CC BY
174
УДК 578:581.5(470.62)
ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO НЕКОТОРЫХ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ ФЛОРЫ ЗАПАДНОГО КАВКАЗА
Соколов Роман Николаевич аспирант, м.н.с.
Коломиец Татьяна Михайловна к.с-хн, ст.науч.сотр
Маляровская Валентина Ивановна к.б.н, заб.лаб.
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур Росселъхозакадемии, Сочи, Россия
Разработаны приемы стерилизации и введения в культуру in vitro исчезающих видов растений Кавказской флоры: Campanula sclerophylla Kolak., Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh., Daphne woronowii Kolak., Pancratium maritimum L.
Изучено влияние различных фитогормонов, их сочетаний и концентраций на процессы регенерации, роста и развития растений.
В результате клонального размножения в культуре ткани сохраняется более ста растений колокольчика твердолистного (Campanula sclerophylla Kolak), около 30 растений панкрация морского (Pancratium maritimum L..) и 150 образцов лилии кавказской (Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh)
Ключевые слова: CAMPANULA SCLEROPHYLLA, LILIUM CAUCASICUM, DAPHNE WORONOWII, PANCRATIUM MARITIMUM, IN VITRO, СТЕРИЛИЗАЦИЯ РЕРЕНЕРАЦИЯ, МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ
UDK 578:581.5(470.62)
INTRODUCTION OF SOME RARE AND ENDANGERED SPECIES OF WESTERN CAUCASUS FLORA TO IN VITRO CULTURE
Sokolov Roman Nikolayevich Postgraduate student, junior research assistant
Kolomijets Tatyana Mikhailovna Cand.Agr.Sci., senior research assistant
Malyarovskaya Valentina Ivanovna Cand.Biol.Sci., Head of the Laboratory All-Russian Scientific and Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops of the Russian Academy of Agricultural Sciences, Sochi, Russia
There were developed some methods of sterilization and introduction of the following endangered species of Caucasian flora to in vitro culture: Campanula sclerophylla Kolak., lilium caucasicum Miscz. ex Grossh., Daphne woronowii Kolak., Pancratium maritimum I.. The effect of different plant hormones as well as their combinations and concentrations on the regeneration, growth and development of plants is studied. As a result of clonal propagation, more than 100 plants of Campanula sclerophylla Kolak, about 30 plants of Pancratium maritimum L., and 150 samples of Lilium caucasicum Miscz. Ex Grossh are saved in tissue culture
Keywords: CAMPANULA SCLEROPHYLLA, LILIUM CAUCASICUM, DAPHNE WORONOWII, PANCRATIUM MARITIMUM, IN VITRO, DECONTAMINATION, REGENERATION, MICROPROPAGATION
ВВЕДЕНИЕ
Сохранение биологического разнообразия — одна из важнейших задач в деле охраны природы, которой уделяют большое внимание во всем мире. Связано это с ограниченностью необходимых для существования человека биологических ресурсов и угрозой их истощения. Важность сохранения биоразнообразия осознана людьми, как на планетарном, так и на национальном уровнях. Об этом свидетельствует принятая на Генеральной ассамблее Международного союза биологических наук при поддержке ЮНЕСКО Международная программа
"DIVERSITAS"[17] и Международная Конвенция о сохранении биологического разнообразия [6]. Последняя была ратифицирована Россией в 1995 году, и на ее основе была подготовлена российская государственная научно-техническая программа "Биологическое разнообразие"[25].
Вышеперечисленные программные документы предлагают в качестве мер по сохранению биоразнообразия, в частности разнообразия флоры, использование методов ex situ (создание ботанических садов, хранилищ зародышевой плазмы и др.) и in situ (образование на территории государств заповедников, заказников и других природоохранных зон). Но, наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ и in situ, все большее значение приобретает использование для этих целей методов биотехнологии, в частности, методик культивирования изолированных тканей и органов. Созданием коллекций in vitro исчезающих и редких видов занимаются в Индии [18]; в США [22]; в Великобритании [15, 20, 23, 24]; в Австралии — [16], и в целом ряде других стран.
