CC BY
179
15. Klem G.K. Planteavstandens virking pa granvizkets kvalitet // Meddelelser Fra Det. Norske Skogforoksvesen. — 1952. — Vol. 11, No. 3. — P. 473—506.
16. Merzlenko M.D., Kozhenkova A.A. Metodicheskie ukazaniya dlya uchebnoi praktiki po lesnym kul'turam v Losinom Ostrove. — M.: MGUL, 1996. — 32 s.
17. Georgievskii N.P. Nekotorye
soobrazheniya o vyrashchivanii lesnykh kul'tur // Lesnoe khozyaistvo. — 1957. — № 6. — S. 40-43.
+ +
18. Babich N.A., Merzlenko M.D., Evdokimov I.V. Fitomassa kul'tur sosny i eli v Evropeiskoi chasti Rossii. — Arkhangel'sk, 2004.
— 112 s.
19. Kuznetsov B.A. Predvaritel'nyi obzor statsionarnogo rasprostraneniya pozvonochnykh v Pogonno-Losinoostrovskom lesnichestve // Trudy po lesnomu opytnomu delu. — Vyp. IV (LXVIII). — Tsentral'naya lesnaya opytnaya stantsiya. — Vyp. I. — M.: Novaya derevnya, 1928. — S. 15-36.
+
УДК 582.734.3:57.085.23
М.В. Фирсова, А.Ю. Набиева
M.V. Firsova, A.Yu. Nabiyeva
ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ INVITRO БОЯРЫШНИКА ПЕРСТОНАДРЕЗАННОГО (CRATAEGUSPINNATIFIDA BUNGE)
IN VITRO CULTURE PECULIARITIES OF CRATAEGUS PINNATIFIDA BUNGE
Широкое использование С. pinnatifida в озеленении ограничено вследствие трудностей при размножении традиционными способами. Целью нашего исследования явилось изучение морфогенетического потенциала изолированных почек C. pinnatifida и особенностей введения их в культуру in vitro. Решались следующие задачи: выявление оптимальных сроков введения материала, подбор стерилизующих агентов и питательной среды для активной пролиферации побегов; изучение морфогенетических реакций почек С. pinnatifida в культуре in vitro в зависимости от их положения на стебле и внесенных регуляторов роста. Взятие эксплантов осуществлялось в 2 срока: с февраля по апрель и с сентября по ноябрь. Выяснено, что более высоким морфогенетическим потенциалом обладали почки, введенные в культуру в марте-апреле. Для стерилизации почек использовались 3 различных вещества. Наилучший эффект обеспечивало применение 0,1%-ного раствора сулемы — до 85% жизнеспособных пазушных почек. Использовали 5 различных питательных сред — MS, WPM, Kn, Nas and Read и DKW с агаром и сахарозой. Наиболее активно процесс стеблевого морфогенеза проходил на среде Nas and Read при совместном применении БАП и кинети-на в концентрации 0,25-0,5 мг/л. Элонгация отдельных побегов достигалась добавлением в среду регенерации ГК3 в концентрации 0,5 мг/л. Большинство апикальных почек C. pinnatifida в культуре in vitro образовали цветущие побеги. При внесении в среду MS 0,5 мг/л ИУК, 0,2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л кинетина и 0,5 мг/л 6-БАП частота индукции морфогенного каллуса достигала 81, 0-86,0%. Для укоренения черенков мы использовали среду Кнудсона, либо S MS с добавлением ИМК. Таким образом, выявлены особенности клонального микроразмножения C. pinnatifida из пазушных почек и проанализировано влияние на процессы стеблевого морфогенеза абиотических и биотических факторов.
Ключевые слова: Crataegus pinnatifida, культура ткани, морфогенез, цитокинины.
