CC BY
355
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 3, с. 49-58
УДК 633.72+634.3+635.9]:576.7.086.83:58
MИKPOPAЗMHOЖEHИE in vitro CУБTPOПИЧECKИX, ДEKOPATИBHЫX КУЛЬТУР И ЭHДEMИKOB ЗАПАДНОГО КАВКАЗА: OPИГИHAЛЬHЫE И OПTИMИЗИPOBAHHЫE ПРОТОКОЛЫ
T.M. KOЛOMИEЦ, В.И. MAHßPOBCKAß, M.B. ГBACAЛИЯ, Л.C. CAMAPHHA, Р.Н. COKOЛOB
Получение качественного посадочного материала в цветоводстве и садоводстве связывают с необходимостью применять высокие технологии оздоровления и тестирования. Как известно, методы микроразмножения также широко используются селекционерами для ускоренной репродукции ценного материала и служат важным способом поддержания существующего биоразнообразия в случае с видами, занесенными в Красные книги. Однако для ряда цветочно-декоративных, и особенно субтропических плодовых культур, редких исчезающих видов растений дикой флоры еще не описаны надежные приемы получения и размножения растений-регене-рантов in vitro. В настоящей работе представлены результаты разработки и усовершенствования методов микроклонального размножения чая Camellia sinensis (L.) Kuntze, лимона Citrus limon (L.) Burm, камелии японской Camellia japónica L. и Lilium caucasicum Misez. ex Grossh. (исчезающий эндемичный вид Западного Кавказа). Для вышеперечисленных субтропических и декоративных растений выявлены особенности получения стерильной культуры и сезонные сроки (май-октябрь) их введения в культуру in vitro. Оптимизированы питательные среды и условия культивирования для микроклонального размножения изучаемых культур. Так, для чая культивирование эксплан-тов на питательной среде WPM (Woody Plant Media), дополненной фиторегуляторами 6-бензиламинопурином (б-БАП, 3,0 мг/л) и аденином (0,9 мг/л), способствовало индукции многочисленных адвентивных микропобегов. Активный рост микропобегов для камелии японской был отмечен также на питательной среде WPM с фиторегуляторами б-БАП и индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) в концентрации соответственно 2 мг/л и 0,5 мг/л. Для сортов лимона надежным способом размножения оказалась микропрививка. Выявлено, что после 3-го цикла микропрививки коэффициент размножения микрочеренков в 2 раза превышал аналогичный показатель для микропобегов из пазушных почек растений-доноров и составил 4,б шт/побег. У L. caucasicum использование различных частей луковичных чешуй показало, что эффективность индукции морфогенеза in vitro зависела от того, какая часть использовалась в качестве экспланта. Через 48 сут в стерильных условиях из базальной и медиальной частей чешуй развивались преимущественно адвентивные побеги, реже происходил каллусо- и ризогенез, в то время как в культуре апикальных частей преобладал каллусогенез. В доступной литературе мы не нашли данных о возможности получения культуры тканей у L. caucasicum. Таким образом, нами впервые разработан протокол для размножения in vitro этого исчезающего эндемика Западного Кавказа.
Ключевые слова: ступенчатая стерилизация, клональное микроразмножение, микропобеги, микропрививка, чай Camellia sinensis (L.) Kuntze, лимон Citrus limon (L.) Burm, Camellia japónica L., Lilium caucasicum Misez. ex Grossh.
В современном цветоводстве и садоводстве прослеживается четкая тенденция повышения требований к качеству посадочного материала и его сортименту, что связано с необходимостью использовать высокие технологии оздоровления и тестирования. Кроме того, сокращение сроков получения генотипов с хозяйственно ценными свойствами, ускорение их внедрения в производство, создание и содержание коллекций ценных форм также приоритетны для сельскохозяйственной науки (1).
Решению этих проблем может способствовать применение биотехнологических приемов, с помощью которых становится возможным в широких масштабах получать посадочный материал, свободный от вирусных, грибных и бактериальных болезней, вегетативное потомство у растений, которые трудно размножить в обычных условиях, быстро «тиражировать» ценные клоны сортов и гибридов, длительно хранить растительный материал в контролируемых лабораторных условиях (без контакта с экологическими факторами), осуществлять его международный обмен без риска занести карантинных вредителей, получать формы с измененной плоидно-
стью, сомаклональные варианты и трансгенные растения, поддерживать существующее биоразнообразие редких и исчезающих видов, занесенных в Красные книги (2, 3).
