CC BY
59
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
СЕЛЬ СКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ
НАУКИ
УДК 633.72:576.316.7 DOI: 10.24411/2072-0920-2019-10314
Гвасалия M.B., Самарина JI.C.
МЕТОД ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРИОТИПА ВЫДЕЛЕННЫХ INVITRO СОМАКЛОНОВ ЧАЯ (|CAMELLIASINENSIS (L.) О. KUNTZE)
Гвасалия Майя Валериановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур», Россия E-mail: m.v.gvasaliya@mail.ru
Самарина Лидия Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур», Россия E-mail: samarinalidia@gmail.com
Методом проточной цитометрии (на приборе цитометр, фирмы Весктап Coulter) проведено изучение генетической изменчивости кариотипау выделенных in vitro 15 соматических клонов растений чая. Сомаклоны были получены путем индукции геммогенеза из каллусной культуры микропобегов чая, находящихся в течение 8 лет в пересадочной культуре in vitro. Базовой питательной средой для культивирования соматических клонов служила модифицированная минеральная основа по прописи Мурасиге и Скуга (МС), с добавлением регуляторов роста: б - БАП - 2,5 мл + НУ К - 0,2 мл + ГК - 1,0 мл + мезоинозит 100 мг. Изменения кариотипа фиксировались по анализу размера генома. В качестве внешнего стандарта использовали генотип чая сорта Колхида 2п = 30 и внешний стандарт Allium сера 2п = 18 (32,07 пг ДНК). В результате исследований была выявлена изменчивость по размеру генома у трех из 15 сомаклонов чая. У сомакло-нов (Sc - 11; Sc - 27; Sc - 33) размер генома составил 7,26-8,70 пг (пико-
грамм) ДНК в сравнении с контрольным генотипом - диплоидным сортом Колхида, у которого размер генома составил 5,08 пг ДНК. Наличие сомаклональной из-
156
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
менчивостиу выделенных no фенотипическим признакам сомаклонов (Sc- 11; Sc-27; Sc- 33) подтвердилось на уровне кариотипа.
Ключевые слова: Camellia sinensis (L.) О. Kuntze, метод проточной цито-метрии, сомак.юнаяъпая изменчивость in vitro, сомаклоны чая, кариотип, размер генома.
Для цитирования: Гвасалия М.В., Самарина JI.C. Метод проточной цито-метрии для определения кариотипа выделенных INVITRO сомаклонов чая (CAMELLIA SINENSIS (L.) О. KUNTZE) // Новые технологии. 2019. Вып. 3(49). С. 156-163. DOI: 10.24411/2072-0920-2019-10314.
Gvasaliya M.V., Samarina L.S.
FLOW CYTOMETRY METHOD FOR DETERMINING THE KARIOTYPE OF TEA SOMATIC CLONES ISOLATED IN VITRO (CAMELLIA SINENSIS (L.) O. KUNTZE)
Gvasaliya Maya Valerianovna, Candidate of Biology, a senior researcher of the Laboratory of Biotechnology
FSBSI "All-Russian Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops", Russia E-mail: m.v.gvasaliya@mail.ru
Samarina Lidia Sergeevna, Candi date of Biology, a senior researcher
FSBSI "All-Russian Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops", Russia
E-mail: samarinalidia@gmail.com
The method of flow cytometry (on Beckman Coulter company cytometer) has been used to study the genetic variation of the karyotype in 15 somatic clones of tea plants isolated in vitro. Somatic clones have been obtained by inducing gemmogene-sis from a callus culture of tea micro sprouts, which have been in vitro root-to-seed for 8 years. The Murashige and Skoog modified mineral base (MS) with an addition of growth regulators of 6 - BAP - 2,5 ml + NAA - 0,2 ml + HA -1,0 ml + myoinositol - 100 mg have been the basic nutrient medium for cultivating somatic clones. Changes in the karyotype have been recorded by analysis of the genome size. The Colchis tea genotype of 2m - 30 and the Allium сера 2n = 18 monitor sample (32,07 pg DNA) have been used as external standards. As a result of the studies, genome size variability has been detected in 3 of the 15 tea somatic clones. In somatic clones (Sc - 11; Sc - 27; Sc - 33) the genome size is 7,26-8,70 pg (picograms) of DNA compared with the control genotype of the diploid Colchis variety, whose genome size is 5.08 pg of DNA. The presence of somaclonal variability in somatic clones iso-
157
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
lated by phenotypic traits (Sc - 11; Sc - 27; Sc - 33) has been confirmed at the karyotype level.