The wide use of C. pinnatifida in landscaping is restricted because of the difficulties of its cloning by traditional methods. The goal of our investigation was the study of morphogenetic potential of C. pinnatifida isolated buds and the peculiarities of their tissue culture initiation. The following objectives were involved: to reveal the optimal time for buds initiation in tissue culture, to fit sterilization agent and the best culture medium for active shoot proliferation; to study buds morphogenetic reaction due to their position on the stem and growth regulators added. Explants were taken twice: from February to April and from September to November. It was found that buds isolated into tissue culture in March-April had the best morphogenetic potential. Three different agents were used for buds sterilization. The best effect of sterilization (85% viable buds) was obtained when 0.1% HgCl2 solution was used. Five different nutrient media were used: MS, WPM, Kn, DKW, Nas and Read with agar and sucrose. The highest axillary shoot multiplication was obtained on Nas and Read medium when 6-benzylaminopurine and kinetin in concentration of 0.25-0.5 mg L were added simultaneously. The elongation of isolated microshoots was obtained by the use of 0.5 mg L GA3 added to the regeneration medium. The majority of apical buds of C. pinnatifida gave microshoots with flowers in vitro. After adding to MS medium 0.5 mg L IAA, 0.2 mg L 2.4-D, 0.5 mg L kinetin and 0.5 mg L 6-benzylaminopurine, the frequency of morphogenic callus induction reached 81.0-86.0%. For rooting of the obtained microshoots we used Knudson medium or S MS medium with 0.5 mg L IBA added. The peculiarities of clonal micropropagation of C. pinnatifida using axillary bud explants were revealed and the role of biotic and abiotic factors influencing shoot morphogenesis was analyzed.
Keywords: Crataegus
morphogenesis, cytokinins.
pinnatifida, tissue culture,
X/"
Фирсова Мария Владимировна, м.н.с., лаб. дендрологии, Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск. Тел. 923-118-3857. E-mail: frsvmarry@ mail.ru.
Набиева Александра Юрьевна, с.н.с., лаб. биотехнологии, Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск. Тел. 913-717-9824. E-mail: [email protected].
Firsova Mariya Vladimirovna, Junior Staff Scientist, Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Rus. Acad. of Sci., Novosibirsk. Ph.: 923-118-3857. E-mail: frsvmarry@ mail.ru.
Nabiyeva Aleksandra Yuryevna, Senior Staff Scientist, Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Rus. Acad. of Sci., Novosibirsk. Ph.: 913-717-9824. E-mail: [email protected].
\/
Введение
Род Crataegus L. является одним из наиболее крупных по видовому и формовому разнообразию среди древесно-кустарниковых растений, насчитывающий, по некоторым данным, от 1000 до 1500 видов [1]. Большинство видов боярышника произрастает в умеренной зоне Евразии и Северной Америки [2]. На территории бывшего СССР произрастает 74 дикорастущих вида боярышников. Боярышники очень декоративны, долговечны, т.к. могут жить до 300 лет, устойчивы к промышленному загрязнению и механическим повреждениям. Они отличаются быстрым ростом и побегообразованием, засухо-и морозоустойчивы, не требовательны к плодородию почв. Многие виды боярышников — ценные лекарственные, пищевые и медоносные растения. Боярышник широко распространен и возделывается как плодовая культура во многих странах мира: Испании, Алжире, Италии и др. В Китае она является третьей по значению семечковой культурой после яблони и груши, с этой целью выращивают Crataegus pinnatifida var. major N.E.Br [2]. В медицине используют плоды, цветы и листья боярышника. Для всех видов боярышников характерно наличие эпикатехина — одного из наиболее физиологически активных катехинов, обладающих капилляроукрепляющей активностью. Плоды богаты пектиновыми веществами, сорбитом (от 2 до 25% на сухой вес плодов). В них накапливается до 3,5 мг% каротина, 80 мг% витамина С, большое количество биофлавоноидов, тритерпеновых кислот и гликозидов.
С. pinnatifida произрастает в Приморье и на юге Приамурья, а также в Северном и Северо-Восточном Китае, Корее и Японии. Это один из наиболее декоративных и устойчивых видов среди боярышников, характеризующийся плотной кроной, ярко-зелеными лоснящимися листьями и блестящими красными плодами, он не поражается сажистым грибком и бурой пятнистостью. В России данный вид встречается в качестве декоративного растения в культуре, но в ограниченном числе экземпляров. Вегетативное размножение боярышников зелеными черенками для большинства видов малоэффективно, нет данных о положительном опыте размножения С. pinnatifida прививкой [3]. Широкое использование боярышника в зеленом строительстве ограничено практическим отсутствием посадочного материала. Для повышения коэффициента размножения используют методы культуры ткани. Работ по микроразмножению боярышников относительно немного, особенно мало их касается размножения взрослых особей. Введение в культуру
in vitro одноузловых черенков, взятых с 15летних деревьев в период неактивного роста, позволило разработать способ успешного микроразмножения C. aronia L. [4]. Был разработан способ получения каллусных культур из вегетативных, генеративных почек и семядолей боярышника Поярковой [5]. Определено, что для индукции морфогенеза в длительно культивируемом каллусе наиболее оптимальной является среда МС, дополненная 1,0 мг/л 2,4-Д и БАП, в концентрации 0,1 мг/л [6]. Показано, что длительно пассируемая каллусная культура сохраняет высокий морфогенетический потенциал и может быть использована в качестве резерва для микроразмножения этого вида. Способность к регенерации побегов выявлена у 33% экс-плантов семядолей и листьев C. pinnatifida, при этом укоренилось не более 50% побегов
[7].
