CC BY
14DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-31-102-113 УДК 577.21:633.11:581.143.6
Е. В. Лагуновская
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЭМБРИОГЕННЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ У ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: e.antonenko@igc.by
С целью идентификации микросателлитных локусов, которые могут быть использованы в качестве маркеров при скрининге на отзывчивость в культуре пыльников in vitro, оценена эффективность андрогенеза in vitro у 24 генотипов пшеницы. Выделены контрастные по отзывчивости в культуре пыльников in vitro формы, на основе которых получено 4 расщепляющиеся популяции F2. Проведено исследование межлинейного полиморфизма по 20 микросателлитным локусам, расположенным на хромосомах 5А и 5B. Обнаружено, что расщепление по способности к эмбриогенезу совпадает с расщеплением по аллелям локуса Xgwm371: аллель, имеющий размер 169 п. н., связан с наличием способности к эмбриогенезу; аллель, имеющий размер 185 п. н. — с отсутствием такой способности или крайне низким выходом эмбриоидов, в культуре пыльников in vitro.
Ключевые слова: пшеница, культура пыльников in vitro, эмбриогенез, линии удвоенных гаплоидов, микро-сателлитные локусы.
Введение
Использование культуры клеток и тканей для создания новых генотипов растений облегчает и ускоряет традиционный процесс получения новых сортов, а также позволяет повысить эффективность отбора, проводить большую часть работы в зимний период, создавать новые формы, которые невозможно получить с помощью других методов. При этом применение метода культуры пыльников у пшеницы все еще представляет значительную сложность в связи с тем, что эффективность индукции пыльцевого эмбриогенеза сильно зависит от таких факторов, как генотип донорных растений, условий их выращивания, а также предобработок пыльников и условий культивирования [1]. Кроме того, широкому внедрению метода культуры изолированных пыльников в селекционную практику препятствует ряд других обстоятельств: сравнительно низкий выход растений-регенерантов (зачастую многие регенеранты — альбиносы), абортивность зародышей при регенерации, угроза наследственному механизму клеток со стороны некоторых компонентов питательных сред [2].
Выявление сортов и линий, обладающих
способностью к андрогенезу in vitro, до введения их в культуру клеток является важнейшей задачей, способствующей повышению эффективности метода культуры пыльников. Основным фактором, определяющим такую способность, является генотип [3]. Однако, поскольку в контроль процессов андрогенеза in vitro вовлечено значительное число генов, большая часть которых на данный момент неизвестна, провести скрининг по генотипу достаточно затруднительно. С другой стороны, известно, что микросателлитные маркеры могут быть сцеплены с интересующими исследователя признаками [4, 5]. Для выявления такой связи применяют расщепляющиеся популяции F полученные от скрещивания родителей, контрастных по проявлению способности к эмбриогенезу in vitro. В дальнейшем необходим анализ расщепления в популяциях F2 как по анализируемому признаку, так и по аллельному состоянию микросателлитных локусов, расположенных на тех же хромосомах, что и локусы, связанные со способностью к эмбриогенезу in vitro и последующая оценка степени корреляции между изучаемыми параметрами.
Материалы и методы
Объектом исследования служили сорта, линии удвоенных гаплоидов и гибридные генотипы мягкой пшеницы.
Для культивирования пыльников срезанные колосья выдерживали в течение 7 дней при +4 °С, пыльники изолировали на стадии поздних одноядерных микроспор и культивировали по методике [4]. Отзывчивость в культуре пыльников определяли для каждого индивидуального растения в отдельности. Расщепление по способности к андрогенезу in vitro рассчитывалось по соотношению количества растений, в ходе культивирования пыльников которых были получены эмбриоиды и регене-ранты, вне зависимости от количества последних. Способность к образованию хотя бы одной эмбриогенной структуры оценивалась как 1, неспособность — 0. По такому же принципу оценивалась способность к регенерации. Данные, полученные при подсчете расщепления по признаку «способность к эмбриогенезу» и «способность к регенерации» округлялись до целых чисел.
Для получения гибридов Fj растения пшеницы выращивали в условиях фитотронно-тепличного комплекса. Посев осуществляли в пяти повторностях. Для скрещивания брали по 15 растений. Скрещивание проводилось путем ограниченно свободного опыления: после элиминации пыльников материнских растений на них надевались изоляторы, под которые подводились мужские растения со зрелыми пыльниками, по два мужских колоса на один колос материнской формы. Были проведены прямые и обратные скрещивания между контрастными по отзывчивости в культуре пыльников in vitro генотипами.
