CC BY
28УДК 575.113.2:581.143.6:633.1
Е. В. Лагуновская
ОЦЕНКА ГОМОЗИГОТНОСТИ И АЛЛЕЛЬНОГО СОСТАВА ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ХОЗЯЙСТВЕННО ЦЕННЫМИ ПРИЗНАКАМИ, У ЛИНИЙ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ ПШЕНИЦЫ
И ТРИТИКАЛЕ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: e.antonenko@igc.by
С целью определения гомозиготности линий удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале, созданных методом индуцированного андрогенеза in vitro, проведен анализ внутрилинейного полиморфизма 71 генотипа (18 линий пшеницы и 53 линии тритикале) по 13 ISSR локусам. Подтверждена гомозиготность для 14 DH-линий пшеницы и 24 DH-линий тритикале. Проведено KASP-генотипирование отобранных гомозиготных линий по 4 генам, ассоциированным с признаком «масса 1 000 зерен» (TaTGW6-A1, TaGASR7-A1, TaGs3-D1, TaCKX-D1), и 6 генам (Gps-B1, TaPod-A1, Zds-A1, Lox-B1, Psy-A1, Ppo-A1), контролирующим качественные характеристики зерна. Показано, что все исследованные линии несут не менее 2 благоприятных аллелей указанных генов. Выделены 7 генотипов пшеницы и 3 генотипа тритикале с комплексом благоприятных аллелей.
Ключевые слова: пшеница, тритикале, Triticum aestivum, хTriticosecale Wittm., линии удвоенных гаплоидов, ISSR локусы, KASP, масса 1 000 зерен, качественные характеристики зерна.
Введение
Пшеница (ТгШсит aestivum) и тритикале (^Triticosecale Wittm.) являются ценными зерновыми культурами в большинстве стран мира, в том числе и в Республике Беларусь. На долю пшеницы приходится почти 25% от общего количества калорий и белка, потребляемых людьми во всем мире, больше, чем для любого другого источника продовольствия. Тритикале, представляющее собой гибрид между пшеницей и рожью, также является ценной злаковой культурой, с уникальным сочетанием целого ряда свойств, присущих исходным видам. К их числу относятся высокий потенциал урожайности зерна и зеленой массы, повышенные адаптивные свойства, комплексный иммунитет к грибным заболеваниям, высокое содержание лизина и крахмала в зерне и т. д. Зерно тритикале в основном используется на фураж и как техническое сырье для крахмального и спиртового производства, однако в последние годы, в связи с высоким качеством новых сортов, созданных белорусскими селекционерами, тритикале с успехом применяется в хлебопекарной промышлен-
ности при изготовлении хлеба и печенья [1].
Несмотря на достигнутые успехи, пшеница и тритикале, как и другие сельскохозяйственные культуры, требуют дальнейшего совершенствования. Низкая пластичность сортов (особенно у тритикале), связанная прежде всего с ограниченным генетическим разнообразием исходного материала, приводит к значительному снижению продуктивности под воздействием абиотических и биотических факторов.
Линии удвоенных гаплоидов (doubled haploid lines, DH-линии), созданные методом индуцированного андрогенеза in vitro, являются эффективным материалом для улучшения генетического разнообразия, поскольку ценные сельскохозяйственные признаки могут сохраняться в последующих поколениях и усиливаться по сравнению с исходным генотипом [2].
При получении удвоенных гаплоидов с использованием метода андрогенеза in vitro особое внимание уделяется чистоте полученных линий. Поскольку удвоенные гаплоиды пшеницы и тритикале, полученные в куль-
туре пыльников in vitro, могут иметь как га-метофитное (из микроспор, гомозиготы), так и спорофитное (из тканей пыльника, гетеро-зиготы) происхождение, необходим контроль гомозиготности полученных растений-реге-нерантов. Для этого используют морфологическую оценку полученных форм, однако более быстрые и точные результаты могут быть получены с использованием ДНК-маркеров.
Метод ISSR-анализа (Inter simple sequence repeat — межмикросателлитные повторы) основан на амплификации области между обратно ориентированными, близко расположенными микросателлитами. ISSR-маркирование не требует предварительного знания нуклеотид-ной последовательности исследуемой ДНК, одиночные праймеры длиной 15-24 п. о. состоят из нескольких коротких нуклеотидных повторов, используемых для амплификации этих областей, и, как правило, несут на 5' или 3' конце несколько селективных нуклеотидов. Конечный продукт амплификации представляет собой множество фрагментов, отображающихся на электрофореграмме в виде дискретных полос. Применение ISSR-маркеров, сравнительно равномерно распределенных по растительному геному, позволяет одновременно определить изменчивость по группе не связанных между собой локусов, что позволяет, в частности, объективно оценить гомозигот-ность исследуемых DH-линий [3, 4].
Другой областью применения ДНК-маркеров является маркер-сопутствующая селекция (marker assisted selection, MAS) — подход, позволяющий при помощи генетических маркеров отбирать генотипы, несущие желательные аллели интересующих исследователя генов. Поиск и определение генетических маркеров, наиболее эффективно контролирующих хозяйственно ценные признаки, в традиционной селекции зерновых культур проводится путем изучения исходного материала в полевых коллекциях, включения его в те-стерные, анализирующие и др. виды скрещивания и, как правило, занимает от четырех до шести лет. Применение современных методов изучения исходного материала с использованием ДНК-технологий позволяет с высокой степенью достоверности выделить среди имеющихся образцов те, которые несут необходимый маркированный локус и таким образом
сократить период анализа до месяцев при одновременном увеличении объемов исследуемого материала и сокращении трудовых затрат.