К таким эффективным биотехнологическим приемам получения, оздоровления, ускоренной репродукции сортов и гибридов цветочно-декоративных и плодовых растений относится микроразмножение. Однако для многих из них, в частности для субтропических плодовых культур, редких исчезающих видов дикой флоры пока что не предложены методы надежного получения и размножения растений-регенерантов in vitro из изолированных тканей и органов (4, 5).
В СССР работы по использованию клонального микроразмножения для оздоровления растений чая как одной из важнейших субтропических культур были начаты еще в 1980-х годах (6). Подобный подход становится все более актуальным в связи с сокращением сельскохозяйственных площадей, кроме того, впервые появляется возможность для сохранения уникальных генотипов чая в депонированной коллекции в условиях лаборатории. Следует отметить, что в отношении древесных видов сохраняется проблема культивирования in vitro в стерильных условиях. Например, у растений чая основное препятствие в получении асептической культуры — большое количество фенольных соединений (7, 8), содержащихся в молодых побегах, которые используются как экспланты. Еще одна проблема при клональном микроразмножении чая — получение активно растущей стерильной культуры (9).
Среди субтропических культур важное место занимают цитрусовые (10). В нашей стране первые работы по культивированию цитрусовых in vitro проводились также в 1980-х годах (11-13). Несмотря на то, что за рубежом работы по оптимизации протоколов культивирования цитрусовых in vitro многочисленны, до сих пор так и не удалось разработать эффективную методику микроразмножения сортового материала в культуре вегетативных почек (14-16).
Применение биотехнологических методов в отношении декоративных кустарников часто обусловлено тем, что они плохо размножаются вегетативно вследствие очень низкого процента укоренения черенков. В частности, подобное относится к высокодекоративным (имеющим махровые цветки) сортам камелии Ñamellia japonica L., произрастающим в условиях субтропиков России (17). На территории Большого Сочи одна из самых представительных коллекций высокодекоративных сортов камелии японской произрастает в Субтропическом ботаническом саду Кубани (г. Сочи), основой которой стали растения, привезенные из различных ботанических садов России и из-за рубежа (18).
Все шире применяются биотехнологии для сохранения флористического биоразнообразия, в частности для поддержания растений, численность популяций которых резко падает, а также уникальных слабоизучен-ных форм, способных в будущем расширить и улучшить сортимент возделываемых культур. Созданием коллекций in vitro исчезающих и редких видов занимаются в Индии (19), США (20), Великобритании (21-24), Австралии (25) и в ряде других стран. С 2003 года во Всероссийском НИИ цветоводства и субтропических культур разрабатываются приемы для клонального микроразмножения некоторых уникальных для мировой флоры видов — местных эндемиков Ñampanula longistyla Fomin., C. alliari-folia Willd., C. latifolia L., C. taurica Juz., C. bzybica (26), Crocus speciosus Bieb. (27). К одному из видов таких редких эндемиков Западного Кавказа, требующих сохранения, относится Lilium caucasicum Misez. ex Grossh.
(Liliaceae) (27).
Цель пpoвoдимыx нами иccлeдoвaний — paзpaбoткa и coвepшeнcт-вoвaниe мeтoдoв клoнaльнoгo микpopaзмнoжeния и регенерации cyбтpo-пических культур, детаративных растений и редких исчезающих представителей месттой дитай флopы для ycкopeния селекции, пpoизвoдcтвa oз-дopoвлeннoгo пocaдoчнoгo материала и гахранения биopaзнooбpaзия.
Методика. Объектами иccлeдoвaния были растения чая Camelia sinensis (L.) Kuntze гарта ^лхида и месттой пoпyляции, Citrus limon (L.) Burm copтoв Hoвoaфoнcкий, Ударник, Бесталючий, Camelia japonica (L.) copтoв Reine des Beautes, David Bosehi и Due de Bretagne, a также эндемичный вид флopы Западтош Кавказа Lilium caucasicum Misez. ex Grossh.
Эсплантами для введения в культуру in vitro у Camelia sinensis служили апикальные и пазушные точки, oтoбpaнныe на мoлoдыx активто растущих тобегах текущею гoдa в пертод с апреля пo orn^p^ На этапе пpoлифepaции мopфoгeнныx структур чая были испытаны три варианта минеральных питательных сред — Mypacигe-Cкyгa (MS) (2S), Гaмбopгa В5 (29) и WPM (Woody Plant Medium) (30). Mикpopaзмнoжeниe C. sinensis (пpoвoдили адвентивными тобегами и частью тобега с пaзyшнoй пoчкoй на питательтой среде WPM, дoпoлнeннoй б-бeнзилaминoпypинoм ^^A^ 3 мг/л) и aдeнинoм (0,9 мг/л).