Keywords: Camellia sinensis (L.) O. Kantze, flow cytometry method, somaclonal variation in vitro, tea somatic clones, karyotype, genome size.
For citation: Gvasaliya M.V., Samarina L.S. Flow cytometry method for determining the kariotype of tea somatic clones isolated in vitro (CAMELLIA SINENSIS (1.) O. KUNTZE) // Novye tehnologii (Majkop). 2019. Iss. 3(49). P. 156-163. (In Russ., English abstract). DOI: 10.24411/2072-0920-2019-10314.
Интенсификация отрасли чаеводства ставит перед учеными новые задачи, среди которых главной является улучшение качества отечественного чая и повышение его конкурентной способности. Не менее важная задача - реконструкция и перезакладка старых чайных насаждений, возраст которых насчитывает более 60-70 лет. В связи с этим, на освободившихся после корчевки площадях будет необходима закладка чайных плантаций новыми, элитными сортами, отличающимися не только высокой продуктивностью и биохимическими показателями сырья, но и устойчивостью к засухе и низким температурам, позволяющим выращивать культуру чая в более северных районах Краснодарского края. Для достижения этой цели в нашем распоряжении имеются все необходимые высокотехнологичные методы, которые позволяют не только ускорить, но и повысить эффективность селекционных исследований. Методы биотехнологии располагают новым уникальным инструментом расширения генетической вариабельности - сомаклональной изменчивостью, основанную на культивировании растительных клеток в условиях in vitro [1, 2, 3]
При культивировании соматических клеток в искусственных условиях in vitro, благодаря процессам сомаклональной изменчивости и Вавиловского закона о гомологических рядах наследственной изменчивости, в растениях может быть восстановлен весь скрытый генетический полиморфизм, который присущ данному виду.
Изменчивость in vitro это уникальный механизм не только для создания новых сортов, но и для сохранения генетического разнообразия, утерянного в процессе эволюции растений [4, 5]. Частота возникновения сомаклональной изменчивости в культуре ткани в разы выше частоты мутаций, возникших в результате спонтанного мутагенеза. В настоящее время, гибридизация и индуцированный мутагенез уже не отвечает растущим потребностям практической селекции. Следует отметить, что даже при использовании высоких доз физических и химических мутагенов происходит подавление экспрессии большинства генов. Например, при изолировании клетки из целого организма и её переноса в искусственные условия культивирования in vitro, практически полностью устраняется
158
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
влияние тканевых и организменных регуляторных систем, которые обеспечивают стабильность генома. Таким образом, не привнося в питательную среду сильных мутагенов, а только переведя клетки в состояние культуры in vitro, можно получить широкий спектр изменчивости на генетическом уровне [5, 6, 7].
Использование в селекции сомаклональной изменчивости in vitro способствует получению в короткие сроки, нового высокопродуктивного сорта, причем с заранее заданными характеристиками. Например, в одном генотипе чайного растения можно соединить такие ценные для него признаки, как высокое содержание танина и экстрактивных веществ, урожайность, морозо- и засухоустойчивость. Для того, чтобы подтвердить факт возникновения сомаклональных вариантов, необходимо изучить их по фенотипу, провести цитологические и молекулярно-генети-ческие исследования (с использованием метода проточной цитометрии изучить ка-риотип по размеру генома, использовать молекулярные маркеры и т.д. [8, 9].