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) — замена одного нуклеотида в любой части генома в результате естественной мутации — является наиболее изучаемым полиморфизмом в геноме растений. Одним из самых эффективных и быстрых способов анализа SNP является технология KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) — конкурентная аллель-специфичная ПЦР по конечной точке с флуоресцентной детекцией, в которой полиморфизм выявляют с помощью специфичных олигонуклеотидов, содержащих на З'-конце детектируемую замену. Такая высокопроизводительная геномная маркерная технология очень эффективна для тритикале и мягкой пшеницы (Triticum aestivum L), поскольку среди злаков геном пшеницы оценивается как один из наименее полиморфных.
Ключевыми параметрами, на которые необходимо опираться при проведении селекции с целью получения высокопродуктивных сортов пшеницы, являются урожайность, качество зерна и устойчивость абиотическим и биотическим факторам.
Признак «масса 1 000 зерен» является одним из основных количественных показателей, определяющим урожайность пшеницы. Он позволяет оценить наличие запасных питательных веществ в зерне, а также рассчитать нормы посева. Данный показатель находится под контролем различных локусов, контролирующих как морфометрические параметры (длина, ширина и толщина зерновки), так и активность различных ферментов растений, в частности, ключевых энзимов, участвующих в углеводном обмене. К генам, контролирующим массу 1 000 зерен, относятся, в частности, TaTGW6-A1, TaGASR7-A1, TaGs3-D1, TaCKX6-D1 [5].
Качество зерна у пшеницы контролируется генами Gps-B1, Ppo-A1, Lox-B1, Psy-A1, TaPod-Al, Zds-A1 и др. Большинство этих генов кодируют ферменты, связанные с биосинтезом и биодеградацией каротиноидов [6]. Каротиноиды (лютеин, зеаксантин, крипток-сантин) определяют цвет муки. В синтезе ка-ротиноидов участвуют ферменты, включая
фитоенсинтазу, Z-каротин-десатуразу, фито-ен-десатуразу и др. Пероксидазы, широко распространенные в злаках, вызывают деградацию В-каротина и окисление лютеина. Активность всех этих ферментов тесно связана с цветом муки и производимых из нее продуктов, а также с изменением исходного цвета в процессе хранения. Ген Gps-B1 оказывает влияние на содержание белка в зерне пшеницы, определяя ее пищевую ценность [7].
Установлено, что определенные SNP, ин-серции и делеции в последовательностях указанных выше генов оказывают значительное влияние на активность кодируемых ими ферментов и, как следствие, величину параметра «масса 1 000 зерен» и качественные характеристики зерна у пшеницы и тритикале [6, 8].
Целью работы являлась оценка гомозигот-ности полученных нами в культуре пыльников in vitro линий удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале, и KASP-генотипирование отобранных гомозиготных линий по генам, влияющим на массу 1 000 зерен и качественные характеристики зерна.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили 18 линий удвоенных гаплоидов мягкой яровой пшеницы, 53 линии удвоенных гаплоидов ярового гексаплоидного тритикале, сорт- стандарт для мягкой яровой пшеницы Любава, сорт-стандарт для ярового гексаплоидного тритикале Узор. Линии удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале созданы в лаборатории генетической и клеточной инженерии Института генетики и цитологии НАН Беларуси на основе гибридов Fj и F полученных от скрещивания сортов белорусской и зарубежной селекции, и линий удвоенных гаплоидов, различающихся по отзывчивости в культуре пыльников in vitro [9, 10]. Сорта пшеницы и тритикале предоставлены РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию».
Выделение ДНК проводили из индивидуальных зерновок стандартным фенол-хлороформным методом [11]. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре «N50-Touch» (Implen, Германия). Для оценки гомозиготности линий удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале использовали прай-меры к 13 ISSR локусам: ISSR 2, ISSR 17,
UBC 807, UBC 808, UBC 810, UBC 811, UBC 815, UBC 834, UBC 835, UBC 836, UBC 840, UBC 841, UBC 856 (ОДО «Праймтех», Беларусь) [12, 13]. ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей из расчета на одну реакцию: смесь для ПЦР 5* qPCRmix-HS (Евроген, Россия) — 5 мкл, праймер с концентрацией 5 пМ для анализа определенного ISSR локуса — 2,5 мкл; део-низированную стерильную воду — 12,5 мкл. Концентрация геномной ДНК составляла 100 нг на 25 мкл. Программа амплификации: 94 °С — 5 мин, [94 °С — 30 сек, T отжига °С — 45 сек, 72 °С — 2 мин] — 35 циклов, 72 °С — 10 мин. Температуру отжига выбирали в зависимости от последовательности используемого праймера: 52 °С — UBC 840; 53 °С — ISSR 17; 54 °С — UBC 808, UBC 815, UBC 834; 55 °С — UBC 810, UBC 811, UBC 835, UBC 856; 56 °С — ISSR 2, UBC 807, UBC 836, UBC 841. Визуализацию результатов амплификации осуществляли с помощью электрофоретического разделения в 1,2% ага-розном геле, при напряжении 90 В в течение 1-1,5 ч. Результаты документировали с помощью системы гель-документирования GelDoc Quantum St4 (Vilber Lourmat, Франция). Размеры амплифицированных фрагментов определяли с помощью маркера молекулярного веса GeneRuler 100 bp и 100 bp+ DNA Ladder (Thermo Scientific, Литва).