Выделение геномной ДНК проводили из зерновок стандартным фенольно-хлороформным методом [5]. Анализ качества и количества выделенной ДНК проверяли в 1%-ном ага-розном геле и на спектрофотометре «Ultrospec 3300pro» (Amersham Biosciences).
Для анализа межлинейного полиморфизма были выбраны 20 микросателлитных локусов, находящихся на хромосомах 5А (Xgwm304, Xgwm415, Xgwm154, Xgwm205, Xgwm293, Xgwm156, Xgwm595, Xgwm186, Xgwm126, Xgwm291) и 5В (Xgwm324, Xgwm443, Xgwm544, Xgwm540, Xgwm499, Xgwm335, Xgwm67,
Xgwm371, Xgwm554, Xgwm406). Последовательности праймеров подбирали с использованием базы данных GrainGenes [6]. ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащем из расчета на одну реакцию: MgCl2 — 2 мМ; прямого и обратного праймеров к одному из маркеров — по 0,1 пМ; дНТФ — 80 мкМ; 1 единицу Taq-полимеразы в инкубационном буфере; деонизированную стерильную воду — 13,7 мкл. Концентрация геномной ДНК составляла 100 нг на 25 мкл. Программа амплификации: 94 °С — 3 мин (94 °С — 1 мин, T — 2 мин, 72 °С — 2 мин) — 40 ци-
отжига °С 3 у
клов); 72 °С — 10 мин. Температуру отжига выбирали в зависимости от последовательности праймера: 54 °С — Xgwm335; 55 °С
— Xgwm304, Xgwm415, Xgwm154, Xgwm293, Xgwm443, Xgwm544, Xgwm408; 57 °С — Xgwm234, Xgwm540; 59 °С — Xgwm186; 60 °С
— Xgwm205, Xgwm156, Xgwm126, Xgwm499, Xgwm67, Xgwm554; 64 °С — Xgwm595, Xgwm291, Xgwm371.
Для получения анализируемых фрагментов проводили ПЦР с мечеными праймерами к выбранным локусам: в каждой паре «прямой-обратный праймер» один из праймеров метился флуоресцентным красителем. Использовались следующие флуоресцентные метки: R6G для праймера к локусу Xgwm540; FAM для праймера к локусу Xgwm595; TAMRA для праймеров к локусам Xgwm291; ROX для праймера к локусу Xgwm371. Размеры полученных продуктов амплификации определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле и с помощью капиллярного электрофореза. Вертикальный электрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле и 0,5Х TBE буфере при напряжении от 40 до 100 В на протяжении 4-5 ч. Окраску геля проводили в кюветах с раствором 10% бромистого этидиума 15-30 мин из расчета 3 мкл бромистого этиди-ума на 100 мл воды. Визуализацию осуществляли в ультрафиолетовом свете с использованием системы гель-документации Quantum ST4-1100, расчет размера полученных фрагментов выполняли с помощью программы Quantum-Capt, поставляемой с системой гель-документации. Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Для этого в лунки платы вносили 1 мкл получен-
ного ПЦР-продукта, 9 мкл деионизированного формамида и 0,5-1 мкл внутреннего стандарта Orange DNA Size Standard (MCLab), который использовался в качестве маркера молекулярного веса. Анализ полученных данных осуществляли с помощью программы GeneMapper v.5.0. Информация об аллельном составе SSR-локусов у изученных образцов была занесена в электронную базу данных в формате Microsoft Excel-2003. Наличие определенного ампли-фицированного фрагмента ДНК у данного генотипа обозначали цифрой «1», отсутствие — «0». Для расчета частот аллелей микросателлитных локусов в популяциях F2 использовали надстройку для электронной таблицы MS Excel — GenAlEx 6.41 [7]. Для расчета коэффициента Пирсона использовали MS Excel.
Результаты и обсуждение
Поскольку для создания расщепляющей-
ся популяции по способности к андрогенезу in vitro следует подобрать родительские генотипы, контрастные по исследуемому признаку, необходимо оценить потенциальные родительские генотипы по отзывчивости в культуре пыльников. Для этого был проведен скрининг имеющихся форм пшеницы по их способности к андрогенезу in vitro.
В культуру пыльников было введено 24 генотипа пшеницы и оценена их андрогенети-ческая способность по таким параметрам, как «частота индукции эмбриогенеза» (от числа посаженных пыльников), а также «частота регенерации растений», частота регенерации зеленых растений», «частота регенерации альбиносных растений» (на 100 посаженных пыльников) (табл. 1) Часть полученных данных была опубликована нами ранее [8].