Для толучения cтepильнoй культуры Camelia japonica из апикальных и пазушных точек, также oтoбpaнныx на мoлoдыx aктивнo растущих тобегах тeкyщeгo гoдa в пepиoд с апреля то oктябpь, былo испытато шесть вapиaнтoв oбpaбoтки экcплaнтoв. Варианты различались то нaбopy и танцентрации стерилизующих aгeнтoв, а также времени их вoздeйcтвия: 1-й — 70 % этатол (1 мин), 20 % xлopнaя известь (5 мин), 15 % TOpo^^; вoдopoдa (5 мин); 2-й — 70 % этатол (1 мин), 20 % xлopнaя известь (5 мин), 8,5 % пepoкcид вoдopoдa (3 мин); 3-й — 0,5 % нoвoдeз этам-50м (действующие агенты — 25 % xлopид aлкилдимeтилбeнзилaммoния и товерхтост-нo-aктивнoe вeщecтвo; пpoизвoдитeль OAO НПО «Hoвoдeз», г. Mocквa) (30 мин); 4-й — 0,2 % то^дез (20 мин); 5-й — K2MnO4 (30 мин) + 70 % этaнoл (1 мин) + 0,2 %-й нoвoдeз (20 мин) + 5 % пepoкcид вoдopoдa (1 мин); б-й — K2MnO4 (40 мин) + 9б % этатол (1 мин). ^сле кaждoгo cтepилизyющeгo pacтвopa oбpaзцы трижды пpoмывaли диcтиллиpoвaннoй вoдoй в течение 10 мин. На этапе введения в культуру in vitro экспланты C. japonica кyльтивиpoвли на питательтой среде WPM e фитoгopмoнaми б-БAП (2,0 мг/л) и a-нaфтилyкcycнoй киcлoтoй (НУК, 0,5 мг/л). Через 22,5 мес микpoпoбeги пересаживали на питательную среду co следующим гадержанием фитoгopмoнoв: б-БAП — 2,5 мг/л, НУК — 0,5 мг/л и гиббе-peллoвaя киcлoтa (ГК3) — 1,0 мг/л.
^лучение микpoпpивитыx растений Citrus limon включaлo три этапа: выращивание пpивoeв из пазушных точек, выращивание пoдвoeв из сеянцев лимoнa Meйepa (Citrus х meyeri Meyer) и coбcтвeннo прививка меристем, толученных oт введеных в стерильную культуру пазушных точек. Пазушные точки цитpycoвыx cтepилизoвaли в течение 25 мин 0,3 % велто-летом (ООО «НПО «ВЕЛТ», Poccra); действующее вeщecтвo — клатрат четвертичтога aммoниeвoгo coeдинeния (дидeцилдимeтилaммoний) с кар-бамвдрм. Для пoлyчeния пpивoя при кyльтивиpoвaнии пазушных пoчeк C. limon иcпoльзoвaли питательную среду MS с дoбaвлeниeм б-БAП (0,1 мг/л) и НУК (0,5 мг/л). Kyльтивиpoвaниe пoдвoeв и микpoпpивытыx растений ocyщecтвляли на питательтой среде WPM, дoпoлнeннoй БAП (1 мг/л) и ГК3 (2 мг/л). Mикpoпpививки лимoнa пpoвoдили на пoдвoй лимoнa Me^ ера (Citrus х meyeri Meyer) пo мeтoдикe L. Navarro (31) e мoдификaциями
(4). У микропривитых растений динамику приживаемости тканей контролировали микроскопированием («ЛОМО», Россия).
В качестве эксплантов Lilium caucasicum использовали различные части чешуй луковиц, которые стерилизовали в 96 % этаноле 1 мин и далее в 2 % велтолене 10 мин. В качестве первичных питательных сред использовали прописи MS и MS с половинным количеством минеральных солей (1/2MS) и различными сочетаниями фитогормонов НУК, 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) (в концентрациях 1,0-2,0 мг/л) и 6-БАП (3 мг/л).
При подготовке питательных сред рН доводили до 5,7, после чего их автоклавировали в течение 20 мин при температуре 120 °С. Первичные экспланты и микропобеги культивировали при интенсивности освещенности до 5000 лк, 16-часовом фотопериоде и температуре 24±1 °С.
Полученные данные обрабатывали по Б.А. Доспехову (32) с использованием программного обеспечения MS Office Excel.