Гомозиготность исследуемых DH-линий определяли с помощью анализа электрофо-ретического спектра по каждому ISSR локусу для 10 индивидуальных растений. Гомозиготной считали линию с идентичным количеством и размером полученных фрагментов у всех анализируемых индивидуальных растений по всем исследуемым ISSR локусам.
KASP-генотипирование образцов проводили по 4 генам, ассоциированным с признаком «масса 1 000 зерен», (TaTGW6-A1, TaGASR7-A1, TaGs3-D1, TaCKX-D1) и 6 генам (Gps-B1, TaPod-A1, Zds-A1, Lox-B1, Psy-A1, Ppo-A1), контролирующим качественные характеристики зерна у пшеницы и тритикале.
Для определения аллельных вариантов отобранных генов методом KASP-генотипиро-вания с использованием различных баз данных (GenBank, GrainGenes, Gramene, European Wheat Database) и литературных источников
нами подобраны аннотированные ДНК последовательности для моделирования и синтеза KASP праймеров. Информация о детектируемых полиморфизмах представлена в таблице 1. Хромосомная позиция указана для сборки генома Triticum aestivum IWGSC CS ReffSeq v2.1 (GCF_018294505.1) [14].
ПЦР при выполнении KASP-генотипирова-ния проводили в реакционной смеси объемом 10 мкл, содержащей следующие компоненты: 30* KASP by Design Primer Mix (содержит аллель-специфичные праймеры: 3 KASP-прай-мера, специальным образом синтезированных для анализа целевого участка с SNP или встав-кой/делецией (LGC Biosearch Technologies, Великобритания)) — 0,14 мкл; KASP V4.0 2X Master mix (LGC Biosearch Technologies, Великобритания) — 5,0 мкл; ДНК исследуемых генотипов пшеницы 15-30 нг / 2 мкл, биди-стилированная вода — до конечного объема. Для проведения амплификации с детекцией в режиме реального времени программировали прибор CFX96 Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, США) следующим образом: 94,0 °С — 15 мин, [94,0 °С — 20 сек, 61,0 °С —
60 сек] — 10 циклов, [94,0 °С — 20 сек, 55,0 °С — 60 сек] — 26 циклов, шаг считывания флуоресцентного сигнала на 37 °С в течение 1 мин.
Визуализацию результатов осуществляли с использованием программы CFX Maestro™, BioRad. Результаты генотипирования оценивали на основании анализа 2D-графика ал-лельной дискриминации, на котором по оси X показаны стандартизованные данные финального уровня флуоресценции для первого флуорофора FAM (RFU1, относительные единицы флуоресценции), по оси Y — для второго флуорофора HEX (RFU2).
На первом этапе исследования каждая проба представляла собой пул из ДНК пяти индивидуальных растений одного генотипа. Если в результате генотипирования проба определялась как гетерозигота, проводили повторное генотипирование с использованием ДНК каждого индивидуального растения в отдельности. В зависимости от значений уровней флуоресценции RFU1 и RFU2, а также от соотношения RFU1 / RFU2, для каждого исследуемого образца пшеницы устанавливали определенный генотип.
Таблица 1
Полиморфизмы генов, ассоциированных с хозяйственно ценными признаками у пшеницы и тритикале, детектируемые с помощью KASP-маркеров
Локус Хромосомная позиция Полиморфизм FAM / HEX Аллель Фенотип Ссылка
TaTGW6-Al Chr.3A:722646994G > A (NC_057800.1) G I A TaTGW6-Ala/ TaTGW6-Alb Высокая / низкая масса 1 000 зерен [15]
TaGASR7-Al Chr.7A:175964414-175964406_ins1369b.p. (NC_057812.1) инсерция - I инсерция + Hlg / Hlc Уменьшение / увеличение длины зерновки и массы 1 000 зерен [16]
TaGs3-Dl Chr.7D:6833179G > T (NC_057814.1) G I T TaGS3-Dla / TaGS3-Dlb Увеличение / уменьшение длины зерновки и массы 1 000 зерен [17]
TaCKX-Dl Chr.3D:del107236227-107236244 (NC_057802.1) делеция +I делеция - TaCKX-Dla / TaCKX-Dlb Высокая / низкая масса 1 000 зерен [18]
Xuhw89 (тесно сцеплен (0,1 сМ) с Gpc-Bl) Chr.6B:del140409139-140409142 (NC_057810.1) делеция + I делеция - Gpc-Blb / Gpc-Bla Высокое / низкое содержание белка [7]
TaPod-Al Chr.3A:731158150G > A (NC_057800.1) G I А TaPod-Alb / TaPod-Ala Высокая / низкая активность пероксидазы [19]
Окончание таблицы 1
Локус Хромосомная позиция Полиморфизм FAM / HEX Аллель Фенотип Ссылка
Zds-A1 Chr.2A:325477392C > G (NC_057797.1) C / G Zds-A1a / Zds-A1b Низкое / высокое содержание желтого пигмента [20]
TaLox-B1 Chr.4B:30022405G > C (NC_057804.1) G / С TaLox-B1b / TaLox-B1a Высокая / низкая активность липоксигеназы [21]
Psy-A1 Chr.7A:735889561_ ins38b.p. (NC_057812.1) инсерция - / инсерция + Psy-A1a / Psy-A1b Высокое / низкое содержание желтого пигмента [22]
Ppo-A1 Chr.2A:715938171A > T (NC_057797.1) A / T Ppo-A1a / Ppo-A1b Высокая / низкая активность полифенолоксидазы [23]
Результаты и обсуждение
Для оценки гомозиготности полученных удвоенных гаплоидов с помощью 13-ти маркеров к ISSR-локусам были изучены 18 линий удвоенных гаплоидов пшеницы и 53 линии удвоенных гаплоидов тритикале. Выбор ISSR-маркеров, использованных в исследовании, основывался на данных литературы [12, 13]. В данном исследовании были использованы маркеры, показавшие наибольший полиморфизм и, как следствие, информативность для исследуемых линий.
