CC BY
822
Вадим Демидчик,
декан биологического факультета БГУ, доктор биологических наук, доцент
Мария Черныш,
научный сотрудник и аспирант кафедры клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ
Татьяна Дитченко,
доцент кафедры клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ, кандидат биологических наук, доцент
ЕленаСпиридович,
заведующая лабораторией прикладной биохимии Центрального ботанического сада НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент
Дарья Пржевальская,
научный сотрудник кафедры клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ
Владимир Падутов,
заведующий лабораторией генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси, член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, доцент
Аннотация. В статье обобщены научные принципы, достижения и факторы, лимитирующие использование микроклонального размножения растений. Ключевые слова: микроклональное размножение, вегетативное клонирование, эксплант, культура in vitro, высшие растения, фитогормоны, биотехнология растений, стерильные условия.
реди важнейших областей современной биотехнологии особое место занимает
^^ микроклональное
^^^^^ размножение растений, находящее широкое практическое приложение: от фундаментальных научных исследований до производства посадочного материала сельскохозяйственных растений и лесных пород деревьев [1, 3, 5, 6, 11, 14]. Для этого используются небольшие образцы растительного материала, обычно содержащие меристематические клетки - экспланты; в результате из одного небольшого растения или его части можно получить
множество микроклонов - миниатюрных копий оригинального организма [2-4, 14, 15].
Исторически техника подобного размножения развивалась одновременно и во взаимосвязи с технологией культивирования in vitro [2-4, 9, 12]. Можно выделить следующие основные вехи в ее становлении как раздела физиологии и биотехнологии растений: проведение первых экспериментов по выделению и поддержанию жизнеспособности растительных клеток австро-германским физиологом растений Готлибом Хабер-ландтом в конце XIX в. и выдвижение им в 1902 г. теории тоти-потентности, то есть способности
отдельных растительных клеток развиться в целый организм. Работы 1910-х и 1920-х гг. по созданию асептической культуры корней американским ученым Вильямом Роббинсом и германским физиологом Вальтером Котте; исследования 1930-1940-х гг. научной школы Калифорнийского института технологии и других мировых центров в области асептической культуры почек и побегов впервые позволили стандартизировать компоненты сред и условия выращивания in vitro. В 19301960-х гг. появилась теория неограниченного роста растительных тканей в условиях in vitro, а также теоретических и практических основ гормонально-регулируемого каллусо- и органогенеза, становление и оптимизация техники микроклонирования in vitro (работы американских, французских и германских физиологов П. Но-беркорта, Ф. Р. Уайта, Р. Ж. Готре, Ж. Мореля, Ф. К. Стюарда, Ж. Рей-нерта, Ф. Скуга, И. К. Кукинга, И. К. Васил, В. Васил, Т. Мураши-ге, П. Махешвари, С. Г. Мукхерджи, А. К. Хильдебрадта, А. Ж. Рикер, Т. А. Тхорп). В 1950-1980-е гг. происходило бурное развитие методов in vitro и микроклонального размножения как нового раздела физиологии растений, характеризовавшееся интеграцией разработанных подходов в исследовании морфогенеза и эмбриогенеза растений, фитогормональной регуляции (открытие цитокининов), первичного и вторичного метаболизма, генетической трансформации, организации внутриклеточных структур и др. С конца 1980-х гг. по настоящее время интенсивность фундаментальных исследований в области культур in vitro и микроклонального размножения снижалась на фоне их
Рис. 1. Примеры использования технологий микроклонального размножения растений на базе белорусских научных биотехнологических школ
A. Индукция морфогенеза и развитие растений-регенерантов гладиолуса сорта Диво Дивное
из латеральной меристемы почки клубнелуковицы (слева) и меристемы клубнепочки (справа). ЦБС НАН Беларуси
B. Рододендрон гибридный сорта HelsinkyUniversity (слева) и высокопроизводительная культура его микроклонов на питательной среде WPM с добавками 5 мг/л И6-(2-изопентил) аденина и 1 мг/л индолил-3-уксусной кислоты. ЦБС НАН Беларуси
C. Растения каттлеи гибридной (Cattleyahybridum), полученные при помощи семенного размножения in vitro (слева) и микроклоны чубушника венечного (Phlladelphus coronarius), готовые к выведению ex vitro (справа), культивируемые на среде WPM и Orchimax. Биологический факультет БГУ