Результаты. Основным этапом введения эксплантов в культуру in vitro была отработка режимов стерилизации растительных объектов. Для растений чая сорта Колхида и местной популяции из девяти протестированных вариантов эффективной оказалась ступенчатая стерилизация (последовательная обработка 20 % гипохлоритом натрия, 70 % этиловым спиртом и 0,2 % раствором диацида в течение соответственно 20, 30 и 25 мин).
Применение питательной среды MS (6) с добавлением 6-БАП (2,0 мг/л) и тетрациклина (1000 мг/л) оказалось наиболее эффективным для введения эксплантов чая в культуру in vitro. При культивировании растительных тканей на питательной среде Гамборга В5 с гибберелловой кислотой (ГК3 — 2,0 мг/л) происходило образование верифицированных (сверховодненных) микропобегов.
Пассирование эксплантов на среде WPM с концентрацией цитоки-нинов 6-БАП 3,0 мг/л и аденина 0,9 мг/л способствовало активной индукции микропобегов растений чая, высота которых достигала в среднем 25,7 мм (табл. 1, рис. 1).
1. Влияние питательных сред и фитогормонов на рост и развитие Camelia sinensis (L.) в культуре in vitro
Питательная среда
Регулятор роста (концентрация)
Формирование микропобегов
число, шт. I высота, мм
Продолжительность культивирования, мес
MS 6-БАП (2,0 мг/л)
Зеатин (0,5 мгА) 22 23,8±0,3 1,5-2
Аденин (0,5 мг/л) НУК (0,5 мг/л) Среда Гамборга (Г5) 6-БАП (2,5 мг/л)
ГК3 (2,0 мг/л) 5 18,4±0,2 2-2,5
НУК (0,5 мг/л)
WPM А-™3^1^ 32 25,7±0,4 1 _Аденин (0,9 мг/л)
Примечание. MS — среда Мурасиге-Скуга, WPM — Woody Plant Medium (см. раздел «Методика»), 6-БАП — 6-бензиламинопурин, НУК — а-нафтилуксусная кислота, ГК3 — гибберелловая кислота.
2. Влияние фитогормонов на рост и укоренение микрорастений чая Camelia sinensis (L.) в культуре in vitro
Среда (фитогормон)
Формирование микрорастений
число, шт.
высота, мм
Частота %
контаминации | ризогенеза
MS (ИМК 1,0 мг/л) 60 10,0±0,5 3,3 0
1/2MS (ИМК 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л) 60 60,0±0,9 6,7 0
У^ (ИМК 1,0 мг/л, НУК 2,0 мг/л) 60 20,5±0,8 3,3 81,0
Примечание. MS и 1/2MS — среда Мурасиге-Скуга соответственно с полным и половинным набором минеральных солей, ИМК, ИУК и НУК — соответственно индолил-3-масляная, индолил-3-уксусная и а-нафтилуксусная кислота.
Коэффициент размножения с 3-го пассажа возрастал. В среднем он составил 1:4.
vitro на питательной среде WPM (Woody Plant Medium) с 6-бензиламинопурином (6-БАП,
3,0 мг/л) и аденином (0,9 мг/л) (слева — сорт Колхида, справа — местная популяция).
Оптимальной для укоренения размноженных микрорастений чая (независимо от сортовыж особенностей) была питательная среда V2MS (с половинным набором минеральных солей), дополненная фиторегулятора-ми индолил-3-масляной кислотой (ИМК, 1,0 мг/л) и а-нафтилуксусной кислотой (НУК, 2,0 мг/л) (табл. 2, рис. 2).
Рис. 2. Ризогенез у микрорастений чая Camelia sinensis (L.) in vitro на полной питательной среде Мурасиге-Скуга (MS) с добавлением индолил-3-масляной (1,0 мг/л) и а-нафтилуксусной кислоты (2,0 мг/л) (слева — сорт Колхида, справа — местная популяция).
На этой питательной среде через 2,5 мес растения-регенеранты достигли в среднем высоты 20,5±0,8 мм, при этом бышо получено до 81,0 % укорененныгх микрорастений чая. Наличие в питательной среде повышенной концентрации ауксинов (ИМК 1,0 мг/л и НУК 2,0 мг/л) способствовало развитию мощной корневой системы. От базального каллуса отрастали 2-3 основныгх корня длиной 2,5-3,0 см, от которыгх отходили боковые проводящие корни длиной 1,5-2,0 см с множеством корневыж волосков. Весь процесс микроразмножения (от высадки первичного экспланта на питательную среду до укоренения микрорастений) занимал 6 мес.