Полученные результаты выявили как отсутствие, так и наличие внутрилинейного полиморфизма по исследуемым локусам у линий удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале. На рисунке 1 представлен пример внутри-линейного полиморфизма у индивидуальных растений удвоенного гаплоида пшеницы DH-66-2-1-12. Стрелками показаны некоторые полиморфные фрагменты. У данной линии полиморфизм проявился в отсутствии у одного из 10 индивидуальных растений двух фрагментов, присутствующих у остальных 9 растений.
В результате проведенного исследования были получены данные по количеству гомо- и гетерозиготных линий удвоенных гаплоидов для каждого ISSR локуса (табл. 2)
Следует отметить, что степень гомозигот-ности по исследуемым ISSR локусам различалась у линий пшеницы и тритикале. Только локус ISSR 17 демонстрировал невысокую гомозиготность для обеих групп DH-линий, в остальном низко гомозиготные локусы для
DH-линий пшеницы могли одновременно быть высоко гомозиготными для DH-линий тритикале.
Так, у линий удвоенных гаплоидов пшеницы наименьший полиморфизм наблюдался для локуса ISSR 2, гомозиготность по которому обнаружена у 94,4% линий. По локусам UBC 815, UBC 834, UBC 836, UBC 840, и UBC 841 гомозиготность выявлена у 88,9% DH-линий. По локусам UBC 808, UBC 810 и UBC 811, UBC835 гомозиготность наблюдалась у 83,3% исследованных линий. По локусам ISSR 17, UBC 807 и UBC 856 77,8% линий оказались гомозиготными.
Для тритикале наименьший внутрилиней-ный полиморфизм наблюдался для локуса UBC 856, гомозиготность по которому обнаружена у 96,2% исследованных линий. При этом для DH-линий пшеницы гомозиготность
М1234 567 SP 10
Рис. 1. Внутрилинейный полиморфизм по ISSR локусу UBC 807 у линии DH-66-2-1-12
Таблица 2
Соотношение гомо- и гетерозиготных DH-линий пшеницы и тритикале по отдельным
ISSR локусам
ISSR локус DH-линии пшеницы DH-линии тритикале
гомозиготные, шт. % гетерозиготные, шт. % гомозиготные, шт. % гетерозиготные, шт. %
ISSR 2 17 94,4 1 5,6 42 79,2 11 20,8
ISSR 17 14 77,8 4 22,2 41 77,4 12 22,6
UBC 807 14 77,8 4 22,2 47 88,7 6 11,3
UBC 808 15 83,3 3 16,7 46 86,8 7 13,2
UBC 810 15 83,3 3 16,7 42 79,2 11 20,8
UBC 811 15 83,3 3 16,7 45 84,9 8 15,1
UBC 815 16 88,9 2 11,1 43 81,1 10 18,9
UBC 834 16 88,9 2 11,1 46 86,8 7 13,2
UBC 835 15 83,3 3 16,7 46 86,8 7 13,2
UBC 836 16 88,9 2 11,1 48 90,6 5 9,4
UBC 840 16 88,9 2 11,1 45 84,9 8 15,1
UBC 841 16 88,9 2 11,1 44 83,0 9 17,0
UBC 856 14 77,8 4 22,2 51 96,2 2 3,8
по этому локусу была одной из самых низких.
Гомозиготность по локусу UBC 836 выявлена у 90,6% линий, по локусу UBC 807 — у 88,7%, по локусам UBC 808, UBC 834, UBC 835 — у 86,8% линий. По локусам UBC 811 и UBC 840 гомозиготность проявили 84,9% линий, по локусу UBC 841 — 83,0%, по локусу UBC 815 — 81,1%, по локусам ISSR 2 и UBC 810 — 79,2% исследованных линий удвоенных гаплоидов. Наибольший полиморфизм наблюдался по локусу ISSR 17, гомозиготными по которому являлось 77,4% линий.
Анализ полученных данных позволил выделить гомо- и гетерозиготные линии удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале (рис. 2). По оси Х указано количество гомозиготных ISSR локусов для конкретной DH-линии.
Таким образом, с применением 13 ISSR маркеров определена степень гомозиготно-сти линий удвоенных гаплоидов, полученных в культуре пыльников in vitro. Из 18 созданных
линий удвоенных гаплоидов пшеницы гомозиготными по всем 13 ISSR локусам оказались 14 линий (77,8%). Для тритикале из 53 созданных DH-линий гомозиготными оказались 24 линии (45,3%). Линии, проявившие гетерозиготность хотя бы по одному исследуемому локусу, были отбракованы, и дальнейшая работа велась только с линиями с подтвержденной гомози-готностью по всем 13 локусам.
Для выяснения целесообразности включения созданных линий удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале в селекционный процесс, отобранные гомозиготные линии удвоенных гаплоидов были оценены на наличие благоприятных аллелей генов, контролирующих хозяйственно-ценные признаки — масса 1 000 зерен и качественные характеристики зерна.