D. Микроклоны дуба черешчатого Quercusrobur L.) и липы сердцевидной (Tilia cordata Mill.)
в стерильной культуре, полученной в Институт леса НАН Беларуси (справа и слева соответственно)
интеграции в практические разделы биологии и коммерческую биотехнологию.
Научные и практические центры микроклонального размножения растений существуют в Беларуси, Российской Федерации, Украине, Казахстане, Туркменистане, Молдове и других государствах постсоветского пространства [1-2, 6, 11, 15]. Исторически их развитие связано с работами 1960-х гг. научной школы Р. Г. Бутенко, создавшей в Институте физиологии растений РАН первую и крупнейшую в СССР школу культур клеток, тканей и органов растений [2, 4]. В нашей стране пионерами микроклонального размножения растений были Т. И. Фоменко (Центральный ботанический сад НАН Беларуси), Н. А. Картель
(Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) и А. В. Кильчев-ский (Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, г. Горки) [3]. Сегодня основными центрами микроклонального размножения в нашей стране являются ЦБС [1], Институт леса [5], Институт плодоводства, Институт генетики и цитологии, Гродненский зональный институт растениеводства НАН Беларуси, кафедра клеточной биологии и биоинженерии растений биологического факультета БГУ, Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, биотехнологический факультет Полесского государственного университета, Республиканский лесной селекционно-семеноводческий центр, лаборатория микроклонального размножения
картофеля ОАО «Агро-Мотоль», крестьянское фермерское хозяйство «Ягодка», компания ElitKlon и др. На рис. 1 продемонстрированы фотографии микроклонов растений, полученных в некоторых из этих центров.
Можно выделить несколько оформившихся научно и успешных коммерчески направлений использования культур in vitro и микроклонального размножения растений (рис. 2) [2, 3, 6, 9-11, 14].
Более подробно рассмотрим основные стадии микроклонального размножения растений.
Схема микроразмножения
Подходы, применяемые для размножения растений in vitro, проиллюстрированы на рис. 3. Они представлены
Рис. 2. Сферы использования метода культуры клеток, тканей и органов растений
кулыус s мер чете и
Исходное растение
МшфСра^гени е
noes ое пн
Прсростки
Рис. 3. Способы размножения и регенерации растений in vitro
Суспелзийина*
1ИП 11ПЛ1(Ж|
множественным побегообразованием из пазушных почек и формированием адвентивных побегов и/или адвентивных соматических эмбрионов, которые могут быть получены напрямую из экс-планта (части ткани или органа исходного растения), непрямым способом из недифференцированных клеток (суспензионной культуры) или тканей (каллусных культур) или из частично дифференцированных каллусных тканей, а также из пропагационных телец (протокормов или псевдоклубней) [2-4, 9]. На практике для большинства растений используется первый метод, однако
для некоторых доступны только второй и третий. В одной культуре могут наблюдаться несколько способов побегообразования и эмбриогенеза.
Существуют 2 подхода для преодоления апикального доминирования и индукции роста боковых побегов: горизонтальное культивирование интактных побегов на питательной среде (размножение отводками in vitro или in vitro layering) и субкультивирование частей побега, содержащих одну или несколько пазушных почек (рис. 4). При переносе на свежий субстрат листья обычно удаляются: таким образом, эксплант
представляет собой участок стебля, несущий одну почку или более.
Основные технические аспекты микроклонального размножения растений
Микроклональное размножение в большинстве случаев включает 3 последовательные стадии: получение асептической культуры; мультипликацию, то есть увеличение количества/размножение пропагул; подготовку для адаптации микроклонов в почве [12]. Дополнительно можно выделить подготовку маточных растений к получению из них первичных
эксплантов для введения в культуру in vitro, а также завершающую стадию адаптации клонированных растений к условиям ex vitro [9, 15]. Таким образом, можно рассматривать 5 стадий данной технологии.