Для индукции эмбриогенеза пыльники помещали на жидкую среду С-17, первые эмбри-
Таблица 1
Эффективность эмбриогенеза в культуре пыльников in vitro у сортов, сортообразцов и линий
удвоенных гаплоидов пшеницы
Генотип 1 год 2 год 3 год
Э* РА (зел./альб.) Э* Р* (зел./альб.) Э* Р* (зел./альб.)
DH 222-1-1 х DH 61-14 454,8 47,6/42,9 1,1 0/0 4,3 0/0
DH 61-14 х DH 222-1-1 203,4 35,7/10,9 36,6 4,3/2,0 0 0/0
DH 61-14 - - 0 0/0 0 0/0
DH 222-1-1 - - 0 0/0 0 0/0
Людмила 3,03 0/0 0 0/0 - -
BOR 0,80 0/0 0 0/0 - -
BOR х Людмила 2,40 0/0 0 0/0 - -
Людмила х BOR 2,50 0/0 0 0/0 - -
(BOR х Людмила) х BOR 4,72 0/0 0 0/0 - -
DH 48-02-06 - - - - 42,7 4,9/4,6
DH 52-02-06 - - - - 24,7 5,9/3,7
Ростань 0,90 0/0 0 0/0 0 0/0
DH 64-18 22,62 0/0 0 0/0 - -
Ростань х DH 64-18 3,6 0/0 1,59 0/0 0,5 0/0
DH 64-18 х Ростань 36,2 2,1/10,6 - - 2,3 4,5/0,9
Окончание таблицы 1
Генотип 1 год 2 год 3 год
Э* р* (зел./альб.) Э* р* (зел./альб.) Э* р* (зел./альб.)
du-115 0 0/0 0 0/0 - -
du-115 х Ростань 2,8 0,8/0,4 0 0/0 0 0/0
Ростань х du-115 2,96 0/0 0 0/0 - -
Ростань х DH 61-14 0,41 0/0 - - - -
du-115 х DH 222-1-1 16,7 0/0,6 - - - -
Рассвет 6,1 0/0 0 0/0 - -
DH 66-(2)-6 23,4 0,5/0,2 - - 0,7 0/0
DH 220-2-2 5,1 0/0 0 0/0 - -
Дарья 101,9 0/0 - - 0 0/0
Примечание. Э — количество полученных эмбриоидов; Р — количество полученных регенерантов; * — из расчета на 100 пыльников, "-" — генотип не анализировался
огенные структуры развивались на 30-35 сутки культивирования (рис. 1, А). Пересадка на среду для регенерации MSR осуществлялась при достижении эмбриоидами диаметра около 1 мм. Новообразования меньшего размера, согласно нашим наблюдениям, практически не способны к регенерации полноценного расте-ния-регенеранта.
Под растением-регенерантом подразумевается стерильное растение с развитой системой корней и побегов, сформированных in vitro. Его получение является основным звеном любой биотехнологической методики, поскольку без успешной регенерации теряют смысл эксперименты по соматической гибридизации, гаплоидии, клеточной селекции, микрокло-нальному размножению растений.
В наших исследованиях после помещения эмбриоидов на среду для регенерации в большинстве случаев отмечались интенсивные процессы дифференцировки клеток. Они шли, главным образом, в двух направлениях: регенерация целого растения (гемморизогенез), либо только ризогенез, без формирования побегов. Первый путь развития был отмечен у 10 генотипов, у которых были получены растения-регенеранты (табл. 1). В остальных случаях либо не наблюдалось образования эмбриоидов, либо их культивирование приво-
дило к разрастанию недифференцированной каллусной массы. В результате дальнейшего культивирования таких каллусов в ряде случаев происходило интенсивное формирование корней, но формирования побегов не происходило. Отдельные этапы получения расте-ний-регенерантов пшеницы методом культуры пыльников представлены на рисунке 1, аномальные пути морфогенеза в культуре пыльников in vitro — на рисунке 2.
Анализ полученных нами данных позволяет говорить о том, что наибольшую отзывчивость в культуре пыльников проявили реципрокные гибриды линий удвоенных гаплоидов DH 2221-1 и DH 61-14 (DH 222-1-1 х DH 61-14 и DH 61-14 х DH 222-1-1) и линии удвоенных гаплоидов DH 48-02-06 и DH 52-02-06, полученные на их основе. При этом родительские генотипы DH 222-1-1 и DH 61-14 проявили нулевую способность к пыльцевому эмбриогенезу наряду с сортом Ростань и сортообразцом du-115. Также высокую отзывчивость проявил гибрид DH 64-18 х Ростань при полном отсутствии пыльцевого эмбриогенеза у одного родителя и низкой эмбриогенной активности другого.