Целью исследования явилось изучение морфогенетического потенциала изолированных почек C. pinnatifida и особенностей введения их в культуру in vitro.
Материалы и методы
Материалом для проведения исследований являлись вегетативные и вегетативногенеративные почки C. pinnatifida. Отбор растительного материала осуществляли с февраля по апрель и с сентября по ноябрь. В качестве первичных эксплантов использовали апикальные и пазушные почки с однолетних побегов растений, возраст которых насчитывал более 15 лет. Экспланты помещали в 70%-ный C2H5OH (1 мин.), после чего переносили на 10 мин. в один из следующих растворов: а) 1% сульфохлорантина; б) 0,1% AgNO3; в) 0,1% сулемы. В качестве питательных сред использовали минеральную основу сред MS, WPM, Kn, Nas and Read и DKW в сочетании с агаром и сахарозой [8-11]. На каждый вариант питательной среды было высажено по 30 эксплантов в трехкратной повторности.
В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли цитокинины: кинетин (кин) — 0,5-1,0 мг/л; 6-бензиламинопурин (6-БАП) — 0,1-1,0 мг/л, ауксины-3-индо-
лилуксусную кислоту (ИУК), либо индолил-масляную кислоту (ИМК) в концентрации 0,1-
1,0 мг/л. Условия культивирования: 24±1°С, 16-часовой фотопериод и интенсивность освещения 2000-3000 лк. Субкультивирование осуществляли каждые 6 недель.
На стадии пролиферации побегов использовали минеральную основу питательной среды MS в сочетании с агаром и сахарозой. Контролем являлась питательная среда MS без добавления регуляторов роста. Для уко-
ренения микропобегов использовали ИМК в концентрации 0,3-0,5 мг/л, внесенную в среды Кнудсена или S MS с уменьшенным в 2 раза содержанием макросолей. Частоту каллусообразования оценивали по количеству эксплантов, образовавших каллус, от их общего числа.
Результаты и обсуждение
Наилучший стерилизующий эффект обеспечивало применение 0,1%-ного раствора сулемы (75-85% жизнеспособных стерильных эксплантов), тогда как стерилизация сульфо-хлорантином и AgNO3 обеспечивала только 32 и 25% соответственно. Более высоким морфогенетическим потенциалом обладали экспланты, введенные в культуру в марте-апреле, чем в сентябре-октябре.
Морфогенетически почки отличались в зависимости от положения на стебле: с удлиненных побегов выделяли самые крупные почки — терминальную и две пазушные, являющиеся вегетативно-генеративными, в то время как с укороченных побегов взяты вегетативные почки. Использование пазушных почек с небольшим участком стебля способствовало более быстрой индукции и развитию микропобегов.
У большинства апикальных почек в культуре in vitro мы наблюдали появление цветков одновременно с развитием побегов (рис. 1).
Рис. 1. Появление цветков на побеге из апикальной почки C. pinnatifida
В зависимости от этапа микроклонального размножения боярышника перистонадрезан-ного к питательным средам добавляли 6-БАП в концентрациях 0,2-1,5 мг/л. На этапе введения в культуру in vitro мы использовали низкую концентрацию цитокинина БАП — 0,20,3 мг/л. На 7-10-е сут. культивирования у 60-75% эксплантов происходила активизация развития микропобегов. Активные процессы морфогенеза наблюдали на среде Nas and Read, MS в нашей модификации — MSm, на модифицированной нами среде Kn-Knm, а также на среде WPM. На среде DKW про-
лиферация побегов из почек отмечена у единичных эксплантов (табл.).
Таблица
Регенерация микропобегов из латеральных почек С ртпаНЛЯа в зависимости от состава питательных сред
Вари- анты сред Минеральная основа Регуляторы роста, мг/л Частота регенерации, %
1 MSm 0,3 БАП + 0,5 Кин 75
2 MSm 0,5 БАП 50
3 N and R 0,3 БАП + 0,5 Кин 86
4 N and R 0,5 БАП 60
5 WPM 0,3 БАП + 0,5 Кин 63
6 Knm 0,5 БАП + 1 Кин 44
7 DKW 0,3 БАП + 0,5 Кин 17
В таблице представлены результаты эксперимента по инициации развития в условиях in vitro пазушных почек C. pinnatifida, отобранных в апреле. Наиболее подходящей для индукции развития латеральных почек C. pinnatifida нами отмечена среда Nas and Read, что согласуется с данными других исследователей [6]. Для регенерации микропобегов нами показано стимулирующее влияние совместного применения БАП и кинетина в концентрации 0,25-0,5 мг/л.