Методы исследований
Объектами исследований служили 15 соматических клонов, которые были получены в результате геммогенеза из базального каллуса растений чая. Сома-клоны культивировались in vitro в течение длительного времени (8 лет) с периодическим пассированием на новые питательные среды. Основной питательной средой служила модифицированная минеральная основа по прописи Мурасиге -Скуга (MC), с добавлением следующих концентраций регуляторов роста: 6 - БАЛ -2,5 мл + НУК - 0,2 мл + ГК - 1,0 мл + мезоинозит - 100 мг. Все работы по культивированию микропобегов чая проводились в условиях строгой стерильности, в специально отведенном помещении, в ламинар-боксах. Соблюдался фотопериод -16/8 час., температура 25±1,0°С, влажность - 70 %, освещенность 4000-5000 лк.
Для определения кариотипа, выделенных по фенотипическим отличиям сомаклонов чая, применяли метод проточной цитометрии с использованием прибора цитометра Beckman Coulter. В качестве внешнего стандарта использовали генотип чая сорта Колхида 2п = 30 и внешний стандарт Allium сера 2п = 18 (32,07 пг ДНК). Изменения кариотипа фиксировались по анализу размера генома. Для этого 160 мг свежих листьев чая помещали в 800 мкл холодного буфера, измельчали лезвием в кашицу в чашке Петри. Состав буфера для экстракции ядер WPB (Loureiro et al., 2007): 0,2 М Tris HCl, 4 mM MgCl2 6H20, 2,5 mM EDTA Na2H20, 86 mM NaCl, 10 mM метабисульфит Na, 1,5% Triton Х-100, 2% PVP-10, pH 7,5. Суспензию ядер фильтровали с помощью мембран Sartorius (Германия), размером по 40 мкм. Иодид пропидия 30 мкг/мл был взят в качестве красителя (с предобработкой РНКазой мкг/мл), время окрашивания 40 минут.
159
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
Результаты исследований
Изменения на уровне кариотипа изучались методом проточной цитометрии по результатам анализа размера генома сомаклонов чая. Метод проточной цитометрии основан на степени дисперсии света лазерного луча, которая дает представление о размерах клетки. При проведении этого метода используют внешние стандарты таких культур как лук, редис, пшеницу. В нашем случае был выбран лук Allium сера 2п = 18 (3,2 пг ДНК) (рис. 1).
Multi-sample Р1
Сорт Колхида | Sc -27 ■
внешнгш стандарт Allium сера внешний стандарт сорт Колхида
2п = 18 2п = 30 и сомаклон Sc- 27
Рис. 1. Диаграмма проточной цитометрии
12
Размер генома измеряется в пикограммах (это 10" г). Зная размер генома лука и его диплоидный набор хромосом, мы провели калибровку цитометра, и настроили его на работу. Далее по пропорции и формуле вычислили размер генома Колхиды, который составил 5,08 пг, прогнали образцы через цитометр, получили пики, по которым в дальнейшем проводили сравнение сомаклонов.
Из 15 выделенных сомаклонов, исследования были проведены на 3-х, которые имели самое яркое фенотипическое отличие от исходного генотипа (рис. 2).
Предварительные результаты исследований показали, что все три сомаклона показали отличие как между собой, так и по сравнению с сортом Колхида (рис. 3).
Так размер их геномов составил 7,26 - 8,0 - 8,70 пг ДНК, что больше на 2,2 - 2,9 - 3,6 пг по сравнению с диплоидным сортом Колхида, размер генома которого составил 5,08 пг ДНК.
ISSN 2072-0920
NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
Sc - 27
Sc-33
Рис. 2. Сомаклоиы чая: Sc - 11; Sc - 27; Sc - 33
161
ISSN 2072-0920
NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
Sc -11
101 1# 1 o3
8.0 ПГ
Рис. 3. Диаграмма проточной щтюметрии сомаклонов чая: Sc - 11 (8,0 пг ДНК) и Sc - 33 (8,7 пг ДНК)
Таким образом, метод проточной цитометрии подтвердил наличие сома-клональной изменчивости как на уровне фенотипа, так и на уровне кариотипа по размеру генома у 3-х из 15 выделенных сомаклонов чая.