Нами проведено KASP-генотипирование 14 гомозиготных линий удвоенных гаплоидов и сорта-стандарта для мягкой яровой пшеницы Любава, а также 24 линий и сорта-стандарта для ярового гексаплоидного тритикале
Рис. 2. Количество гомозиготных ISSR локусов у линий удвоенных гаплоидов пшеницы (А) и тритикале (Б),
созданных методом индуцированного андрогенеза in vitro
Узор по 4 генам (TaTGW6-A1, TaGASR7-A1, TaGs3-D1, ТаСКХ^1), ассоциированным с признаком «масса 1 000 зерен» и 6 генам (Gps-B1, ТаРо^-А1, Zds-A1, Lox-B1, Psy-A1, Рро-А1), ответственным за качественные характеристики зерна с целью выявления генотипов с благоприятными аллелями и гапло-
ЬИ
VfXi
J ЦОС
3
- ызо
11Ц
типами указанных генов (TaTGW6-A1a, Н1с, TaGS3-D1a, TaCKX-D1a, Gpc-B1b, ТаРо^А1а, Zds-A1b, TaLox-B1a, Psy-A1a, Рро-А1).
Данные, полученные при KASP-генотипи-ровании по генам, ассоциированным с признаком «масса 1 000 зерен», представлены на рисунке 3.
Рис. 3. 2Б-график аллельной дискриминации: А — для однонуклеотидной замены G > А в гене TaTGW6-A1; Б — для наличия / отсутствия инсерции в гене TaGASR7-A1; В — для наличия / отсутствия делеции в гене TaCKX6-D1; Г — для однонуклеотидной замены G > Т в гене TaGs3-D1
Ген TaTGW6-A1, расположенный на хромосоме ЗА пшеницы, кодирует фермент ИУК-гликозил-гидролазу. Три SNP ^ > А в положении 339 п. н., Т > С в положении 368 п. н. и С > G в положении 418 п. н), обнаруженные между сортами с более высокой и низкой массой 1 000 зерен, образуют два ал-леля: TaTGW6-A1a и TaTGW6-A1b. Наличие аллеля TaTGW6-A1a коррелирует с увеличением массы 1 000 зерен [15]. Все исследованные линии пшеницы и тритикале несли благоприятный аллель TaTGW6-A1a (рис. 3А).
Ген TaGASR7-A1 пшеницы располагается на хромосоме 7А, является гомологом гена GASR7 риса, связанного с длиной зерновки, влияет как на длину зерновки, так и на массу 1 000 зерен. Описаны 2 основных га-плотипа (Н1с и Н1£), различающиеся наличием либо отсутствием инсерции размером 1 495 п. н. в 5'-проксимальной области в положении -124 п. н. перед стартовым кодоном [16]. Среди исследованных сортов и линий пшеницы и тритикале благоприятный гапло-тип Н1с выявлен у десяти генотипов: одного генотипа пшеницы (сорт Любава) и девяти DH-линий тритикале (ОН 1-41-52-15, DH 1-5314-15, DH 2-50-16-15, DH 80-1-13, DH 80-3-13, DH 80-4-13, DH 81-5-13, DH 82-3-13, DH 824-13). Неблагоприятный гаплотип Н^ выявлен у 30 образцов (рис. 3Б).
Ген TaCKX6-D1, расположенный на хромосоме 3D пшеницы, относится к мультигенно-му семейству генов СКХ, кодирующих белки цитокининоксидазы/дегидрогеназы и играющих важную роль в продуктивности растений. В зависимости от наличия/отсутствия де-леции во втором интроне выделяют 2 аллеля: TaCKX6-D1a и TaCKX6-D1b [18]. Поскольку локус располагается на D-геноме, у тритикале он не может быть идентифицирован, а все образцы пшеницы несли неблагоприятный аллель TaCKX6-D1b (рис. 3В).
Ген TaGs3-D1, также являющийся гомологом гена риса, расположен на хромосоме 7D пшеницы и контролирует размер зерновки. Наличие G > Т во втором интроне приводит к возникновению двух аллелей TaGs3-D1a и TaGs3-D1b [17]. Среди исследованных образцов пшеницы были выявлены 4 образца с генотипом G / G (благоприятный аллель TaGs3-D1а) — DH 65-5-12, DH 67-9-12, DH
67-1-12, DH 69-2-12 (рис. 3Г).
Для выявления генотипов, несущих благоприятные аллели генов, контролирующих качественные характеристики зерна, проведено KASP генотипирование исследуемых образцов по генам Gps-B1, Рро-А1, Lox-B1, Psy-A1, TaPod-A1, Zds-A1 (рис. 4).
Ген Gpc-B1 контролирует содержание белка в зерновках. Функциональный аллель Gpc-В1Ь, улучшает ремобилизацию азота из стебля, увеличивая содержание белка в зерновке, и сокращает период налива зерна. Для выявления функционального аллеля часто используют кодоминантный маркер Хикн'89, расположенный на расстоянии 0,1 сМ от Gpc-B1 [7]. Анализ полученных данных показал, что по гену Gpc-B1, связанному с накоплением белка в зерновке, все исследованные генотипы несут неблагоприятный аллель Gpc-B1a, связанный с пониженным содержанием белка (рис. 4А). Это согласуется с данными, полученными другими авторами. Аллель Gpc-B1b обнаруживается лишь в небольшом количестве современных коммерческих сортов пшеницы. Так, скрининг 196 сортов мягкой пшеницы из базовой коллекции INRA (Франция) показал, что только пять из них несут аллель дикого типа Gpc-B1b [24]. Также в результате скрининга 365 сортов и линий озимой мягкой пшеницы, культивируемых в Китае, не было обнаружено ни одного сорта, содержащего функциональный аллель Gpc-B1b [25]. При этом скрининг 138 сортов яровых пшениц, имеющих северное происхождение (Скандинавия, Финляндия, Карелия и Кольский полуостров), было обнаружено, что аллель дикого типа несли 33% образцов [24], что позволяет говорить о том, что сорта, несущие функциональный аллель, преимущественно произрастают в северных широтах и, возможно, играет роль в адаптации к холодному климату.