Известно, что культивирование in vitro вегетативных органов дре-весныж плодовых культур сопряжено с рядом проблем, таких как сложность получения стерильной культуры, низкие коэффициенты размноже-
ния и укоренения, низкая жизнеспособность микропобегов (33-36). Повышение эффективности размножения и надежности сохранения in vitro сортов коллекции цитрусовыгх возможно за счет оптимизации состава пи-тательныгх сред и использования техники микропрививки. Исследования по оптимизации протоколов микроразмножения и сохранения генетических ресурсов цитрусовых культур выполняются в институте с 2009 года.
При анатомическом контроле приживаемости тканей у микропривитых растений исследования показали, что через 10-20 сут между микропривоем и подвоем образовывалась общая сосудистая система и меристемы трогались в рост (рис. 3). У таких сортов, как Ударник, Бесколючий, Новоафонский, Мейер, приживаемость меристем составила соответственно 65,8; 73,3; 75,2 и 81,6 %. По результатам дисперсионного анализа, доля влияния сорта на приживаемость полученных от него меристем составила лишь 4,8 %, в то время как на влияние источника привоя приходилось 92,4 %; представленные данные достоверны (Рфакт. > F05).
А Б В
Рис 3. Приживаемость микропривоя (отмечены стрелками) при микропрививке лимона Citrus limon (L.) Burm сорта Новоафонский на лимон Мейера ( Citrus х meyeri Meyer) in vitro: А, Б —
образование общей проводящей системы (через 10 сут), В — начало роста (через 20 сут). Увеличение х400 (Б).
В целом микропобеги привоя характеризовались более быстрым ростом, чем побеги, полученные из почек взрослых растений. После 3-го цикла микропрививки коэффициент размножения микрочеренков в 2 раза превышал аналогичный показатель для микропобегов из пазушных почек растений-доноров и составил 4,6 шт/побег (рис. 4). При этом коэффициент размножения микропобегов из почек взрослых растений после 3-го пассажа существенно не повышался. Таким образом, при перепрививках активируются ростовые процессы благодаря фи-
Рис. 4. Коэффициент размножения микропобегов лимона Citrus limon (L.) Burm in vitro в зависимости от их источника и цикла субкультивирования: а — побеги из почек, б — микропривитые побеги, в — сеянцы.
экологическому омоложению. Следовательно, подобный характер морфогенеза открывает большие возможности для массового размножения и оздоровления генотипов лимона.
При отработке этапов клонального микроразмножения высокодекоративных сортов C. japónica одной из наиболее сложных задач (как и для многих других древесных растений) было получение стерильной культуры. Из шести испытанных протоколов лучшие результаты давало последовательное применение К2МПО4 (насыщенный раствор), 70 % этанола, 0,2 % новодеза и 5 % пероксида водорода в течение соответственно 30, 1, 20 и 1 мин (37). В этом случае на начальном этапе доля стерильных экс-плантов составила 40-42 %, то есть оказалась на 10-15 % выше, чем в других вариантах. Кроме того, при первичном культивировании отмечали положительное действие тетрациклина в концентрации 500-1000 мг/л, добавление которого в питательную среду WPM обеспечивало более высокий (от 29,9 до 45,4 %) выход сохранившихся в культуре in vitro стерильных эксплантов (38). Для пазушных и апикальных меристем C. japónica оптимальным сроком введения в культуру in vitro был конец марта—середина мая, для побегов с пазушными и апикальными почками — конец мая— начало сентября.
При культивировании C. japónica на WPM с высокой концентрацией 6-БАП (2,5-3,0 мг/л) в основании микрочеренков и микропобегов формировался компактный светло-зеленый каллус. Помещая его фрагменты на питательную среду с пониженным содержанием 6-БАП (2 мг/л) и ИУК (0,5 мг/л), через 30 сут наблюдали появление морфогенных зон в каллусной ткани. На такой же питательной среде культивировали микропобеги камелии. Их активный рост происходил у 54,5 % эксплантов. Необходимо отметить, что в культуре ткани C. japónica адвентивные побеги, как, например, у C. sinensis, не развивались. Как следствие, клональное микроразмножение было возможно только за счет увеличения числа междоузлий. У C. japónica коэффициент размножения составил 1:3.
При культивировании in vitro различных частей чешуй луковицы у эндемика L. caucasicum показали, что индукция морфогенеза была неодинакова: через 48 сут в стерильных условиях из базальной и медиальной частей развивались преимущественно адвентивные побеги, реже происходил каллусо- и ризогенез, тогда как в апикальных частях преобладал каллусогенез (табл. 3).