В результате проведенного скрининга для дальнейшего определения микросателлитных локусов, связанных с отзывчивостью в культуре пыльников in vitro был отобран сорт мягкой
А
Б
В
Г
Д
Е
Рис. 1. Этапы получения растений-регенерантов методом культуры пыльников у гибрида пшеницы DH 222-1-1 х DH 61-14 на 35-ый (А), 40-й (Б), 47-й (В), 56-й (Г), 60-й (Д) и 75-й (Е) день культивирования
in vitro
■ < i
А
Б
В
Г
Рис. 2. Аномальные пути развития эмбриоидов пшеницы в культуре пыльников in vitro (А, Б) только ризогенез (без развития побегов); (B) развитие хлорофилл-дефектных растений; (Г) только геммогенез (без развития корней)
яровой пшеницы Ростань с низкой отзывчивостью в культуре пыльников in vitro и 2 линии удвоенных гаплоидов (DH 48-02-06 и DH 5202-06), с высокой отзывчивостью.
Получение популяции гибридов F и F, контрастных по способности к андрогенезу in vitro форм мягкой пшеницы
С целью получения гибридов Fj были проведены реципрокные скрещивания генотипов, контрастных по способности к андрогенезу in vitro: сорта мягкой яровой пшеницы Ро-стань с низким эмбриогенным потенциалом и линий удвоенных гаплоидов мягкой яровой пшеницы (DH 48-02-06, DH 52-02-06), с высоким эмбриогенным потенциалом в культуре пыльников in vitro.
ков in vitro форм, проявили способность как к эмбриогенезу, так и к регенерации in vitro, однако у индивидуальных растений в пределах каждой популяции наблюдался большой разброс значений по указанным параметрам. Полученные данные были использованы при оценке связи аллельного состояния некоторых микросателлитных локусов с эффективностью андрогенеза in vitro.
Оценка влияния аллельного состояния микросателлитных локусов на эффективность андрогенеза in vitro у родительских линий мягкой пшеницы
Генотип донорного растения является основополагающим фактором, детерминирующим эффективность пыльцевого эмбриогенеза и органогенеза в культуре клеток in vitro, определяющим до 85% изменчивости по дан-
Максимальную завязываемость зерновок наблюдали при скрещивании удвоенного гаплоида DH 48-02-06 (материнское растение) и сорта Ростань (отцовское растение), минимальную — при скрещивании удвоенного гаплоида DH 52-02-06 (материнское растение) и сорта Ростань (отцовское растение).
На основе полученных гибридов Fj мягкой яровой пшеницы было создано четыре популяции гибридных растений F2. Полученные растения были использованы в качестве доноров пыльников при введении в культуру in vitro (табл. 2).
Обнаружено, что гибридные генотипы пшеницы, полученные нами от скрещивания контрастных по отзывчивости в культуре пыльни-
ному признаку [3, 10]. Вместе с тем данные о генетическом контроле отзывчивости растений к культивированию тканей, в частности, о генах, контролирующих пыльцевой эмбриогенез, отрывочны и противоречивы [10-12]. Решить эту проблему можно, используя SSR-маркеры. Метод основан на определении сцепления микросателлитных маркеров и исследуемых признаков в популяциях гибридов второго поколения.
Среди злаков микросателлитные повторы достаточно хорошо изучены и широко используются в качестве молекулярных маркеров у представителей родов, имеющих важное сельскохозяйственное значение, таких как пшеница (Triticum L.), рожь (Secale L.), ячмень (Hordeum L.). У злаков на повторяющиеся последовательности приходится от 15% до 80%
Эффективность андрогенеза in vitro гибридов F2 мягкой пшеницы
Таблица 2
Популяция Посажено пыльников Получено эмбриоидов* Получено регенерантов*
Зеленых Альбиносных
DH 48-02-06 х Ростань 756 15,61 0,78 0
Ростань х DH 48-02-06 1629 10,99 1,04 0,43
DH 52-02-06 х Ростань 452 23,67 4,42 0,44
Ростань х DH 52-02-06 896 17,97 0,78 0
Примечание. * — из расчета на 100 инокулированных пыльников
генома, в частности, молекулярно-генетиче-ская карта T. aestivum содержит более 1 500 SSR-маркеров [13-15].
Пул некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК в геноме подвергается постоянным изменениям. Гетерогенность повторяющихся последовательностей лежит в основе использования их в качестве высокополиморфных генетических маркеров как для селекционной работы, так и в эволюционных исследованиях.