В России исследования по проблемам сохранения растительного разнообразия методами культуры тканей проводятся в Главном ботаническом саду им. Н.В. Цицина [3], Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН [10], в Волгоградском региональном Ботаническом саду [1], Алтайском государственном университете [4] и других научных заведениях.
На Черноморском побережье Западного Кавказа также повсеместно отмечается нарушение режима функционирования и деградация древних природных сообществ. В связи с этим, актуальными являются исследования по разработке методов сохранения растений, численность популяций которых резко падает, а также уникальных слабоизученных форм, способных в будущем расширить и улучшить сортимент возделываемых культур. Широко используемые методы сохранения исчезающих видов флоры, такие как создание особо охраняемых природных территорий и сохранение редких видов в ботанических садах не всегда способны в полной мере обеспечить сохранность исчезающих
генотипов растений, и современное экологическое состояние района проведения XXII Зимних Олимпийских игр лучшее тому подтверждение [11].
В 2003—2007 гг. в ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии были проведены исследования по разработке методик клонального микроразмножения некоторых эндемичных видов флоры Западного Кавказа: Campanula longistyla Fomin., С. alliarifolia Willd., С. latifolia L., С. taurica Juz., C. bzybica [5], Crocus speciosus Bieb. [14]. В настоящее время работа в этом направлении продолжается.
В связи с вышесказанным нами поставлена цель — создать резервную медленнорастущую коллекцию редких, эндемичных и исчезающих видов растений Западного Кавказа для сохранения их от вымирания, последующего изучения и вовлечения в хозяйственную деятельность. На начальном этапе исследований решали следующие задачи:
— определить оптимальные режимы стерилизации;
— изучить особенности развития различных типов эксплантов в культуре in
vitro;
— оптимизировать составы питательных сред для введения растений в стерильную культуру и их размножения.
Необходимо отметить, что регенерация растений может быть осуществлена несколькими путями:
— через активацию уже существующих меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля);
— через индукцию возникновения почек и эмбриоидов de novo, которая включает:
а) образование побегов непосредственно тканями экспланта;
б) индукцию прямого или непрямого соматического эмбриогенеза;
в) дифференциацию адвентивных почек в каллу сной ткани [13]. Предпочтительными для достижения цели данной работы являются способы регенерации, исключающие формирование каллусной ткани, при этом
обеспечивающие наибольшую генетическую стабильность микропобегов [9].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследований для введения в культуру in vitro выбирали в соответствии со следующими критериями:
1. Принадлежность вида к одной из наиболее уязвимых категорий редкости, принятых в Красных книгах России [8] и Краснодарского края [7];
2. Практическая ценность видов (декоративность, лекарственная ценность) или их слабая изученность;
3. Затруднения в размножении традиционными способами.
На основе указанных критериев были выбраны 4 вида западно-кавказской флоры, различающиеся по статусу редкости (исчезающие, эндемичные, редкие): Campanula sderophyUa Kolak. (('am pan и I ас вас), Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh. (Liliaceae), Daphne woronowii Kolak. (Thymelaeaceae), Pancratium maritimum L. (Amaryllidaceae).
Подготовку эксплантов и введение их в культуру in vitro производили в стерильных условиях согласно общепринятым рекомендациям [2]. В процессе введения в культуру необходимо было оптимизировать стерилизацию эксплантов изучаемых растений в зависимости от их происхождения. Нами было опробовано действие различных дезинфецирующих агентов: гипохлорита натрия, этанола и нехлорсодержащего препарата «Велтолен» (активное начало — клатрат карбомид дидецилдиметиламмоний).
В качестве эксплантов Campanula sclerophylla использовали существующие меристемы вегетирующих растений. Каудексы1 освобождали от листьев, после чего промывали в проточной воде, а затем, в течении 5 минут в слабом растворе перманганата калия. После этого растительный материал снова промывали
1 Каудекс- утолщенное подземное или отчасти надземное образование, лишенное листьев, формирующееся из коротких оснований побегов. В отличие от корневищ каудекс не отмирает в своей нижней части, а переходит в многолетний корень.