Ген TaPod-A1 расположен на длинном плече хромосомы 3А, кодирует фермент перок-сидазу, вызывающий деградацию пигментов, в частности, окисление бета-каротина и лю-теина, чем ухудшает цвет муки и качество конечных продуктов. Сорта с низкой и высокой активностью полифенолоксидазы несут аллели TaPod-A1a и TaPod-A1b соответственно. Между двумя аллелями в экзонах TaPod-A1 обнаружено пять однонуклеотидных полимор-
Рис. 4. 2Б-график аллельной дискриминации: А — для наличия / отсутствия делеции в гене Орс-В1; Б — для однонуклеотидной замены А > в в гене ТсРой-А1; В — для однонуклеотидной замены С > в в гене Zds-A1; Г — для однонуклеотидной замены С > в в гене ТсЬох-В1; Д — для инсерции/делеции в гене Psy-A1^; Е — для
однонуклеотидной замены А > Т в гене Рро-А1
физмов: А > в в положении 138 п. н., в > Т в положении 237 п. н., А > в в положении 462 п.н., А > в в положении 769 п. н. и Т > А в положении 866 п. н. [19]. Благоприятный аллель TaPod-A1a, связанный с низкой перок-сидазной активностью, несли 15 образцов: 5 генотипов пшеницы (Любава, DH 8-5/10, DH 66-2-2-12, DH 66-2-3-12, DH 66-3-(О)-12) и 10 генотипов тритикале (Узор, DH 1-41-52-15, DH 2-50-16-15, DH 2-50-15-15, DH 80-1-13, DH 803-13, DH 80-4-13, DH 84-1-13, DH 97-2-1-15, DH 99-6-2-15) (рис. 4Б).
Ген Zds-A1 расположен на хромосоме 2А, кодирует фермент ^-каротин-десатуразу, который является ключевым ферментом в пути
биосинтеза каротиноидов и определяет содержание желтого пигмента в зернах пшеницы. На основании SNP С > в в двенадцатом интроне выделяют два аллеля: Zds-A1a и Zds-A1b [20]. Показано, что среди 217 сортов и линий пшеницы, выращиваемой в Китае, среднее содержание желтого пигмента в зерне у 126 сортов с аллелем TaZds-A1b было на 7,8% выше, чем у 91 сорта с аллелем TaZds-A1a [20]. Большинство исследуемых нами образцов несли благоприятный аллель TaZds-A1b (генотип О / в, ассоциирован с высоким содержанием желтого пигмента), кроме образцов пшеницы Любава, DH 66-2-2-12, DH 66-2-3-12 и образцов тритикале DH 85-4-15. Сорт Узор по гену
Zds-A1 был неоднороден, что подтверждено отдельным генотипированием каждого индивидуального растения. Три из пяти проанализированных индивидуальных растений имели генотип С / С (аллель TaZds-Ala), два растения являлись гетерозиготами по данному гену (генотип С / О, TaZds-A1a/TaZds-A1b). На 2D-графике аллельной дискриминации этот сортообразец представлен как гетерозигота (обозначен треугольником) (рис. 4В).
Ген TaLox-B1 расположен на коротком плече хромосомы 4В, кодирует фермент липокси-геназу, активность которой в зерне влияет на цвет и качество обработки продуктов на основе пшеницы. Обнаружено, что низкая активность или делеция гена TaLox-B1 могут эффективно снижать окисление липидов, тем самым уменьшая окислительное разрушение зерна и продлевая период хранения и повышая коммерческую ценность сортов. На основании SNP С > О в третьем экзоне выделяют два аллеля: TaLox-B1a и TaLox-B1b [21]. С использованием KASP-маркеров к данному гену продукт амплификации был получен только у образцов пшеницы, на ДНК образцов тритикале данный праймер не отжигался. Все 15 исследованных нами генотипов пшеницы несли благоприятный аллель TaLox-B1a (генотип С / С), связанный с низкой активностью липоксигеназы (рис. 4Г).
Ген Р5у1-А1 расположен на хромосоме 7А, кодирует фитоен-синтазу 1 — один из ключевых ферментов в пути биосинтеза каротинои-дов, активность которого напрямую коррелирует с содержанием желтого пигмента в зерне пшеницы [26]. Все исследуемые генотипы несли нежелательный аллель Р5у-А1Ь (инсерция в 37 п. н.), связанный с низким содержанием желтого пигмента (рис. 4Д).
Ген Рро-А1 расположен на хромосоме 2A, кодирует фермент полифенолоксидазу — широко распространенный медьсодержащий фермент, вызывающий реакции потемнения во многих растительных продуктах, в том числе приготовленных из злаков. На основании A > Т в первом интроне выделяют два аллеля: Рро-А^ и Рро-А1Ь [23]. Большинство исследованных генотипов несли благоприятный аллель Рро-А1Ь, связанный с низкой активностью фермента, кроме образцов тритикале Узор DH 1-41-52-15, DH 1-53-14-15, DH 1-26-
36-15, DH 2-50-16-15, которые несли аллель Рро-А^ (рис. 4Е).