Известно, что на процессы андрогенеза в культуре пыльников in vitro у пшеницы так или иначе влияют практически все хромосомы генома, в частности хромосомы 2А, 3A 5A, 1B, 2В, 5B, 1D, 2D, 6D и 7D [3, 10, 11]. Поскольку к настоящему времени получены многочисленные данные о значительном вкладе в эффективность андрогенеза генов, расположенных на хромосомах 5 гомеологиче-ской группы, а именно 5А и 5В [10, 11, 16, 17], основное внимание в наших исследованиях было сосредоточено на изучении микросател-литных локусов, локализованных на данных хромосомах.
Для того чтобы при анализе расщепляющейся популяции F2 определить, сцеплены ли микросателлитные маркеры с конкретным признаком, необходимо было определить полиморфизм по каждому из локусов у родительских генотипов.
Для получения первичных данных о наличии либо отсутствии полиморфизма по определенным SSR-локусам у сортов и линий удвоенных гаплоидов, контрастных по способности к индукции андрогенеза в культуре пыльников in vitro, проводили ПЦР с прайме-рами, подобранными к каждому SSR-локусу. Ранее нами было показано, что при разделении продуктов амплификации в 6% полиакрила-
мидном геле у исследуемых родительских генотипов гибридов F2 мягкой яровой пшеницы (сорт Ростань, линии удвоенных гаплоидов DH 52-02-06, DH 48-02-06) обнаружен межлинейный полиморфизм по трем микросателлитным локусам, расположенным на хромосоме 5А (Х^т186, Х^т291, Х^т595) и четырем ми-кросателлитным локусам, расположенным на хромосоме 5В (\gwm540, Х^т371, Х^т335, Х^т234). По остальным исследованным SSR-локусам полиморфизм не выявлен [18].
Таким образом, были получены первичные данные о наличии полиморфизма по исследуемым микросателлитным локусам. Однако, поскольку разделение продуктов амплификации в полиакриламидном геле не позволяет выяснить точный размер полученных фрагментов, потребовалось проведение дополнительных исследований с использованием метода капиллярного гель-электрофореза.
Проведенный с использованием данного метода анализ размеров амплифицированных фрагментов подтвердил наличие полиморфизма только для четырех из семи микросателлит-ных локусов, отобранных нами на основании результатов разделения ПЦР-продуктов в по-лиакриламидном геле. Полученные с помощью капиллярного гель-электрофореза размеры фрагментов отличались от размеров, выявленных с помощью полиакриламидно-го геля, но, так как разрешающая способность метода капиллярного электрофореза значительно выше, в дальнейшем мы руководствовались данными, полученными с его помощью. Для локусов Х^т291, Х^т371, Х^т595 и Х^т540 было выявлено два различных фрагмента (по одному для каждого генотипа) (табл. 3).
Для локуса Х^т291 были выявлены фрагменты размером 168 п. н. у сорта Ростань
Таблица 3
Полиморфизм по микросателлитным локусам у генотипов пшеницы, контрастных по параметрам андрогенеза in vitro (разделение продуктов амплификации с помощью
капиллярного гель-электрофореза)
Генотип Xgwm291 Xgwm371 Xgwm595 Xgwm540
Ростань 168 п. н 185 п. н. 182 п. н. 132 п. н.
DH 48-02-06 140 п. н. 169 п. н. 182 п. н.; 146 п. н. 130 п. н.
DH 52-02-06 140 п. н. 169 п. н. 182 п. н; 140 п. н. 132 п. н.
и 140 п. н. у обеих линий удвоенных гаплоидов.
По локусу Xgwm371 было также выявлено два различных фрагмента: 169 п. н. у линий удвоенных гаплоидов DH 48-02-06 и DH 5202-06 и 185 п. н. у сорта Ростань.
По локусу Xgwm595 у всех генотипов выявлен фрагмент размером 182 п. н. и дополнительные фрагменты размером 146 п. н. у удвоенного гаплоида DH 48-02-06, а также дополнительный фрагмент размером 140 п. н. у удвоенного гаплоида DH 52-02-06.
По локусу Xgwm540 у удвоенного гаплоида DH 48-02-06 выявлен фрагмент размером 130 п. н., у удвоенного гаплоида DH 52-02-06 и сорта Ростань — фрагмент размером 132 п. н. Однако, поскольку различия по размеру фрагментов у родительских форм не превышают два нуклеотида, данный локус не анализировался как полиморфный для исследуемых генотипов.
