CC BY
93
Перспективная технология размножения платана испанского для зеленого строительства на юго-западе Ростовской области
М.М. Середа, Б.Л. Козловский, Е.В. Луценко Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону
Аннотация: Для введения платана испанского в культуру in vitro наиболее эффективно использовать в качестве эксплантов семядольные листья, полученные из трехнедельных проростков. Установлено, что оптимальной средой для индукции каллусогенеза является среда МС с добавлением 2мг БАП + 0,02 мг 2,4 Д + 0,2 мг ИУК. Эмбриогенез в каллусных клетках платана с довольно высокой частотой индуцируется на среде МС с добавлением 1 мг БАП + 0,1 мг НУК.
Ключевые слова: микроклональное размножение, безвирусные растения, платан испанский, зеленое строительство.
Зеленое строительство в Ростовской области остро нуждается в высоко декоративных, быстрорастущих, долговечных и, при этом устойчивых к комплексу неблагоприятных факторов окружающей среды, древесных растениях.
К таким растениям следует отнести малораспространенный в озеленении региона платан испанский или кленолистный (Platanus х hispanica Mill. ex Muenchh.). В местной культуре это дерево до 20 м высотой, с широко раскидистой, шатровидной кроной и прямым, стройным стволом. Кора отслаивается крупными пластинами, от чего ствол приобретает красивый пятнистый узор. Листья крупные, плотные, дланевидные, с лопастями, остропильчатыми по краю. Цветки неприметные. Узкопирамидальные семянки собраны в плотные шаровидные соплодия, повисающие на длинных плодоножках. В условиях населенных пунктов юго-запада области достаточно зимостоек. В молодом возрасте подмерзает однолетний прирост, но с возрастом зимостойкость повышается. Не пригоден для озеленения открытых пространств с преобладающими восточными ветрами в зимний период, здесь может вымерзать до уровня снегового покрова или почвы. Засухоустойчив. Повреждения вредителями
незначительны. На некоторых питомниках юга России заражен раком и другими заболеваниями. Аккумуляции болезней способствует вегетативный способ размножения этого вида (черенкование). Размножение семян непродуктивно и может приводить к утрате свойств исходного образца. Платан испанский цветет в мае, плодоносит в октябре - ноябре. Предпочитает плодородные, хорошо увлажненные почвы. Растет быстро. Декоративная долговечность 40-50 лет. Декоративен корой, красивой кроной, листьями, окрашивающимися осенью в красновато-бронзовые тона и шаровидными плодами, сохраняющимися на ветвях после листопада. Перспективен для одиночных, групповых и аллейных посадок в населенных пунктах юго-запада Ростовской области.
Наряду с необходимостью расширения ассортимента декоративных растений, особую проблему для региона в настоящее время представляет высокая степень поражения древесных культур вредителями и болезнями [1], что приводит к снижению декоративных качеств, сокращению продолжительности онтогенеза, а для ряда видов к гибели. По этой причине ряд древесных пород, таких как березы, черные тополя, вязы и др. стали непригодны для озеленения и исключены из основного и дополнительного ассортимента населенных пунктов юго-запада Ростовской области [2].
Существующая проблема осложняется следующим:
1. В России и мире практически не ведется селекция декоративных растений на устойчивость к вредителям и болезням, за исключением некоторых культур, например, роз;
2. В пределах населенных пунктов невозможно вести эффективную борьбу с вредителями и болезнями растений с помощью химических средств, а биологические методы не дают практических результатов;
3. Для многих вирусных, бактериальных и грибных заболеваний, отсутствуют действенные средства борьбы.