Таким образом, KASP-генотипирование 40 линий удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале по генам, ассоциированным с хозяйственно ценными признаками, показало, что все исследованные линии несут не менее 2 благоприятных аллелей исследованных генов. Наибольшее количество благоприятных аллелей (пять) обнаружено у семи образцов пшеницы (сорт Любава, DH 8-5/10, DH 65-512, DH 66-3-(О)-12, DH 67-9-12, DH 67-1-12, DH 69-2-12). Остальные линии удвоенных гаплоидов пшеницы несли по 4 благоприятных аллеля. Среди исследованных генотипов тритикале по пять благоприятных аллелей выявлено у линий DH 80-1-13, DH 80-3-13, DH 80-4-13, по 4 аллеля — у линий DH 1-41-52-15, DH 2-50-16-15, DH 81-5-15, DH 82-3-13, DH 82-4-13, DH 84-1-13, DH 97-2-1-15, DH 99-6-215. У сорта-стандарта Узор обнаружено всего 2 благоприятных аллеля по генам TaTGW6-A1 и TaPod-A1.
Полученные данные об аллельном составе исследуемых генов и частоте встречаемости благоприятных и неблагоприятных аллелей в целом согласуются с данными, полученными нами ранее при анализе сортов и сорто-образцов пшеницы белорусской и зарубежной селекции и информацией по европейским сортам [24, 27].
Заключение
Линии удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале представляют собой новый селекционный материал и могут превосходить родительские генотипы по ряду параметров, однако необходим контроль генетической чистоты получаемого материала, в частности их гомозиготности. Использование ISSR-марке-ров позволяет эффективно и быстро выделять гомозиготные и гетерозиготные DH-линии. KASP-генотипирование по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки, с целью выявления генотипов с благоприятными аллелями и включения их в систему скрещиваний, позволяет значительно ускорить получение новых высокоурожайных сортов пшеницы и тритикале, обладающих требуемым качеством зерна для изготовления определенных конечных продуктов в зависимости от ре-
гиона их потребления.
Установлено, что полученные нами линии удвоенных гаплоидов пшеницы и тритикале с подтвержденной гомозиготностью не уступают контрольным сортам по наличию благоприятных аллелей генов, ассоциированных с важными хозяйственно ценными признаками, такими как масса 1 000 зерен, сниженная активность ферментов, ухудшающих качество муки и производимых из нее продуктов, содержание желтого пигмента в зерне и могут быть включены в селекционный процесс для ускоренного получения новых высокоурожайных, с повышенным качеством зерна, сортов пшеницы и тритикале.
Список использованных источников
1. Генофонд, методы и приоритеты селекции ярового тритикале в Беларуси / С. И. Гриб [и др.]. - Инновационные сорта и технологии возделывания ярового тритикале / редкол.: С. М. Лукин, И. В. Русакова, А. М. Тысленко; Всероссийский научно-исследовательский институт органических удобрений и торфа. -Владимир; Иваново, 2017. - С. 59-79.
2. Progress in doubled haploid technology in higher plants / M. W^dzony [et. al.]. - Advances in haploid production in higher plants / eds.
A. Touraev [et al.]. - Dordrecht, 2009. - P. 1-33.
3. Djamila, K. Using inter simple sequence repeat (ISSR) markers to study genetic polymorphism of pistachio (Pistacia vera L.) in Algeria / K. Djamila,
B. Ammar, M. Med. - African J. of Biotechnology.
- 2012. - Vol. 11, 29. - Р. 7 354-7 360.
4. Girma, G. Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) analysis of wild and cultivated rice species from Ethiopia / G. Girma, K. Tesfaye, E. Bekele.
- African Journal of Biotechnology - 2010. -Vol. 9, № 32. - P. 5 048-5 059.
5. Molecular characterization of 87 functional genes in wheat diversity panel and their association with phenotypes under well-watered and water-limited conditions / M. Khalid [et al.]. - Front. Plant Sci. - 2019. - Vol. 10 - Art. 717.
6. Utilization of KASP technology for wheat improvement / B. Kaur [et al.]. - Cereal Research Communications. - 2020. - Vol. 48. - P. 409-421.
7. Physical map of the wheat high-grain protein content gene Gpc-B1 and development of a high-throughput molecular marker / A. Distelfeld [et al.]. - New Phytol. - 2006. - Vol. 169, № 4. -
P. 753-63.
8. Validation of candidate gene-based markers and identification of novel loci for thousand-grain weight in spring bread wheat / D. Sehgal [et al.].
- Frontiers in Plant Science. - 2019. - Vol. 10. -Art. 1189.
9. Лагуновская, Е. В. Эффективность использования различных типов индукционных питательных сред при культивировании пыльников гексаплоидного тритикале / Е. В. Лагуновская, О. И. Зайцева, В. А. Лемеш. - Факторы экспериментальной эволюции организмов: Сб. науч. трудов. - Национальная академия наук Украины, Институт молекулярной биологии и генетики, Укр. о-во генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова; редкол.: В. А. Кунах (гл. ред.) [и др.]. - К.: Укр. о-во генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова, 2019. - Т. 25.
- С. 260-265.
10. Анализ межлинейного полиморфизма и степени гомозиготности линий удвоенных гаплоидов тритикале с помощью микросателлитных маркеров / Е. В. Лагуновская [и др.]. - Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2020. - Т. 64, № 2. -С.199-208.