3. Развитие эксплантов Lilium caucasicum Misez. ex Grossh. из разных частей чешуй луковицы на полной среде MS с добавлением НУК (1 мг/л) и 6-БАП (3 мг/л) через 48 сут после введения в культуру in vitro
Число эксплантов, шт. (Х+х)
часть чешуи всего с ризогенезом с индукциеи ад- с каллусогенезом без развития
вентивных почек
Базальная 45 13,0+1,07 20,0+0,53 12,0+0,92 0
Медиальная 45 13,0+1,92 15,0+1,60 9,0+0,92 8,0+1,07
Апикальная 45 2,0+0,53 3,0+0,92 7,0+1,07 33,0+0,92
Примечание. MS — среда Мурасиге-Скуга, НУК — а-нафтилуксусная кислота, 6-БАП — 6-бен-
зиламинопурин.
Медиальные части чешуй формировали корни с той же частотой, что и базальные, тогда как развитие по интересующему нас типу (с образованием адвентивныгх почек и каллусов) отмечалось значительно реже (рис. 5). Реакция апикальных частей на индукцию была менее выраженной, причем изменения эксплантов происходили в их базальной части и проявлялись преимущественно дедифференцировкой клеток и развитием
каллусной ткани. Впоследствии при переносе каллусов на среду МБ с ауксином 2,4-Д (2 мг/л) наблюдали формирование морфогенных зон и развитие микролуковичек в очагах интенсивного органогенеза (см. рис. 5).
ного микроразмножения Camelia sinensis (L.) Kuntze в качестве эксплантов лучше использовать апикальные и латеральные меристемы размером 0,30,5 см, отобранные с мая по октябрь. Пассирование эксплантов на среде WPM (Woody Plant Media) с цитокининами 6-бензиламинопурином (6-БАП, 3,0 мг/л) и аденином (0,9 мг/л) способствовало индукции многочисленных адвентивных микропобегов. При этом коэффициент размножения составил 1:4. Активный рост микропобегов у C. japónica L. также отмечали на питательной среде WPM с фиторегуляторами — 6-БАП (2 мг/л) и индо-лил-3-уксусной кислотой (ИУК, 0,5 мг/л) при коэффициенте размножения 1:3. У сортов Citrus limon (L.) Burm in vitro целесообразно использовать микропрививку, обеспечивающую надежное сохранение генотипов и увеличение коэффициента размножения в 2 раза. У лилии кавказской Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh. (эндемик) индукция адвентивных почек активно происходила из базальной части чешуй луковицы и составила 44,5 %. Проведенное изучение факторов, влияющих на органогенез в культуре in vitro у субтропических и декоративных растений, пополняет знания о морфогенезе в целом и позволяет разработать биотехнологическую методологию получения, сохранения и размножения ценных генотипов.
I. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений. Докг. дис. M., 1997.
2 . Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). М., 2008.
3. Красная книга Краснодарского края. Растения и грибы. Краснодар, 2007.
4. Citrus genetics, breeding and biotechnology /I.A. Khan (ed.). CAB International, UK, 2008.
5. Perez-Torne™ C.I. An efficient protocol for micropropagation of lemon (Citrus limon) from mature nodal segments. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 2009, 100: 263-271.
6. Гвасалия М.В. Некоторые вопросы клонального микроразмножения чая. В сб. науч. тр.: Субтропическое и декоративное садоводство. Сочи, 2012, вып. 46: 133-137.
7. Иддагода Н., Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Особенности получения асептической культуры и клональное микроразмножение взрослых растений чая (Camellia sinensis L.). Сельскохозяйственная биология, 1990, 5: 98-104.
8. Гвасалия М.В. Клональное микроразмножение растений чая (Thea sinensis L.) в культуре in vitro. Садоводство и виноградарство, 2013, 4: 20-22.
9. Гвасалия М.В. Особенности получения асептической культуры при клональном микроразмножении чая (Thea sinensis L.). Мат. Межд. науч. конф. «Дендрология цветоводство и садово-парковое строительство». Ялта, 2012, т. 2: 93.
10. FAO Citrus Fruit Production. Food and Agriculture Organization (FAO) of the United Nations, FAOSTAT, 2009 (http://faostat.fao.org).
II. Глоба-Михайленко И.Д. Использование метода культуры ткани в цитрусоводстве. Субтропические культуры, 1980, 3: 32-35.
12. Бутенко Р.Г., Шенгелия Л.Н. Клональное микроразмножение цитрусовых культурой пазушных почек. В сб.: Культура клеток растений и биотехнология. М., 1986: 110-113.