Таким образом, в ходе проведенного исследования выявлен четкий полиморфизм по трем микросателлитным локусам у генотипов пшеницы, контрастных по отзывчивости в культуре пыльников in vitro. Использование полиакриламидного геля позволяет выявлять полиморфизм по микросателлитным локусам у пшеницы и снижает затраты на проведение исследований при скрининге большего количества генотипов, однако для окончательной
оценки и точного определения размера полученных фрагментов целесообразно использовать метод капиллярного гель-электрофореза.
Анализ расщепляющейся популяции гибридов F2 пшеницы по соотношению аллелей полиморфных микросателлитных локусов.
На следующем этапе проводили анализ наследования полиморфизма по микросателлит-ным локусам в расщепляющейся популяции гибридов F2. Всего по каждому из 4 микроса-теллитных локусов, проявивших полиморфизм у родительских генотипов, проанализировано 95 растений F2 из 4 популяций: популяция 1 [ОН 48 х Ростань] — 19 растений, популяция
2 [ОН 52 х Ростань] — 12 растений, популяция
3 [Ростань х ОН 48] — 41 растение, популяция
4 [Ростань х ОН 52] — 23 растения.
Была оценена частота встречаемости фрагмента определенной длины для каждого ло-куса в каждой популяции. Различия в размерах амплифицируемых фрагментов считали различными аллельными состояниями соответствующего локуса. Поскольку по локусу Xgwm595 полиморфизм проявлялся в наличии либо отсутствии фрагментов размером 140 п. н. или 146 п. н., отсутствие обоих фрагментов указанного размера считали нуль-аллелем (табл. 4).
Полученные данные свидетельствуют о неравномерном распределении различных алле-
Таблица 4
Частота встречаемости аллелей микросателлитных локусов в гибридных популяциях пшеницы, полученных от скрещивания генотипов, контрастных по способности
к андрогенезу in vitro
Гибридная популяция Xgwm291 Xgwm371 Xgwm595
140 п. н. 168 п. н. 169 п. н. 185 п. н. Нуль-аллель 140 п. н. 146 п. н.
DH 48-02-06 х Ростань 0,68 0,32 0,76 0,24 0,63 0 0,36
Ростань х DH 48-02-06 0,06 0,94 0,63 0,37 0,70 0 0,30
DH 52-02-06 х Ростань 0,04 0,96 0,56 0,44 0,96 0 0,04
Ростань х DH 52-02-06 0,09 0,91 0,48 0,52 0,85 0 0,15
лей локуса Xgwm291 в популяциях, полученных в результате реципрокных скрещиваний. Так, соотношение аллеля 140 п. н. и 168 п. н. в популяции 1 фН 48-02-06 х Ростань) составило 68% и 32% соответственно, а в популяции 2 (Ростань х DH 48) — 6% и 94%. По остальным исследованным локусам в популяциях, полученных в результате реципрокных скрещиваний, наблюдались достаточно сопоставимые данные.
По локусу Xgwm595 у гибридов выявлялись только нуль-аллель и аллель 146 п. н. Аллель
размером 140 п. н., обнаруженный у удвоенного гаплоида DH 52-02-06, у гибридов, полученных с его участием (DH 52-02-06 х Ростань и Ростань х DH 52-02-06), не выявлен.
На основании полученных результатов, а также данных о способности к андрогенезу in vitro у индивидуальных растений исследуемых генотипов, были рассчитаны расщепления по параметрам пыльцевого эмбриогенеза и частотам определенных аллелей микросателлитных локусов в популяции гибридов F2 (табл. 5).
Таблица 5
Расщепление по параметрам андрогенеза in vitro и аллелям микросателлитных локусов
у гибридов F2 мягкой яровой пшеницы
Гибридная популяция Способность к эмбриогенезу (есть/нет) Способность к регенерации (есть/нет) Полиморфизм по микросателлитным локусам
Xgwm291 (140/168 п. н.) Xgwm371 (169/185 п. н.) Xgwm595 (null/146 п. н.)