Одним из путей решения этой проблемы является повышение резистентности растений путем получения безвирусного материала в процессе микроклонирования. Этот метод хорошо зарекомендовал себя на плодовых культурах [3], но не нашел еще широкого применения в сфере зеленого строительства. Комплексная методика получения посадочного материала, свободного от вирусов и микроорганизмов, включает в себя несколько этапов: выделение меристемы, введение в культуру in vitro, микроклональное размножение, укоренение мериклонов, адаптация регенерантов к почвенным условиям. Решающим звеном является процесс введения в культуру эксплантов, взятых с маточного растения и дальнейшее тиражирование материала или микроклонирование.
Поэтому целью работы было разработка технологии размножения платана испанского микроклональным методом. Особым требованием к технологии является ее производительность, которая должна не уступать таковой при размножении платана черенками.
Методы и материалы исследования
Для введения в культуру in vitro платана испанского в качестве экплантов были выбраны фрагменты молодых побегов длиной не более 2 см, молодые весенние листья и фрагменты проростков (семядоли с гипокотилем) на второй неделе развития. Побеги собирали со взрослых экземпляров платана испанского в конце февраля 2014 года и ставили на проращивание при t 25 C на свету. Молодые побеги и листья промывались в теплой мыльной воде 20 минут, затем отмывались в проточной воде. Последующие этапы стерилизации осуществлялись в условиях ламинар-бокса. Вначале экспланты обрабатывались 70% раствором этанола, а затем соответствующим стерилизующим агентом, в разных режимах с применением 0,1% сулемы, 5% раствора гипохлорита натрия, либо 3% раствором перекиси водорода. После трехкратно промывались в стерильной
дистиллированной воде по 15 минут. Эффективность стерилизации определяли по доле выживших свободных от микроорганизмов эксплантов, выраженной в процентах. Выборка составляла 20 экплантов на каждый вариант опыта.
Для введения в культуру in vitro использовалась среда Мурасиге-Скуга [4], широко применяемая для культивирования древесных растений [5-8]. В качестве гелеобразующего средства добавляли 7 г/л агара, кроме того, 30 г/л сахарозы, 6-бензиламинопурина (БАП), тидиазурона (ТДЗ), из ауксинов: индолилуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК), 2,4 -дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д). PH среды доводился до значения 5,8 с помощью 1 М KOH. Стерилизация сред проводилась в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 минут. Культура помещалась в условия 16-часового фотопериода при температуре 25 °С.
Результаты исследования и их обсуждение
Выбор экспланта для введения в культуру in vitro, как правило, определяется целью исследования. Учитывая, что наиболее быстрым способом микроклонального размножения является метод микрочеренкования в асептических условиях, в качестве экспланта первоначально были взяты побеги с 1-2 узлами. Попытки введения в культуру in vitro данных экплантов оказались безуспешными. Как правило, на 2-3 неделю культивирования на поверхности побегов обнаруживались микроорганизмы, развивающиеся, по-видимому, из внутренних тканей. Таким образом, исследования были направлены на получение каллусных культур по опыту наших предыдущих работ [9]. Индукцию каллусогенеза пытались осуществить из тканей молодых весенних листьев, взятых из распускающихся почек. Оптимальная схема поверхностной стерилизации таких листьев выглядела следующим образом: 70% спирт - 30 секунд, промывка в стерильной дистиллированной воде - 1 минута, 0,1% раствор
сулемы - 5 минут, трехкратная промывка в стерильной дисстилированной воде - по 15 минут. Варианты поверхностной стерилизации различных эксплантов и ее эффективность отражены в таблице 1.
Таблица № 1.
Эффективность поверхностной стерилизации экплантов платана испанского с приминением различных стерилизующих агентов.
Вещество Экспозиция, Эффективность стерилизации, %
минуты побеги листья семядоли
Гипохлорит 3 0 10 20
натрия, 5 % 5 0 15 25
10 0 10 5
Перекись 5 0 1 10
водорода, 3 % 10 0 5 15
15 0 7 15
Сулема, 0,1 % 3 0 40 90
5 0 60 70
10 2 30 5
Попытки индуцирования каллусообразования на листовых экплантах заключались в применении среды Мурасиге-Скуга с различным сочетанием фитогормонов, что отражено в таблице 2.