13. Глоба-Михайленко И.Д., Хусайни С. Микропрививка мандарина Уншиу. Тез. докл. Всес. конф. молодых ученых и аспирантов. Тбилиси, 1987: 131.
Рис. 5. Адвентивные побеги (слева) и каллусогенез (справа) у эксплантов эндемика Lilium caucasicum Misez. ex Grossh., полученных из медиальной части чешуй луковицы, на полной среде Мурасиге-Скуга с добавлением а-нафтилук-сусной кислоты (1 мг/л) и 6-бен-зиламинопурина (3 мг/л).
Итак, для клональ-
ЛИТЕРАТУРА
14. Rath ore J.S. Micropropagation of mature tree of Citrus limon. Ind. J. Biotechnol., 2007, 6: 239-244.
15. S a i n i H.K. Direct shoot organogenesis and plant regeneration in rough lemon (Citrus jambiri Lush.) Gill. Ind. J. Biotechnol., 2010, 9: 419-423.
16. Singh S. Citrus biotechnology: Achievements, limitations and future directions. Physiol. Mol. Biol. Plants., 2009, 15(1): 3-22.
17. Кар пун Ю.Н. Субтропическая декоративная дендрология. СПб, 2010.
18. Edison S., Unnikrishnan M., Vimala B., Santha V. Biodiversity of tropical tuber crops in India. National Biodiversity Authority, Chennai, Tami Nadu, India, 2006.
19. Reed B., Sarasan M., Kane V. Biodiversity conservation and conservation biotechnology tools. In vitro Cell Dev. Biol. — Plant, 2011, 47: 1-4.
20. Barnicoat H., Cripps R., Kendon J., Sarasan V. Conservation in vitro of rare and threatened ferns — case studies of biodiversity hotspot and island species. In vitro Cell Dev. Biol. — Plant, 2011, 47: 37-45.
21. Marriott P., Sarasan V. Novel micropropagation and weaning methods for the integrated conservation of a critically endangered tree species, Medusagyne oppositifolia. In vitro Cell Dev. Biol. — Plant, 2010, 46: 516-523.
22. S a r a s a n V. Importance of in vitro technology to future conservation programmes worldwide. Kew Bulletin, 2010, 65: 549-554.
23. Sarasan V., Kite G., Sileshi C. Applications of phytochemical and in vitro techniques for reducing over-harvesting of medicinal and pesticidal plants and generating income for the rural poor. Plant Cell Rep., 2011, 30: 1163-1172.
24. Coates D.J., Dixon K.W. Current perspectives in plant conservation biology. Austral. J. Bot., 2007, 55(3): 187-193 (http://dx.doi.org/10.1071/BT07037).
25. Евсюкова T.B., Коломиец T.M. Некоторые аспекты сохранения генофонда кавказских видов колокольчиков. B сб.: Научные основы развития цветоводства России и проектирование садовых ландшафтов. M., 2006: 94-97.
26. Тибилов А.А. Методические рекомендации по клональному микроразмножению шафрана прекрасного в культуре in vitro. М., 2003.
27. Соколов Р.Н., Коломиец Т.М., Маляровская В.И. Введение в культуру in vitro некоторых редких и исчезающих видов флоры Западного Кавказа. Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета, 2013, 10(094) (http://ej.kubagro.ru/2013/10/pdf/13.pdf).
28. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-497.
29. Gamborg O.G., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley. Canad. J. Biochem., 1968, 46(5): 417-421.
30. Lloyd G., McCown B.H. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Combined Proceedings, Int. Plant Propagators Society USA, 1980, 30: 421-427.
31. Navarro L. Citrus shoot-tip grafting in vitro and its application: a review. Proc. Int. Ci-triculture, 1981, 1: 452-456.
32. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М., 1985.
33. Samarina L.S. Regeneration and micropropagation of lemon cultivars in vitro from nodal explants. Russian Agricultural Science, 2010, 36(6): 417-420.
34. Самарина Л.С. Оптимизация приемов микроразмножения и сохранения лимона in vitro. Автореф. канд. дис. М., 2013.
35. Driver J.A., Kuniyuki A.H. In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hortscience, 1984, 19: 507-509.
36. Singh B., Sharma S., Rani G., Hallan V., Zaidi A.A., Virk G.S., Nagpal A. In vitro micrografting for the production of Indian citrus ringspot virus (ICRSV)-free plants of kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour x C. deliciosa Tenora). Plant Biotechnol. Rep., 2008, 2: 137-143 (doi: 10.1007/s11816-008-0055-6).