проточной водой. Далее изучали влияние различных стерилизующих составов: 10 % (V/V) раствор гипохлорита натрия и 0,2 % раствор «Велтолена» при экспозиции 10 и 15 минут. Таким образом, было испытано четыре варианта способов обеззараживания эксплантов. После стерилизации и отмывки дезинфецирующих средств, в ламинар-боксе при помощи скальпеля отделяли меристемы и помещали их в пробирки с питательной средой. Для введения в культуру in vitro Campanula sclerophylla в первом пассаже использовали питательную среду Ван-Гоофа [26]. В процессе микроразмножения данного вида применяли среду Murashige, Skoog — (MS) [21] содержащую половинные количества макроэлементов и дополненную различными регуляторами роста цитокининовой и ауксиновой природы.
Стерилизация эксплантов Daphne woronowii проходила в два этапа: сначала апикальные и пазушные почки взрослых растений на несколько секунд погружали в 80 % раствор этанола для обезжиривания поверхности, а затем в основной стерилизующий состав (гипохлорит натрия или «Велтолен») на разное время. Опытным путем было изучено четыре варианта стерилизации: два
обеззараживающих раствора по 5 и 10 минут экспозиции. Для введения в культуру Daphne woronowii использовали среду WPM (Woody Plant Media) [19] с добавлением 0,2 мг/л а-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП и концентрацией сахарозы 20 г/л.
В качестве эксплантов Lilium caucasicum использовали различные части чешуй луковиц. Стерилизацию также проводили в два этапа. Сначала промытые части чешуй погружали в 96 % этанол на 1 мин., далее их переносили в основной дезинфицирующий раствор, в качестве которого использовали «Велтолен» 2 % или гипохлорит натрия 50 %. Также изучали влияние продолжительности действия стерилизующих веществ на обеззараживание растительного материала. Всего в опыте было шесть вариантов процесса стерилизации: два типа растворов («Велтолен» и гипохлорит натрия) по 5, 10 и 15 минут экспозиции. Для введения в культуру и индукции образования адвентивных почек у лилии кавказской применяли среды MS и /4 MS и несколько вариантов сочетаний ауксинов и
Научный журнал КубГАУ, №94(10), 2013 года цитокининов.
Для введения в стерильную культуру Pancratium maritimum использовали вызревшие семена, которые промывали в проточной воде 30 минут, затем погружали в слабый раствор перманганата калия на 10 минут, после чего дезинфицировали 30 минут в 10% растворе «Доместос». Далее снимали с семян губчатую оболочку и помещали на питательную среду MS, дополненную регуляторами роста: а-нафтилуксусной кислотой (а-НУК), 6-бензиламинопурином (6-БАП), индолилмасляной кислотой (ИМК) и аденином.
Содержание сахарозы в среде для культивирования Campanula sclerophylla составляло 20 г/л, в среде для индукции побегообразования у Lilium caucasicum — 30 г/л, в среде для размножения Lilium caucasicum — 20 г/л. Концентрация агар-агара во всех средах составляла 5 г/л. Регуляторы роста и витамины стерилизовали фильтрованием (Millipore, 0,22 мкм) и добавляли в остывшую среду после автоклавирования.
В условиях лаборатории растения Campanula sclerophylla и Pancratium maritimum выращивали при искусственном освещении (5000 лк) и фотопериоде 16/8ч., температуре 23-25 °С и влажности 70%. Экспланты Lilium caucasicum и Daphne woronowii культивировали в темноте в течение 4 недель для инициации ростовых процессов, после чего переносили в культуральную комнату с условиями, аналогичными культивированию Campanula sclerophylla.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении влияния стерилизующих веществ (гипохлорит натрия, Велтолен) на процесс обеззараживания меристем Campanula sclerophylla установлено, что лучший результат стерилизации был достигнут с применением препарата «Велтолен» 0,2 % в течение 10 минут экспозиции. Гипохлорит натрия вызывал некрозы нежных меристематических тканей (табл. 1).