Для индукции пролиферации максимального числа побегов пазушные почки культивировали с добавлением БАП в концентрациях
0,5-2 мг/л (рис. 2). Также для увеличения коэффициента размножения в первых пассажах конгломераты почек и побегов C. pinnatifida не разделяли на отдельные единицы, а переносили на свежую питательную среду целиком.
Рис. 2. Образование конгломерата побегов из пазушной почки С рппаНЛЪа под действием 0,75 мг/л 6-БАП (2-й пассаж)
Элонгация отдельных побегов достигалась добавлением в среду регенерации ГК3 в концентрации 0,5 мг/л (рис. 3).
При культивировании в темноте пазушных почек C. pinnatifida на модифицированной питательной среде МS, дополненной 2,0 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л кинетина и 0,5 мг/л 6-БАП,
была отмечена максимальная частота каллу-сообразования (94,0-95,0%), но образовавшийся каллус был неморфогенный, рыхлый, состоящий из паренхимоподобных клеток. В то время как при культивировании эксплантов на свету на питательной среде MS, содержащей 0,5 мг/л ИУК, 0,2 мг/л 2,4-Д,
0,5 мг/л кинетина и 0,5 мг/л 6^A^ образовывался зеленый, плотный, морфогенный каллус, а частота индукции каллусообразова-ния составила 81,0-86,0%. На других модификациях питательных сред частота каллусо-образования не превышала 61%.
Рис. 3. Элонгация побега C. pinnatifida под действием 0,5 мг/л ГКЗ (4-й пассаж)
б
Рис. 4. Образование каллуса: а — плотный, морфогенный; б — неморфогенный рыхлый, образовавшийся в темноте
Изучение цитоморфометрических параметров каллусных клеток боярышника пери-стонадрезанного показало, что каллусная ткань различается как по цвету, форме, кон-
систенции, так и по типу клеток — меристемоподобных и паренхимоподобных (рис. 4 а, б).
Присутствие в плотном, морфогенном каллусе боярышника перистонадрезанного крупных локальных скоплений клеток мери-стематического типа делает их удачным объектом для возможной индукции органогенеза или соматического эмбриогенеза. Именно эти клетки, сохраняющие способность к пролиферации, обычно являются центрами индукции морфогенеза (рис. 5).
Рис. 5. Скопление делящихся клеток в морфогенном каллусе C. pinnatifida, образовавшемся на свету
Для укоренения черенков мы использовали среду Кнудсона, либо S MS с добавлением ИМК в концентрациях 0,3 0,5 мг/л (одноступенчатый метод). Двухступенчатый метод укоренения микрочеренков состоял в помещении на 2-3 дня на те же среды с добавлением 3 мг/л ИМК, в дальнейшем микрочеренки переносились на среды, содержащие ИМК в концентрациях 0,3-0,5 мг/л. Ризоге-нез у растений, полученных в культуре пазушных почек, выделенных от взрослых экземпляров C. Pinnatifida, не отмечен, что, очевидно, говорит о незаконченности процесса реювенилизации микропобегов.
Выводы
Разработаны биотехнологические приемы клонального микроразмножения C. pinnatifida, основанные на регенерации растений из пазушных вегетативных почек побегов. В результате исследований установлено влияние на процессы морфогенеза абиотических и биотических факторов, таких как сроки введения первичных эксплантов в культуру in vitro, составы питательных сред, концентрации регуляторов роста в среде. Наиболее подходящей для индукции развития пазушных почек C. pinnatifida нами отмечена среда Nas and Read. Результаты экспериментов показали, что на регенерацию побегов C. pinna-tifida in vitro наибольшее влияние оказывает режим стерилизации, сроки отбора почек, их положение на стебле и содержание цитоки-нинов в питательной среде.
Библиографический список
1. Борисова Е.А. Род боярышник (Crataegus L., Rosaceae) в городе Иванове // Вестник Ивановского государственного университета Сер. «Биология. Химия. Физика. Математика». — 2004. — Вып. 3. — C. 18-24.