Подготовка маточных растений
Ключевая задача данной стадии - снижение потенциального содержания микроорганизмов (главным образом, грибов) в будущем экспланте, облегчение доступа к меристемам, увеличение их размеров и жизнеспособности [3, 4, 9, 15]. В этой связи для некоторых видов, например для древесных растений, часто используется так называемая выгонка молодых побегов непосредственно перед выделением эксплантов -молодых почек, верхушечных
побегов и сегментов стебля, содержащих меристемы [3]. Для травянистых форм часто создается первичная культура целых растений из семян, что значительно повышает эффективность дальнейших этапов получения высокопроизводительных систем размножения [9]. Такой подход применяется для асептических культур арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.), рапса (Brassica napus E.H.L.Krause), томатов (Solanum lycopersicum L.), декоративных орхидных (Phalaenopsis spp.) и др.
Введение растений в асептическуюкультуру (этап I)
На данном этапе осуществляется стерилизация растительного материала и перенос
на питательные среды изолированных эксплантов, которые дают рост микрорастениям или недифференцированной защитной ткани - каллусу [2, 3, 9]. Обычно первичный прирост наблюдается в период от 3-10 суток (травянистые) до 1-3 месяцев (древесные) [3, 12]. Задача этапа - получение стерильных и жизнеспособных эксплантов, способных к росту и развитию in vitro. Для некоторых растений достижение необходимой степени стерильности или развитие в таких условиях оказывается невозможным. Данный феномен называется реданд-ностью к культивированию in vitro. У многих древесных растений, таких как дуб, ель, сосна и др., этот показатель высок, что связано с большой развитостью микоризных грибов внутри их тканей.
Рис. 4. Варианты индукции роста боковых побегов. Вверху: горизонтальное культивирование, внизу: субкультивирование частей
Одним из центральных вопросов на этой стадии является подбор обработок [9, 10, 15] для стерилизации, которая часто проводится в несколько этапов. Первично экспланты промываются растворами, содержащими детергенты и фунгициды. Продолжительность этой стадии занимает от 15 мин до нескольких часов. Затем производится обработка мощными биоцидными препаратами. Для этого применяют гипохлорит (10-40%), спирт (20-100%), хлорид ртути (0,2-2%), сульфат меди (0,2-2%), перекись водорода (1-20%), нитрат серебра (0,1-2%) и другие вещества в концентрациях, вызывающих гибель грибов и бактерий, но не убивающих растения. Обработки могут быть импульсными (от 10 с до 1-2 мин) или продолжительными (до 1 ч), часто они комбинированные и последовательные. Большая проблема на данной стадии - гибель и повреждение эксплантов. Подбор стерилизаторов может занять до 1 года, а в некоторых случаях он так и не завершается успехом. Серьезные затруднения при введении растений в культуру вызываются внутренней инфекцией/ контаминацией, то есть развитием грибов или бактерий внутри экс-планта, имеющего ослабленный иммунитет. На фоне высокого содержания сахаров микроорганизмы часто размножаются ускоренными темпами. Таким образом, борьба с внутренней инфекцией часто становится сложной и порой непреодолимой проблемой.
Составы специализированных сбалансированных минеральных сред, таких как «Мура-сиге и Скуга», «Као и Михайлю-ка», «Гамборга», «Ллойда и Мак-коуна», «Линдсмайера», «Нитша», «Литвая», «Орхимакс» и др., были
разработаны под определенные протоколы культивирования in vitro, виды растений и особые типы экспериментов [2-4, 10, 15]. В зависимости от особенностей объекта и его отзывчивости к условиям in vitro в среды могут вводиться различные фитогормоны. Очень часто используются ци-токинины (0,05-5 мг/л кинети-на, 6-бензиламинопурина, зеа-тина или др.), так как они стимулируют рост побегов в культуре in vitro, блокируя рост корневой системы. Также могут добавляться вещества, такие как витамины и источники природной органики (дрожжевой экстракт, кокосовая вода, картофельный отвар, фруктовые соки, меласса, патока и др.), которые для некоторых культур стимулируют процессы роста и развития. Однако добавки, имеющие неизвестный состав, снижают возможности стандартизации исследований и биотехнологических производств.