Таблица 1— Стерилизация эксплантов на этапе введения в культуру in vitro Campanula
sclerophylla
Стерилизующий раствор Время экспозиции, мин Число эксплантов, шт Число стерильных эксплантов, шт
Г ипохлорит Na, 10% 10 6 1
Г ипохлорит Na, 10% 15 6 1
Велтолен 0,2 % 10 6 4
Велтолен 0,2 % 15 6 3
Дальнейшее культивирование полученных микропобегов Campanula sclerophylla на питательной среде V2 MS показало, что добавление ауксина ИУК 0,1 мг/л и цитокинина 6-БАП 3,0 мг/л наиболее благоприятно влияло на их микроразмножение и позволило получить из одного растения до семи меристематических клонов (табл. 2, рис. 1).
Таблица 2— Коэффициент размножения микропобегов Campanula sclerophylla, в зависимости от
типа питательной среды и фитогормонов
Питательная среда Максимальное число меристематических клонов, шт Среднее число меристематических клонов, шт
1/2МС БАП 2,0+ИУК 0,5 3 2,1+0,5
1/2МС БАП 3,0+ИУК 1,0 7 5+0,7
1/2МС КИН 2,0+ИУК 0,5 4 1,7+0,6
1/2МС КИН 3,0+ГК 0,5 3 1,4+0,3
ВГ БАП 2,0+ИУК 0,5 2 1,2+0,2
ВГ Б АП 3,0+ИУК 1,0 2 1,3+0,3
ВГ КИН 2,0+ИУК 0,5 3 1,5+0,3
ВГ КИН 3,0+ГК 0,5 2 1,1 ±0,2
Укоренение растений проводили на среде /4 MS дополненной 0,5 мг/л ИУК. При этом растения образовывали хорошую корневую систему, необходимую для дальнейшей адаптации к нестерильным условиям (рис. 1). К настоящему моменту в коллекции in vitro имеется более 100 образцов Campanula sderophyUa, их размножение и укоренение продолжается.
Рисунок 1. Campanula sclerophylla на этапах введения в культуру (А), образования микропобегов
(Б), микроразмножения (В) и укоренения (Г).
Для Lilium caucasicum также был определен оптимальный режим стерилизации. Опыт показал, что «Велтолен» оказался намного эффективнее гипохлорита натрия (рис. 2). При использовании «Велтолена» в концентрации 2,0 % и экспозиции 10 минут выход стерильных эксплантов составил 66,7±8,6 %, при этом практически отсутствовали некрозы тканей, и не было ни одного бактериального заражения. Гипохлорит натрия в концентрации 50 %, напротив, «обжигал» экспланты, увеличивая этим вероятность дальнейшего развития на них каллусной ткани.
Среднее число стерильных эксплантов Lilium caucasicum от общего числа эксплантов, %
□ 1вар этанол 96% 1мин-» вептолен 2% 5мин
□ 2 вар этанол 96% 1мин-* вептолен 2% Юмин
ОЗвар этанол 96% 1мин—* вептолен 2% 15мин
О4вар этанол 96% 1мин —<бепизна£>0% 5 мин
■ 5 вар этанол 96% 1мин -*белизна50% 10 мин
□ бвар этанол 96% 1мин -^белизна50% 15 мин
Рисунок 2. Выход стерильных эксплантов Lilium caucasicum в зависимости от типа
стерилизующего вещества и экспозиции
В процессе культивирования Lilium caucasicum наблюдались различные пути образования органов и тканей de novo, в зависимости от типа экспланта. Для индукции ростовых процессов использовали среду 1/2МС дополненную 1мг/л НУК и 3 мг/л 6-БАП и три типа эксплантов: базальные, медиальные и апикальные части чешуй луковиц. На начальном этапе культивирования из базальных частей чешуй развивались преимущественно адвентивные побеги, реже происходили каллусогенез и образование корней, при этом эксплантов, не давших ответной реакции, не наблюдалось (табл. 3).
Медиальные части чешуй развивались по пути образования корней с той же частотой, что и базальные, а развитие по интересующему нас пути образования адвентивных почек и каллусообразования происходило значительно реже. Ответная реакция на условия in vitro апикальных частей чешуй была невысокой, причем развитие эксплантов происходило в базальной их части и характеризовалось преимущественно дедифференцировкой клеток и развитием каллусной ткани.