Таблица № 2
Индукция каллусогенеза на средах с различным сочетанием фитогормонов
Варианты использования фитогормонов Листья Семядоли
Безгормональная среда - -
БАП 2 мг/л - -
ТДЗ 0,4 мг/л - -
БАП 2 мг/л + 2,4 Д 0,02 мг/л + + +
ИУК 0,2 мг/л
БАП - 2 мг/л + 2,4 Д 0,02 мг/л + -
БАП 2 мг/л + ИУК 0,2 мг/л - -
На пятой неделе культивирования на фрагментах молодых листовых пластинок отмечалось развитие каллуса. Морфологически каллус описывался, как плотная масса светло-желтого цвета (рис. 1). Наибольший эффект индукции каллуса наблюдался на среде MS в сочетании с фитогармонами БАП - 2 мг/л и 2,4 Д - 0,02 мг/л. Тройная комбинация фитогормонов, таких как БАП - 2 мг/л, 2,4 Д - 0,02 мг/л и ИУК - 0,2 мг/л, также индуцировала каллусообразование, но в существенно меньшей степени. В ходе дальнейшей работы этот вид каллуса не удалось стимулировать к образованию соматических зародышей. По данным Y. Sun и др. [10] в качестве экспланта для получения каллуса успешно можно использовать листья, полученные из сеянцев. Этот метод слишком растянут во времени, поэтому было решено использовать для получения каллуса семядоли с гипокотилем. Семядольные листья платана в условиях темноты на третью неделю образовывали каллусные клетки. Каллусная масса имела плотную структуру светло-серого цвета. Культивирование этого каллуса на свету в течение 2 недель приводило к смене окраски на светло-зеленый (рис.3).
Эксперименты по индукции соматического эмбриогенеза в каллусных клетках платана проводили на разных комбинациях фитогормонов, используя приблизительно равные по массе участки каллусной ткани (табл. 3).
Таблица №3
Частота органогенеза в каллусе платана испанского на среде MS с различными комбинациями фитогармонов
№ БАП + НУК, мг Число очагов соматического эмбриогенеза Число повторностей
1 1+0,1 10
2 1+0,2 10
3 1+0,3 10
4 2+0,1 10
5 2+0,2 10
Наиболее удачным сочетанием оказалась среда MS c добавлением цитокининов и ауксинов, а именно, БАП — 1 мг и НУК — 0,1. На третьей неделе культивирования на участках каллусной ткани отмечено появление 34 морфогенетических очагов, впоследствии, регенерирующих полноценные растения.
Заключение
В ходе работы выяснено, что для введения платана испанского в культуру in vitro наиболее эффективно использовать в качестве эксплантов семядольные листья, полученные из трехнедельных проростков.
Установлено, что оптимальной средой для индукции каллусогенеза является среда МС с добавлением 2мг БАП, 0,02 мг 2,4 Д,0,2 мг ИУК.
Эмбриогенез в каллусных клетках платана с довольно высокой частотой индуцируется на среде МС с добавлением 1 мг БАП и 0,1 мг НУК.
Литература
1. Козловский Б.Л., Огородникова Т.К, Федоринова О.И., Куропятников М.В. Оценка устойчивости видов семейства Betulaceae S.F. Gray к болезням при
интродукции в Ростовской области // Экологический Вестник Северного Кавказа. Т.8, №4. Краснодар, 2012. С. 51-53.
2. Козловский Б.Л., Куропятников М.В., Федоринова О.И. Основной и дополнительный ассортимент древесных растений для зеленого строительства на юго-западе ростовской области // Инженерный вестник Дона, 2013, №2 URL: ivdon.ru/magazine/archive/n2y2013/1633.