2. Бобореко Е.З. Боярышник Нетрадиционные садовые культуры / Е.П. Куминов. — Мичуринск, 1994. — С. 65-75.
3. Вафин Р.В., Путенихин В.П. Боярышники: интродукция и биологические особенности. — М.: Наука, 2003. — 224 с.
4. Nas M.N., Gokbunar L., Sevgin N., Aydemir M., Dagli M., Susluoglu Z. Micropropagation of mature Crataegus aronia L., a medicinal and ornamental plant with rootstock potential for pome fruit // Plant Growth Regul. 2012. — V. 67. — P. 57-63.
5. Попкова Л.Л., Теплицкая Л.М. Процессы морфогенеза в длительно культивируемых каллусах боярышника Поярковой (Crataegus pojarkovae Kossych) // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия».
— Т. 22 (61). — 2009. — № 4. — С. 135-144.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. plant. — 1962. — Vol. 15. — № 3. — P. 473-497.
7. Dai H., Zhang Z., Guo X. Adventitious bud regeneration from leaf and cotyledon explants of Chinese hawthorn (Crataegus pinnatifida Bunge. var. major N.E.Br.). In Vitro Cell Dev Biol Plant. — 2007. — V. 43. — P. 2-8.
8. Lloyd G. and B.H. McCown. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture /Int. Plant Prop. Soc., Comb. Proc. — 1980. — V. 30. — P. 421-427.
9. Knudson L. A new nutrient solution for the germination of orchid seed / L. Knudson // American Orchid Society Bulletin. — 1946. — V.14. — P. 214-217.
10. Nas M.N. and P.E. Read. A hypothesis for the development of a defined tissue culture medium of higher plants and micropropagation of hazelnuts //Sci. Hortic. — 2006. — V.101. — P. 189-200.
11. Driver J.A., Kuniyuki A.H. In vitro propagation of Paradox walnut Juglans hindsii * Juglans regia rootstock // HortScience. — 1984. — Vol. 19. — P. 507-509.
References
1. Borisova E.A. Rod boyaryshnik (Crataegus L., Rosaceae) v gorode Ivanove // Vest-nik Ivanovskogo gosudarstvennogo universiteta. Ser. «Biologiya. Khimiya. Fizika. Matematika». -2004. - Vyp. 3. - C. 18-24.
2. Boboreko E.Z. Boyaryshnik. Netraditsion-nye sadovye kul'tury / Sost. E.P. Kuminov. — Michurinsk, 1994. - S. 65-75.
3. Vafin R.V., Putenikhin V.P. Boyaryshniki: Introduktsiya i biologicheskie osobennosti. - M.: Nauka, 2003.- 224 s.
4. Nas M.N., Gokbunar L., Sevgin N., Aydemir M., Dagli M., Susluoglu Z. Micropropagation of mature Crataegus aronia L., a medicinal and ornamental plant with rootstock potential for pome fruit // Plant Growth Regul. -2012. - V. 67. - P. 57-63.
5. Popkova L.L, Teplitskaya L.M. Protsessy morfogeneza v dlitel'no kul'tiviruemykh kallusakh boyaryshnika Poyarkovoi (Crataegus pojarkovae Kossych) // Uchenye zapiski Tavricheskogo natsional'nogo universiteta im. V.I. Vernadsko-go. - Seriya «Biologiya, khimiya». - Tom 22 (61). - 2009. - № 4. - S. 135-144.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. plant. - 1962. - Vol. 15. No. 3. - P. 473-497.
7. Dai H., Zhang Z., Guo X. Adventitious bud regeneration from leaf and cotyledon explants of Chinese hawthorn (Crataegus pinnatifida Bunge. var. major N.E.Br.) // In Vitro Cell & Dev. Biol. - 2007. - V. 43. - P. 2-8.
8. Lloyd G. and B.H. McCown. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture / Int. Plant Prop. Soc., Comb. Proc. - 1980. -V. 30. - P. 421-427.
9. Knudson L. A new nutrient solution for the germination of orchid seed // American Orchid Society Bulletin. - 1946. - V.14. -P. 214-217.
10. Nas M.N. and P.E. Read. A hypothesis for the development of a defined tissue culture medium of higher plants and micropropagation of hazelnuts // Sci. Hortic. - 2006. - V. 101. -P. 189-200.
11. Driver J.A., Kuniyuki A.H. In vitro propagation of Paradox walnut Juglans hindsii * Juglans regia rootstock // Hort. Science. - 1984. -Vol. 19. - P. 507-509.
+ + +