Таблица з— Развитие разных эксплантов Lilium caucasicum через 48 дней после введения в
культуру in vitro
Тип Число Корнеобразование, Индукция Каллусогенез, «Безответные»
экспланта эксплантов, шт адвентивных шт экспланты, шт
шт почек, шт
Базальная часть 45 13±1,07 20±0,53 12±0,92 0
Медиальная часть 45 13±1,92 15±1,60 9±0,92 8±1,07
Апикальная часть 45 2±0,53 3±0,92 7±1,07 33±0,92
Впоследствии при пассировании каллусов на среду МБ с добавлением 2 мг/л ауксина 2,4-0 (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) наблюдали формирование морфогенных зон и развитие микролуковичек в очагах интенсивного органогенеза (рис. 3).
При этом частота образования регенерантов из каллуса была значительно выше, чем при индукции адвентивных почек. Однако они могут генетически отличаться от материнских растений. Дальнейшие молекулярно-генетические и кариологические исследования позволят сделать выводы относительно генетической однородности полученных через стадию образования каллуса растений-регенерантов и возникновения сомаклональных вариаций.
Рисунок з. Развитие эксплантов Lilium caucasicunr. А) Адвентивные побеги; Б) Корнеобразование; В) Каллусогенез; Г) Образование микролуковиц из каллусной ткани
В опыте по стерилизации Daphne woronowii еще раз была подтверждена эффективность средства «Велтолен» для обеззараживания растительных эксплантов по сравнению с гипохлоритом натрия. Максимальная эффективность (88,9 %) его использования достигнута при экспозиции 15 минут (рис. 4).
Среднее число стерильных эксплантов Daphne woronowii от обще го числа эксплантов, %
Рисунок 4. Выход стерильных эксплантов Daphne woronowii, в зависимости от типа
стерилизующего вещества и экспозиции.
После инокуляпии на среду WPM, дополненную 0,2 мг/л а-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП почки Daphne woronowii поместили в темноту для инициации ростовых процессов и через 4 недели наблюдали первые микропобеги (рис. 5).
Рисунок 5. Введение в культуру Daphne woronowii с использованием среды WPM
Культивирование семян Pancratium maritimum показало, что срок наступления их массового прорастания незначительно изменялся на разных вариантах питательных сред. Наибольшее значение он принимал при добавлении в среду только ауксина ИМК, без цитокининов и составлял 8 дней. На рисунке 6 показано развитие семян в культуре (рис. 6).
Рисунок 6. Прорастание и развитие Pancratium maritimum in vitro на среде MS
Существенные различия отмечены по массе растений и количеству образовавшихся микролуковиц при использовании разных регуляторов роста (табл.
Таблица 4. Влияние регуляторов роста (мг/л) на массу регенерантов и количество микролуковиц у
панкрация морского спустя 30 дней после инокуляции
Параметры роста Сочетание фитогормонов
БАП 0,25мг/л + ИМК 0,5мг/л БАП 2мг/л + ИМК 0,5 мг/л ИМК 0,5мг/л
Масса регенеранта, г 0,99±0,39 0,45±0,17 2,23±0,54
Кол-во микролуковиц, шт 2,59±0,92 — 4,43±1,08
Следует заметить, что при последующих пассажах на свежую среду зелёную часть побегов обрезали, после чего наблюдали нарастание основной луковицы и, в некоторых случаях, появление микролуковичек. На питательной среде, содержащей 6-БАП 2 мг/л ~I- ИМК 0,5 мг/л микролуковицы нэ. корнях не обрззовывштись^
корневая система развивалась медленно, и масса растений не превышала 600 мг. При понижении концентрации 6-БАП отмечали появление 3-4 микролуковиц, и увеличение массы растений почти в два раза. Максимальное количество микролуковиц наблюдалось на среде, содержащей только ауксин ИМК (без 6-БАП), и составляло 4-5 штук [12].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
— наиболее эффективной является стерилизация: меристем Campanula sclerophylla «Велтоленом» 0,2 % в течение 10 минут, чешуй Lilium caucasicum «Велтоленом» 2 % в течение 10 минут после погружения в 96 % этанол на 1 минуту, апикальных и пазушных почек Daphne woronowii «Велтоленом» 0,2 % в течение 15 минут, семян Pancratium maritimum «Доместосом» 10 % в течение 30 минут;