3. Knapp E., Câmara Machado A., Puhringer H. Localization of fruit tree viruses by immuno-tissue printing in infected shoots of Malus sp. and Prunus sp. // Journal of Virological Methods. Vol. 55, Iss. 2. 1995, pp. 157-173.
4. Murashige T, Skoog F A revised medium for growth and rapid bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plant. Vol.15. 1962, pp. 473-497.
5. Bonga J.M., Aderkas P. In vitro culture of tree. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1992. 238 p.
6. Kim M.K., Sommer H.E., Bongarten B.C., Merkle S.A. Highfrequency induction of adventitious shoots from hypocotyl segments of Liquidambar styraciflua L. by thidiazuron // Plant Cell Rep. Vol.16. 1997, pp. 536-540.
7. Vieitez, A.M., San-José M., Vieitez E. In vitro plantlet regeneration from juvenile and mature Quercus robur L. // J. Hortic. Sci. Vol.60. 1985, pp. 99-106.
8. Peternel S., Gabrovsek K., Gogala N., Regvar M. In vitro propagation of European aspen (Populus tremula L.) from axillary buds via organogenesi // J. Hortic. Sci. Vol.121. 2009, pp. 109-112.
9. Козловский Б.Л., Середа М.М., Вардуни Т.В., Богословенко М.В. Технология размножения плосковеточника восточного (Platycladus orientalis (L.) Franco) для целей зеленого строительства в Ростовской области // Инженерный вестник Дона, 2014, №3 URL: ivdon.ru>magazine/archive/n2y2014/2386.
10. Yuehua S., Yanling Zh., Xiaojuan W. Adventitious bud regeneration from leaf expiants of Platanus occidentalis L. and genetic stability assessment // Acta Physiol Plant. Vol. 31. 2009, pp. 33-41.
References
1. Kozlovskij B.L., Ogorodnikova T.K, Fedorinova O.I., Kuropyatnikov M.V. Ekologicheskij Vestnik Severnogo Kavkaza. T.8, №4. Krasnodar, 2012. pp. 51-53.
2. Kozlovskij B.L., Kuropyatnikov M.V., Fedorinova O.I. Inzenernyj vestnik Dona (Rus), 2013, №2 URL: ivdon.ru/magazine/archive/n2y2013/1
3. Knapp E., Câmara Machado A., Puhringer H. Localization of fruit tree viruses by immuno-tissue printing in infected shoots of Malus sp. and Prunus sp. // Journal of Virological Methods. Vol. 55, Iss. 2. 1995, pp. 157-173.
4. Murashige T, Skoog F A revised medium for growth and rapid bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plant. Vol.15. 1962, pp. 473-497.
5. Bonga J.M., Aderkas P. In vitro culture of tree. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1992. 238 p.
6. Kim M.K., Sommer H.E., Bongarten B.C., Merkle S.A. Highfrequency induction of adventitious shoots from hypocotyl segments of Liquidambar styraciflua L. by thidiazuron // Plant Cell Rep. Vol.16. 1997, pp. 536-540.
7. Vieitez, A.M., San-José M., Vieitez E. In vitro plantlet regeneration from juvenile and mature Quercus robur L. // J. Hortic. Sci. Vol.60. 1985, pp. 99-106.
8. Peternel S., Gabrovsek K., Gogala N., Regvar M. In vitro propagation of European aspen (Populus tremula L.) from axillary buds via organogenesi // J. Hortic. Sci. Vol.121. 2009, pp. 109-112.
9. Kozlovskij B.L., Sereda M.M., Varduni T.V., Bogoslovenko M.V. Inzenernyj vestnik Dona (Rus), 2014, №3 URL: ivdon.ru>magazine/archive/n2y2014/2386.
10. Yuehua S., Yanling Zh., Xiaojuan W. Adventitious bud regeneration from leaf explants of Platanus occidentalis L. and genetic stability assessment // Acta Physiol Plant. Vol. 31. 2009, pp. 33-41.