Мультипликация, увеличение количества/размножение пропагул (этап II)
Данная стадия обеспечивает увеличение количества растений в результате их клонирования [2-4, 9]. Это реализуется микрочеренкованием in vitro или индукцией соматического эмбриогенеза - формированием эмбрионов в обычных тканях или предварительно полученном каллусе (реже в суспензионной культуре).
Для сохранения сортовых признаков, которые часто наследуются эпигенетически или только при наличии интактных меристем, часто используется микрочеренкование, поскольку оно обладает меньшей инвазивно-стью и влиянием на структуру меристем, чем соматический
эмбриогенез [3-4, 10, 15]. Однако микрочеренкование отличается невысоким коэффициентом раз-множения/пропагации. Обычно для древесных растений можно получать 4-5 микроклонов из одного в течение 1,5-3 месяцев, то есть при дальнейшем субклонировании («расклоне») около тысячи микроклонов за год. В реальности эта цифра значительно ниже, так как происходит выбраковка растений, зараженных при пересадке, наблюдается непредсказуемое снижение скорости роста, повреждение растений или даже их синхронная гибель (характерно для редандных древесных видов). Для многих травянистых культур используется соматический эмбриогенез, обычно демонстрирующий более высокие коэффициенты размножения [7, 9]. Для некоторых растений возможно образование эмбриогенного каллуса. Каллусогенез обычно стимулируется фитогормональ-но - равными высокими уровнями ауксинов и цитокининов. Перевод растений в дальнейшем на безгормональную среду или среду с невысоким уровнем цитокининов приводит к формированию в каллусной ткани эмбрионов. Полученные микроклоны могут пересаживаться на новые среды или выводиться в условиях ex vitro (рис. 2).
Подготовка для адаптации микроклонов в почве (этап III)
Перед выведением растений в условия ex vitro необходимо простимулировать рост корневой системы [3-4, 12]. В случае размножения микрочеренкованием все чаще используются безгормональные среды, позволяющие формироваться у микроклонов корневой системе.
При соматическом эмбриогенезе из ткани или каллуса (рис. 3) может понадобиться индукция формирования корневой системы, что достигается переводом про-пагул со сред, содержащих цито-кинины, на безгормональные или содержащие ауксин (0,05-5 мг/л) среды [2, 7].
Так или иначе подготовка к адаптации связана с получением относительно крупных, жизнеспособных и имеющих корень микрорастений. Хотя имеются методики использования растений без корней, они обычно не применяются на практике, так как дают низкий выход жизнеспособных растений. Иногда используется снижение уровня минеральных солей и концентрации сахарозы [2-4]. Однако такой прием «преадаптации» требует дополнительных трудоемких манипуляций и его эффективность обычно невысока.
Адаптация микроклонов к условиям ex vitro (завершающий этап)
Производится открывание культивационных сосудов и прекращение использования стерильных условий. Растения отмываются от гелевой среды и в большинстве случаев обрабатываются кор-нестимуляторами, содержащими ауксины (10-200 мг/л). Затем они высаживаются в твердый субстрат, который может иметь разнообразный состав: торф, вермикулит, перлит, диатомит, керамзит, песок и др. [3-4, 9]. В большинстве случаев подбирается их смесь. Например, часто используются торф с вермикулитом в соотношении 1:1, 1:2, 2:1, торф, песок и вермикулит - 1:1:1, 1:1:3 и др. Субстрат может стерилизоваться в автоклаве, что всегда способствует лучшему выживанию
и укоренению микрорастений, однако это не всегда экономически целесообразно в условиях крупных питомников с большими объемами производства. В течение 2-10 суток после перевода в условия ex vitro микроклоны помещаются в условия повышенной влажности воздуха, что позволяет побегам лучше адаптироваться [2-4, 15].