DH 48-02-06 х Ростань 3:1 (Х2 = 0,017; Р = 0,895) 1:5 (Х2 = 0,016; Р = 0,90) 2:1 (Х2 = 0,026; Р = 0,87) 3:1 (Х2 = 0,018; Р = 0,90) 2:1 (Х2 = 0,105; Р = 0,75)
Ростань х DH 48-02-06 1:1 (Х2 = 0,220; Р = 0,64) 1:7 (Х2 = 0,160; Р = 0,69) 1:16 (Х2 = 0,003; Р = 0,95) 1:1 (Х2 = 0,220; Р = 0,64) 2:1 (Х2 = 0,149; Р = 0,70 )
DH 52-02-06 х Ростань 2:1 (х2 = 0; Р = 1) 1:2 (Х2 = 0; Р = 1) 1:24 Х2 = 0,001; Р = 0,98) 2:1 (Х2 = 1,313; Р = 0,25) 24:1 (Х2 = 0,001; Р = 0,98)
Ростань х DH 52-02-06 1:1 (х2 = 0,390; Р = 0,53) 1:22 (Х2 = 0; Р = 1) 1:10 (Х2 = 0,004; Р = 0,95) 1:1 (Х2 = 0,043; Р = 0,84) 6:1 (Х2 = 0,016; Р = 0,90)
Анализ полученных данных показал, что расщепление по аллелям локуса Xgwm371 у исследованных индивидуальных растений F2 полностью совпадает с расщеплением по их способности образовывать эмбриоиды в культуре пыльников in vitro. Аллель, имеющий размер 169 п. н., связан с наличием способности к эмбриогенезу; аллель, имеющий размер 185 п. н. — с отсутствием такой способности
или крайне низким выходом эмбриоидов. Для уточнения полученных данных был рассчитан суммарный коэффициент Пирсона для всех исследованных популяций. Оценивалась корреляция между количеством отзывчивых либо неотзывчивых индивидуальных растений и индивидуальных растений, несущих тот или иной аллель в локусе Xgwm371. Рассчитанный коэффициент Пирсона оказался близким к 1,
что говорит о наличии тесной связи между исследуемыми параметрами, и подтверждает полученную информацию о связи микроса-теллитного локуса Xgwm371 с отзывчивостью в культуре пыльников у пшеницы. Связь между аллельным состоянием локусов Xgwm291 и Xgwm595 и параметром андрогенеза in vitro «способность к эмбриогенезу» в исследуемых популяциях проследить не удалось. Также не было выявлено зависимости между аллельным составом исследованных микросателлитных локусов и параметром «способность к регенерации».
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что микросателлитный локус Xgwm371, расположенный на длинном плече хромосомы 5В, сцеплен с параметром андрогенеза in vitro «способность к эмбриогенезу». Исходя из полученных данных, аллель 169 локуса Xgwm371 может являться SSR-маркером для выявления отзывчивых в культуре пыльников in vitro генотипов пшеницы.
Заключение
Комплексное исследование, проведенное на расщепляющихся популяциях F2, полученных от скрещивания сортов и линий удвоенных гаплоидов пшеницы, контрастных по отзывчивости в культуре пыльников in vitro, позволило идентифицировать микросателлитный локус Xgwm371, аллельное состояние которого имеет прямую корреляцию с эффективностью андрогенеза in vitro у изученных нами генотипов пшеницы. Мы полагаем, что аллель 169 SSR-локуса Xgwm371 можно рассматривать в качестве кандидата для обнаружения отзывчивых в культуре пыльников in vitro генотипов пшеницы.
Список использованных источников
1. Testillano, P. S. Microspore embryogenesis: Targeting the determinant factors of stress-induced cell reprogramming for crop improvement // P. S. Testillano / J. Exp. Bot. - 2019. - Vol.70. - P. 2965-2978.
2. Lantos, C. Anther culture as an effective tool in winter wheat (Triticum aestivum L.) breeding // C. Lantos, J. Pauk / Russ. J. Genet. - 2016. Vol. 52. - P. 794-801.
3. Chromosomal regions associated with the in vitro culture response of wheat (Triticum aes-
tivum L.) microspores // N. H. Nielsen [et al.] / Plant Breeding. - 2015. - Vol. 134, № 3. -P. 255-263.
4. Mason, A. S. SSR genotyping // A. S. Mason / Methods Mol. Biol. - 2015. - Vol. 1245. -P. 77-89.
5. Идентификация микросателлитных локу-сов по данным секвенирования ВАС-клонов и их физическое картирование на хромосому 5B мягкой пшеницы // М. А. Нестеров [и др.] / Вавиловский журнал генетики и селекции. -2015. - Т. 19, № 6. - C. 707-714.
6. Лагуновская, Е. В. Эффективность использования различных типов индукционных питательных сред при культивировании пыльников гексаплоидного тритикале // Е. В. Лагуновская, О. И. Зайцева, В. А. Лемеш // Факторы экспериментальной эволюции организмов: Сб. науч. трудов / Национальная академия наук Украины, Институт молекулярной биологии и генетики, Укр. о-во генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова; редкол.: В. А. Кунах (гл. ред.) [и др.]. - К.: Укр. о-во генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова, 2019. - Т. 25. - С. 260-265.