— оптимальной средой для микроразмножения Campanula sclerophylla оказалась /4 MS, дополненная 3 мг/л 6-БАП и 1мг/л ПУК;
— при культивировании Daphne woronowii на среде WPM, дополненной 0,2 мг/л а-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП были получены микропобеги;
— для индукции образования адвентивных почек de novo у Lilium caucasicum оптимальным типом эксплантов являются базальные части чешуй луковицы. При культивировании на питательной среде /4 MS, дополненной 1 мг/л НУК и 3 мг/л 6-БАП из них развивалось наибольшее количество микропобегов. Добавление в среду MS 2 мг/л ауксина 2,4-D способствовало формированию морфогенного каллуса из которого развивались растения-регенеранты;
— максимальное количество микролуковиц Pancratium maritimum, до 5 штук на растение, наблюдалось на среде MS с добавлением ИМК 0,5 мг/л.
Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (грант № 13-04-96572)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Агеева С. Е. и др. Сохранение биоразнообразия редких и исчезающих видов растений в Волгоградском региональном Ботаническом саду // Вестник БФУ им. И. Канта. — 2012. №7. — С. 103-109.
2. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. — М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. — 158 с.
3. Ветчинкина Е. М. Сохранение редких видов растений в генетических коллекциях in vitro II Вестник БФУ им. И. Канта. —2012. №7. — С.109-118.
4. Вечернина Н. А. Сохранение биологического разнообразия редких, исчезающих видов, уникальных форм и сортов растений методами биотехнологии: Дис. докт. биол. наук: 03.00.05 / Алтайский гос. ун-т. Барнаул, 2006. 325 с.
5. Евсюкова Т. В., Коломиец Т. М. Некоторые аспекты сохранения генофонда кавказских видов колокольчиков.// Научные основы развития цветоводства России и проектирование садовых ландшафтов. — М: ГНУ ВСТИСЛ, 2006, С. 94-97.
6. Конвенция о биологическом разнообразии [Электронный ресурс]: Конвенция о
биологическом разнообразии — Конвенции и соглашения — Декларации, конвенции, соглашения и другие правовые материалы.— 2013. Режим доступа:
http://www.un.org/m/documents/decl_conv/conventions/biodiv.shtml, свободный.
7. Красная книга Краснодарского края. Том Растения и грибы. — Краснодар: ООО «Дизайн Бюро № 1», 2007. — 489 с.
8. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы) / Министерство природных ресурсов и экологии РФ; Федеральная служба по надзору в сфере природопользования; РАН; Российское ботаническое общество; МГУ им. М. В. Ломоносова; Гл. ред.колл.: Ю. П. Трутнев и др.; Сост. Р. В. Камелин и др.— М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008.
— 885 с.
9. Кунах, В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro // Физиология растений. — М.: Наука, 1999. — № 6. — С. 919-929.
10. Новикова Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции in vitro Центрального сибирского ботанического сада //Вестник ВОГиС.— 2008, Том 12, №4. —С. 564-571.
11. Отчёт «Комплексное экологическое обследование особо охраняемых природных территорий регионального значения в целях снятия с них статуса особо охраняемой природной территории в связи с утратой ими своей ценности...» 2013 г. [Электронный ресурс]: Режим доступа: http://ewnc.org/files/oopt-kk/sochi-oopt.pdf, свободный.
12. Самарина Л.С. Сохранение in vitro исчезающего псаммофита черноморского побережья России Pancratium maritimum. / Л.С Самарина, Т.М. Коломиец, НА. Слепченко// Субтропическое и декоративное садоводство: сб. науч. тр. / ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии.— 2012. Вып. 47.— С. 172-177.
13. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтярев и др.: Под ред. B.C. Шевелухи. — М.: Высш. шк.,1998. —415 стр.