Стадия перевода в условия ex vitro часто является лимитирующей для микроклонально-го размножения растений [2-5]. Осмотический и механический стресс, а также заражение грибами и бактериями может элиминировать до 100% микроклонов при их адаптации (обычно эта цифра составляет более 50%). Растения при этом ослаблены, их устьич-ный аппарат недоразвит, они поначалу не способны самостоятельно производить сахара и другие метаболиты [2-5, 9, 15]. Поэтому на данной чувствительной стадии могут быть использованы биоциды (фунгициды), адапто-гены (брассиностероиды, корне-стимулирующие и фунгостатиру-ющие бактерии), антиоксиданты (L-аскорбат, восстановленный глу-татион и др.) [3, 9, 15]. Для различных растений эффективность обработок этими агентами разнится, но в целом при тщательном их подборе отмечается положительный результат.
Проблемы, возникающие при микроклональном размножении растений
Каждый из этапов технологии микроклонального размножения сопряжен с определенными техническими трудностями. Некоторые виды, экотипы и сорта растений редандны к культивированию
in vitro, часть их не может дать жизнеспособные экспланты при стерилизации ввиду внутренней инфекции [3-5, 10, 15]. Распространенной проблемой является контаминация ввиду потери стерильности системы в процессе культивирования. Иногда наблюдается подавление роста и гибель эксплантов вследствие накопления ингибиторов фенольной природы, в этом случае используются добавки антиоксидантов, активированного угля, культивирование в жидкой среде, пересадки на свежие среды [2-4]. При длительном культивировании может наблюдаться витрификация побегов (повышенное содержание воды), подавление пролиферации пазушных меристем, формирование каллуса и побегов с измененной морфологией и др. [2-4, 9, 10, 15]. При переводе в условия ex vitro часто происходит поражение грибами (реже бактериями), стрессированными при смене условий культивирования растений, остановка роста клонированных образцов, модификация их развития и др. [10, 15].
Исключительно важной проблемой микроклонального размножения, лимитирующей использование данной технологии, являются стабильные изменения физиологии, анатомии и генетики растений при прохождении стадии каллуса или суспензионной культуры перед индукцией соматического эмбриогенеза [3, 5, 14]. В этом случае очень часто наблюдается дварфизм (карликовость) и устойчивые аномалии развития, многие сорта декоративных растений при этом утрачивают ценные фенотипи-ческие признаки.
Предложены многие альтернативы микроклонам (пробирочным
растениям) и их классической адаптации. Это сформированные in vitro микроклубни, микролуковицы, микроклубнелуковицы, а также искусственные семена (микрорастения, инкапсулированные в альгинат или другой гель), которые позиционируются как устойчивые к хранению и транспортировке и могут высаживаться в грунт без адаптации [2, 9, 10, 15]. Технологии производства и использования искусственных семян развиваются в основном в Индии и других азиатских странах. Пока сложно произвести адекватную оценку их эффективности, поскольку работы по данной тематике не представлены в авторитетных рецензируемых журналах. Также важно заметить, что такая техника производства практически не нашла применения в Голландии, США, Германии и в других странах - мировых лидерах в области биотехнологии растений.
Немаловажным лимитирующим фактором является и то, что технология микроклональ-ного размножения более затратна по сравнению с традиционным вегетативным размножением. Кроме того, для ее реализации требуется опытный и высококвалифицированный персонал, специализированное оборудование и дорогостоящие реактивы. Несмотря на попытки обеспечения автоматизации отдельных операций, данная технология предполагает значительную долю ручного труда.