7. Дорохов, Д. Б. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов / Д. Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. -1997. - Т. 33, № 4. - С. 443-450.
8. GrainGenes [Electronic resource]. - Mode of access: https://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/GG3/ browse.cgi. - Date of access: 03.09.2021.
9. Peakall, R. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update / R. Peakall, P. E. Smouse // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, № 19. - P. 2537-2539.
10. Орлов, П. А. Генетические механизмы пыльцевого эмбриогенеза и его использование в селекции растений / П. А. Орлов, Е. В. Антоненко // Молекулярная и прикладная генетика.- 2007. - Т. 5. - С. 44-71.
11. A simple wheat haploid and doubled hap-loid production system using anther culture // K. M. Kim, P. S Baenziger / In Vitro Cell.Dev. Biol.-Plant. - 2005. -Vol. 41. - P. 22-27.
12. Identification of QTLs associated with tissue culture response of mature wheat embryos // J. Ma [et al.] / SpringerPlus. - 2016. - 5(1): 1552.
13. Torp, A. Chromosomal regions associated with green plant regeneration in wheat (Triticum
aestivum L.) anther culture // A. Torp, A. Hansen, S. Andersen /Euphytica. - 2001. - Vol. 119. -P. 377-387.
14. Chromosomal effects on in vitro morphogenesis in wheat interparietal substitution lines // N. D. Tyankova [et al.] / Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. - 2006. - Vol. 42. -P. 15-19.
15. Putative Microsatellite DNA Marker-Based Wheat Genomic Resource for Varietal Improvement and Management // S. Jaiswal [et al.] / Front. Plant Sci. - 2017. /https://doi.org/10.3389/ fpls.2017.02009.
16. Адонина, И. Г. Характеристика сател-литных повторов видов Aegilops l. секции Sitopsis и их использование в качестве молекулярных маркеров: автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.15 / И. Г. Адонина; СО РАН - Новосибирск, 2007. - 19 c.
17. Roder, M. Wheat Microsatellites: Potential and Implications / M. Roder, X. Q. Huang, M. Ganal // Molecular Marker Systems in Plant Breeding and Crop Improvement / Biotechnolo-
gy in Agriculture and Forestry / eds H. Lorz, G. Wenzel / Springer, Berlin, Heidelberg, 2004. -Vol. 55. - P. 255-256.
18. QTL mapping for anther culturability in wheat using a doubled-haploid population / L. Y. Zhang [et al.] // Proceed. of the 10th International Wheat Genetic Symposyum, Paestum 1-6 September 2003, Italy / Eds N. E. Pogna [et al.]. - Paestum, 2003. - P. 1078-1080.
19. Quantitative trait loci associated with an-drogenic responsiveness in triticale (xTriticose-cale Wittm.) anther culture // M. Krzewska [et al.] / Plant cell reports. 2012. - Vol. 31, № 11. -P. 2099-2108.
20. Сравнительный анализ полиморфизма локусов хромосомы 5А у пшеницы и тритикале с использованием SSR-маркеров //Антонен-ко Е. В. [и др.] / Молекулярная и прикладная генетика: сборник научных трудов. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А.В. Кильчевский и [др.]. - Минск: ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», 2013. - Т. 15. - С. 54-63.
E. V. Lagunovskaya
IDENTIFICATION OF MICROSATELLITE LOCI ASSOCIATED WITH EMBRYOGENIC POTENTIAL IN WHEAT GENOTYPES IN ANTHER
CULTURE IN VITRO
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: e.antonenko@igc.by
In order to identify microsatellite loci that can be used as markers in screening for responsiveness in the in vitro anther culture, the efficiency of androgenesis in vitro was evaluated in 24 wheat genotypes. The forms contrasting in responsiveness in the in vitro anther culture were identified, and four F2 segregating populations were obtained on their basis. The study of interlinear polymorphism by 20 microsatellite loci located on chromosomes 5A and 5B was carried out. It was found that the cleavage by the ability to embryogenesis coincides with the cleavage by the alleles of the Xgwm371 locus: the 169 bp allele is associated with the ability to embryogenesis; the 185 bp allele — with the absence of such an ability or extremely low embryoid yield in the anther culture in vitro.
Keywords: wheat, in vitro anther culture, embryogenesis, double haploid lines, microsatellite loci.
Дата поступления в редакцию: 17 сентября 2021 г.