Литература:
1. Гвасалия М.В. Биотехнологические приёмы в селекции чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze) // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: материалы XII Международной конференции (6-10 июня 2016 г., Ялта). М.: РУДН, 2016. С. 308-311.
2. Гвасалия М.В. Сохранение уникальных сортов растений чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze) методами биотехнологии // Субтропическое и декоративное садоводство. 2016. Вып. 59. С. 100-106.
3. Сомаклональная вариабельность как источник для создания новых сортов пальчатого проса Eleusine coracana (L.) Gaertn / Баер Г.Я. [и др.] // Цитология и генетика. 2007. №4. С. 9-14.
4. Кунах В.А. Эволюция клеточных популяций invitro: особенности, механизмы, движущие силы и следствия // Биология клеток растений invitro и биотехнология: сборник тезисов X Международной конференции (Казань, 14-18 октября). Казань, 2013. С. 47.
5. Долгих Ю.И. Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования (на примере кукурузы): автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 2005. 45 с.
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2019. 3(49)
6. Леонова H.C. Изменчивость в культуре картофеля (,Solatium tuberosum (L.) invitro и возможности её использования в селекции и семеноводстве: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Улан-Удэ, 2010. 32 с.
7 Дитченко Т.И. Культура клеток, тканей и органов растений. Минск: БГУ, 2007. 102 с.
8. Mishiba K.I., Tawada K.I., Mii М. Ploidy distribution in the explant tissue and the calluses induced during the initial stage of internode segment culture of Asparagus officinalis (L.) // In Vitro Cellular and Developmental Biology. Plant. 2006. Vol. 42. P. 83-88.
9. Nontaswatsri ( .. Fukai S. Regenerative callus of Dianthus 'Telstar Scarlet' showing mixoploidy produce diploid plants // Plant Cell Tissue Organ Culture. 2005. Vol. 83. P. 351-355.
Literature:
1. Gvasaliya M.V. Biotechnological techniques in tea selection of (Camellia sinensis (L.) Kuntze) // New and non-traditional plants and prospects for their use: materials of the XII International Conference (June 6-10, 2016, Yalta). M.: RUDN, 2016. P. 308-311.
2. Gvasalia M.V. Preservation of unique tea varieties (Camellia sinensis (L.) Kuntze) using biotechnological methods // Subtropical and ornamental Gardening. 2016. Issue. 59. P. 100-106.
3. Somaclonal variability as a source for creating new varieties of Eleiisine coracctn (L.) Gaertn finger millet / Bayer G.Ya. [et al.] // Cytology and Genetics. 2007. No. 4. P. 9-14.
4. Kunakh V.A. Invitro cell population evolution: features, mechanisms, driving forces and consequences // Invitro plant cell Biology and Biotechnology: collection of abstracts of X International Conference (Kazan, October 14-18). Kazan, 2013. P. 47.
5. Dolgikh Yu.I. Somaclonal variability of plants and the possibi lity of its practical use (on the example of corn): abstr. of diss. ... Dr. of Biology. M., 2005. 45 p
6. Leonova N.S. Variability in potato cultivation (Solatium tuberosum (L.) in vitro and the possibility of its use in Breeding and Seed production: abstract of diss. ... Dr. of Biology. Ulan-Ude, 2010. 32 p.
7. Ditchenko T.I. Culture of cells, tissues and organs of plants. Minsk: BSU, 2007. 102 p.
8. Mishiba K.I., Tawada K.I., Mii M. Ploidy distribution in the explant tissue and the calluses induced during the initial stage of internode segment culture of Asparagus officinalis (L.) // In Vitro Cellular and Developmental Biology. Plant. 2006. Vol. 42. P. 83-88
9. Nontaswatsri C., Fukai S. Regenerative callus of Dianthus 'Telstar Scarlet' showing mixoploidy produce diploid plants // Plant Cell Tissue Organ Culture. 2005. Vol. 83. P. 351-355.
