano [et al.] // Breed. Sci. - 1996. - Vol. 46, -№ 1. - P. 137-142.
11. Mouritzen P. Chloroplast genome breakdown in microspore cultures of Barley (Hordeum vulgare L.) occurs primarily during regeneration / P. Mouritzen, P.B. Holm // Plant Phyziol. - 1994. -Vol. 144. - P. 586-593.
12. Variations in chloroplast from rice (Oryza sativa): Differences between deletions mediated by short direct repeat sequences within a single species / A. Kanno [et al.] // Theor. Appl. Genet. -1993. - Vol. 86. - P. 579-584.
13. Targeted disruption of the plastid RNA polymerase genes rpoA, B and C1: molecular biology, biochemistry and ultrastructure / G. De Santis-Maciossek [et al.] // The Plant Journal. -1999. - Vol. 18, № 5. - P. 477-489.
14. Insights into a key developmental switch and its importance for efficient plant breeding/ M. Wang [et al.] // Plant Physiol. - 2000.-Vol. 124, № 5.- P. 523-530.
15. Nuclear genes affecting albinism in wheat (Triticum aestivum L.) anther culture/ I.K.D. Tuvesson [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 1989. -Vol. 78. - P. 879-883.
16. The involvement of the plastid genome in albino plant regeneration from microspores in wheat / B.J. Hofinger [et al.] // Biotechnological Approaches for Utilization of Gametic Cells: Proceedings of the COST 824 final meeting. Bled, Slovenia, 1-5 July 2000 / ed. B. Bohanec -Brussels, - 2000. - P. 215-228.
17. Microspore embryogenesis: assignment of genes to embryo formation and green vs. albino plant production / M. Munoz-Amatriain [et al.] // Fund Integr. Genomics. - 2009. - Vol. 9. - P. 311-323.
18. Зайцева, О.И. Характеристика процесса пыльцевого эмбриогенеза у перспективных сортов ярового тритикале и гибридов с их участием / О.И. Зайцева, П. А. Орлов // Вес. Нац. акад. навук Беларусь Сер. б1ял. навук. -2009. - №1. - С. 63-67.
19. Анализ изменчивости эволюционно нестабильных областей хлоропластного генома у растений, полученных в культуре пыльников дигаплоидных линий пшеницы / Г.В. Мозгова [и др.] // Генетика. - 2006. -Т. 42, - №2. - С. 192-197.
20. Дорохов Д.Б. Быстрая и экономичная технология ЯЛРВ-анализа растительных геномов / Д.Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. -1997. - Т. 33, - №4. - С. 443-450.
21. Орлов П. А. Функциональная геномика морфогенеза - Мн.: Право и экономика, - 2005. - 518 с.
22. Ogihara V. Diversity and evolution of chlo-roplast DNA in Triticum and Aegilops as revealed by restriction fragment analysis / V. Ogihara, K. Tsunewaki // Theor. Appl. Genet. - 1988. -Vol. 76. - P. 321-332.
23. Мозгова, Г.В. Генетические и биохимические механизмы альбинизма в культуре пыльников дигаплоидных линий пшеницы (Triticum aestivum L.): дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / Г.В. Мозгова. - Мн., - 2008. - 154 л.
24. Quantitative fluorescence microscopy on dynamic changes of plastid nucleoids during wheat development / S. Miyamura [et al.] // Protoplasma. -1986. - Vol. 113, - № 1. - P. 66-72.