37. Маляровская В.И. Особенности получения стерильной культуры камелии японской (Camellia japonica L.). В сб. науч. тр.: Субтропическое и декоративное садоводство. Сочи, 2012, вып. 47: 161-168.
38. Маляровская В.И. Индукция органогенеза в культуре ткани Camellia japonica. Мат. Межд. науч. конф. «Биологически активные вещества растений — изучение и использование». Минск, 2013: 140-141.
ГНУ Всероссийский НИИ цветоводства Поступила в редакцию
и субтропических культур Россельхозакадемии, 24 марта 2014 года
354002 Россия, г. Сочи, ул. Яна Фабрициуса, 2/28, e-mail: gvasaliya_aa@mail.ru
PROPAGATION in vitro OF SUBTROPICAL, ORNAMENTAL CROPS
AND ENDEMIC SPECIES OF WESTERN CAUCASUS: DEVELOPED AND IMPROVED PROTOCOLS
T.M. Kolomiets, V.I. Malyarovskaya, M.V. Gvasaliya, L.S. Samarina, R.N. Sokolov
All-Russian Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops, Russian Academy of Agricultural Sciences, 2/28, ul. Yana Fabriciusa, Sochi, 354002 Russia, e-mail gvasaliya_aa@mail.ru Received March 24, 2014
Abstract
To obtain good planting material in floriculture and horticulture, the effective procedures are required for testing and sanitation. Micropropagation is also commonly known as an approach to intensifying plant breeding due to accelerated reproduction of valuable forms and as a way to save biodiversity of rare species. Nevertheless, for many flowering plants, and subtropical fruit crops and endemic species especially, the reliable protocols for in vitro cultivation, regeneration and propagation are not yet reported. This paper presents the results of a revised protocol application and the improvement of clonal micropropagation methods for tea Camellia sinensis (L.) Kuntze, lemon Citrus limon (L.) Burm, blossoming shrub Camellia japonica L., and Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh., an endangered endemic species in the Western Caucasus. Some peculiarities in obtaining sterile culture are revealed, and the types of explants and seasonal terms of their introduction to in vitro culture are identified. Nutrient mediums and conditions for clonal micropropagation are optimized. Thus, cultivation of tea explants on WPM supplemented with phytohormones (i.e. 6-BAP at 3.0 mg/l and adenine at 0.9 mg/l) facilitated the induction of numerous adventitious microshoots. Aactive growth of C. japonica microshoots was also observed on the WPM medium with 6-BAP at 2 mg/l and indole-3-acetic acid at 0.5 mg/l. In lemon cultivars, microengrafting is approved as a reliable propagation method. It was revealed that after the third cycle of microengrafting the multiplication index for microstalstalks was 2 times higher comparing to that for microshoots from auxiliary buds of donor plants, and made up 4.6 pc. per shoot. The results of in vitro cultivation of the various parts of Lilium caucasicum bulb scales showed that the induction of morphogenesis was not the same. After 48 days in vitro cultivation under sterile conditions, from the basal and medial scale parts the adventitious shoots were mainly developing, whereas callus- and rhizogenesis occurred rarely, while in the apical scale parts the callus formation dominated. In special publications there are no data on L. caucasicum cell and tissue in vitro cultivation. So, the protocol for in vitro cultivation and propagation of this endangered endemic species of the Western Caucasus is reported here for the first time.
Keywords: speed sterilization, clonal micropropagation, microshoots, microengrafting, tea Camellia sinensis (L.) Kuntze, lemon Citrus limon (L.) Burm, Camellia japonica L., Lilium caucasi-cum Miscz. ex Grossh.
Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология» выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей
Для получения электронного оттиска Вам необходимо:
•!• отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы) по адресу agrobiol@mail.ru, указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;
❖ получить из редакции по своему e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);
❖ оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.
Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.
Банковские реквизиты редакции:
Получатель: Банк получателя:
ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная Сбербанк России ОАО г. Москва, биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, БИК 044525225,
г. Москва, р/с 40703810638050100603 к/с 30101810400000000225
В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.
Стоимость услуги:
❖ один оттиск — 120 руб.,
❖ не более шести оттисков (абонемент) — 360 руб.,
❖ не более двенадцати оттисков (абонемент) — 700 руб.
НДС не облагается.. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.
E-mail для заказа электронных оттисков — agrobiol@mail.ru
© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйственная биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.