Перспективы развития микроклонального размножения растений в Беларуси
В нашей стране важно сохранить и расширить существующие научные школы в области
микроклонального размножения и экспериментальной биологии растений в целом. Владение данной технологией открывает для Беларуси серьезные перспективы в важнейших разделах биотехнологии растений. Об этом свидетельствует постоянное увеличение количества коммерческих частных компаний, использующих технику микроклонального размножения. В будущем несомненный интерес будут представлять работы с использованием техники микроклонирования для генетической трансформации и оздоровления сельскохозяйственных растений. Среди актуальных направлений для нашей страны в области микроклонального размножения можно также отметить создание банков
культур отдельных исторически важных и плюсовых растений. Особое внимание будет уделяться соматическому эмбриогенезу у хвойных и лиственных лесных древесных видов и автоматизации размножения путем использования биореакторов. Важной перспективой дальнейшего развития техники микроклонального размножения также является внедрение инновационных физиологических и в особенности феномных подходов, позволяющих производить цифровой анализ фенотипа, например ценных декоративных сортов и куль-тиваров [16, 17], что позволит автоматизировать отбор микроклонов в промышленном масштабе и повысит качество селекционного процесса.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Асептическая коллекция и банк ДНК Центрального ботанического сада НАН Беларуси как эффективные инструменты сохранения редких растений / Е. В. Спиридович [и др.] // Весц Нацыянальнай акадэмм навук Беларусь Серыя билапчных навук. 2017. №3. С. 117-128.
2. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: учеб. пособие / Р. Г. Бутенко - М., 1999.
3. Картель Н. А. Биотехнология в растениеводстве: учебник / Н. А.Картель, А.В. Кильчевский. - Минск, 2005.
4. Катаева Н. В. Клональное микроразмножение растений / Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. - М., 1983.
5. Падутов В. Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В. Е. Падутов, О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. - Минск, 2007.
6. Решетников В. Н. Биотехнология растений и перспективы ее развития / В. Н. Решетников, Е. В. Спиридович, А. М. Носов // Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46, №1. С. 3-18.
7. Advances in conifer somatic embryogenesis since year 2000 / K. Klimaszewska [et al.] // In vitro embryogenesis in higher plants. - Humana Press, NewYork, 2016. P. 131-166.
8. Evaluation of a new temporary immersion bioreactor system for micropropagation of cultivars of eucalyptus, birch and fir / E. Businge [et al.] // Forests. 2017. V. 8. N6. P. 196.
9. George E. F. Plant propagation by tissue culture / E. F. George, M.A. Hall, G. J. De Klerk. 3rd Edition. Vol 1. The Background. Edited by Springer, Dordrecht, The Netherlands, 2008.
10. Loyola-Vargas V. M. Plant Cell Culture Protocols / V. M. Loyola-Vargas, F. Vázquez-Flota. Second Edition. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2006.
11. Modern applications of plant biotechnology in pharmaceutical sciences / S. Bhatia, K. Sharma, R. Dahiya, T. Bera. 1st Edition. Academic Press, 2015.
12. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Annual Review of Plant Physiology. 1974. Vol. 25, N1. P. 135-166.
13. Non-zygotic embryogenesis in hardwood species / E. Corredoira [et al.] // Critical Reviews in Plant Sciences. 2018. P. 1-69.
14. Slater A. Plant biotechnology: The genetic manipulations of plants / А. Slater, N. Scott, M. Fowler. Oxford University Press, 2003.
15. Smith R. Plant tissue culture: Techniques and experiments / R. Smith. 3rd Edition. Academic Press. 2012.
16. Бондаренко В. Ю. Анализ фенотипа декоративных растений с использованием искусственных нейронных сетей: определение таксономических и физиологических характеристик / В. Ю. Бондаренко [и др.] // Журнал Белорус. гос. ун-та. Биология. 2019. №1. С. 25-32.
17. Шашко А. Ю. Разработка системы фенотипирования древесных растений при помощи алгоритмов машинного зрения и спектрального анализа / А. Ю. Шашко [и др.] // Журнал Белорус. гос. ун-та. Биология. 2019. №1. С. 33-44.
rjJSE^b http://innosfera.by/2019/06/reproduction of plants