11. Дорохов, Д. Б. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов / Д. Б. Дорохов, Э. Клоке. - Генетика. -1997. - Т. 33, № 4. - С. 443-450.
12. Assessment of genetic diversity among wheat selected genotypes and local varieties for salt tolerance by using RAPD and ISSR analysis / D. Majeed [et al.]. - Iraqi Journal of Science. -2018. - Vol. 59. - P. 278-286.
13. Khaled, A. Identification of ISSR and RAPD markers linked to yield traits in bread wheat under normal and drought conditions / A. G. A. Khaled, M. H. Motawea, A. A. Said. -J Genet Eng Biotechnol. - 2015. - Vol 13, № 2.
- P. 243-252.
14. The National Center for Biotechnology Information [Electronic resource]. - Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/ GCF_018294505.1. - Date of access: 16.02.2023.
15. TaTGW6-A1, an ortholog of rice TGW6, is associated with grain weight and yield in bread wheat / M. Hanif [et al.]. - Mol Breed. - 2016. -Vol. 36. - Art. 1.
16. Natural variation of TaGASR7-A1 affects grain length in common wheat under multiple
cultivation conditions / L. L. Dong [et al.]. - Mol Breed. - 2014. - Vol. 34. - P. 937-947.
17. TaGS-D1, an ortholog of rice OsGS3, is associated with grain weight and grain length in common wheat / Y. Zhang [et al.]. - Mol Breeding. - 2014. - Vol. 34. - P. 1 097-1 107.
18. Specificity of expression of TaCKX family genes in developing plants of wheat and their co-operation within and among organs / H. Ogonowska [et al.]. - PLoS One. - 2019. -Vol. 14, № 4. - Art. e0214239.
19. Mapping quantitative trait loci for peroxi-dase activity and developing gene-specific markers for TaPod-A1 on wheat chromosome 3AL / J. Wei [et al]. - Theor Appl Genet. - 2015. -Vol. 128. - P. 2067-2076.
20. Allelic variation at the TaZds-A1 locus on wheat chromosome 2A and development of a functional marker in common wheat / C. Dong [et al.]. - Journal of Integrative Agriculture. - 2012.
- Vol. 11, № 7. - P. 1 067-1 074.
21. Development of functional markers for a li-poxygenase gene TaLox-B2 on chromosome 4BS in common wheat / H. W. Geng. - Crop Science.
- 2011. - Vol. 52. - P. 568-576.
22. Association of phytoene synthase Psy1-A1 and Psy1-B1 allelic variants with semolina yellowness in durum wheat (Triticum turgidum L. var. durum) / K. M. Campos [et al.]. - Euphyti-
ca. - 2015. - Vol. 207. - P. - 109-117.
23. Genetic characterization and expression analysis of wheat (Triticum aestivum) line 070R1074 exhibiting very low polyphenol oxidase (PPO) activity / S. M. Hystad [et al.]. - Theor Appl Genet. - 2015. - Vol. 128. - P. 1 605-1 615.
24. Strong presence of the high grain protein content allele of NAM-B1 in Fennoscandian wheat / J. Hagenblad [et al.]. - Theor. Appl. Genet. - 2012. - Vol. 125. - P. 1 677-1 686.
25. The allelic distribution and variation analysis of the NAM-B1 gene in Chinese wheat culti-vars / X. Chen [et al.]. - J. Integr. Agric. - 2017.
- Vol. 16. - P. 1 294-1 303.
26. Cloning and phylogenetic analysis of phytoene synthase 1 (Psy1) genes in common wheat and related species / J. Wang [et al.]. - Hereditas.
- 2009. - Vol. 146, № 5. - P. 208-256.
27. Определение аллельного состава генов, контролирующих качество зерна у пшеницы и тритикале, с использованием технологии KASP / Е. В. Лагуновская [и др.]. - Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы: материалы V Междунар. науч. конф., Минск, 21-25 ноября 2022 г. - Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский [и др.].
- Минск, 2022. - С. 51.
E. V. Lagunovskaya
EVALUATION OF HOMOZYGOSITY AND THE ALLELIC COMPOSITION OF GENES ASSOCIATED WITH ECONOMICALLY VALUABLE TRAITS IN DOUBLED HAPLOID WHEAT AND TRITICALE LINES
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: e.antonenko@igc.by
Aiming to determine the homozygosity degree of doubled haploid wheat and triticale lines developed using an induced in vitro androgenesis technique, an analysis of the intralinear polymorphism of 71 genotypes (18 wheat lines and 53 triticale lines) was carried out by 13 ISSR loci. Homozygosity for 14 DH wheat lines and 24 DH triticale lines was confirmed. KASP genotyping of selected homozygous lines was carried out by four genes associated with the trait "thousand kernel weight" (TaTGW6-A1, TaGASR7-A1, TaGs3-D1 and TaCKX-D1) and six genes (Gps-B1, TaPod-A1, Zds-A1, Lox-B1, Psy-A1 and Ppo-A1) controlling the quality characteristics of grain. It was shown that all investigated lines carry at least two favourable alleles of the aforementioned genes. Seven wheat genotypes and three triticale genotypes, carrying the complex of favourable alleles, were selected.
Keywords: wheat, triticale, Triticum aestivum, xTriticosecale Wittm., doubled haploid lines, ISSR loci, KASP, thousand kernel weight, quality grain characteristics.
Дата поступления в редакцию: 8 февраля 2023 г.