14. Тибилов А. А. Методические рекомендации по клональному микроразмножению шафрана прекрасного в культуре in vitro. — М: Россельхозакадемия, 2003, 9 с.
15. Barnicoat Н, Cripps R., Kendon J., Sarasan V. Conservation in vitro of rare and threatened ferns -case studies of biodiversity hotspot and island species/ In Vitro Cell Dev Biol-Plant, —2011. № 47. — P.37-45.
16. Coates D. J., Dixon K. W. Current perspectives in plant conservation biology./ Australian Journal
of Botany Ш55(3) Р.187—193 http://dx.doi.org/10.1071/BT07037 Published online: 18 May 2007.
17. DIVERSITAS, Mssion and Hstory. [Электронный ресурс]: Mssion and History; DIVERSHAS.— 2011. Режим доступа: http://www.diversitas-international.org/about/mission-and-history, свободный.
18. Edison S., Unnikrishnan М., Vimala B., Santha V.. Biodiversity of Tropical Tuber Crops in India. NBA Scientific Bulletin № 7, National Biodiversity Authority, Chennai, Tami INadu, India, 2006, P.60.
19. Lloyd, G., McCown B.H. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Combined Proceedings. International Plant Propagators Society, USA — 1980. № 30. —P. 421-427.
20. Marriott, P., Sarasan, V. Novel micropropagation and weaning methods for the integrated conservation of a critically endangered tree species, Medusagyne oppositifolia. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, — 2010. №46. — P. 516-523.
21. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiologia Plantarum, — 1962. № 15. —P. 473-497.
22. Reed B., Sarasan М., Kane V. Biodiversity conservation and conservation biotechnology tools // In Vitro Cell Dev Biol-Plant, — 2011. № 47. — P. 1-4.
23. Sarasan, V. Importance of in vitro technology to future conservation programmes worldwide // Kew Bulletin, — 2010. № 65, —P. 549-554.
24. Sarasan V., Kite G., Sileshi C. Applications of phytochemical and in vitro techniques for reducing over-harvesting of medicinal and pesticidal plants and generating income for the rural poor // Plant Cell Rep., —2011. №30. —P. 1163-1172.
25. Sokolov V.E., Striganova B.R, Reshetnikov Y.S. e.a. Russian National Biodiversity Conservation Programme // Biology International, — 1994. № 28. —P. 29-32
26. Van-Hoof P. Methods de culture in vitro de meristemes pour l’obtention d’ oeillets non virosses // Parasitica. — 1971. №.2. —P. 27-35
References
1. Ageeva S. E. i dr. Sohranenie bioraznoobrazija redkih i ischezajushhih vidov rastenij v Volgogradskom regional'nom Botanicheskom sadu // Vestnik BFU im. I. Kanta. — 2012. №7. — S.103-109.
2. Butenko, R.G. Biologija kletok vysshih rastenij in vitro i biotehnologii na ih osnove. — М.: FBK-PRESS, 1999. — 158 s.
3. Vetchinkina E. M. Sohranenie redkih vidov rastenij v geneticheskih kollekcijah in vitro // Vestnik BFU im. I. Kanta. —2012. №7. — S.109-118.
4. Vechemina N. A. Sohranenie biologicheskogo raznoobrazija redkih, ischezajushhih vidov, unikal'nyh form i sortov rastenij metodami biotehnologii: Dis. dokt. biol. nauk: 03.00.05 / Altajskij gos. un-t. Barnaul, 2006. 325 s.
5. Evsjukova Т. V., Kolomiec Т. M. Nekotorye aspekty sohranenija genofonda kavkazskih vidov kolokol'chikov.// Nauchnye osnovy razvitija cvetovodstva Rossii i proektirovanie sadovyh landshaftov. — M: GNU VSTISL, 2006, S. 94-97.
6. Konvencija о biologicheskom raznoobrazii [Jelektronnyj resurs]: Konvencija о biologicheskom
raznoobrazii — Konvencii i soglashenija — Deklaracii, konvencii, soglashenija i drugie pravovye materialy.— 2013. Rezhim dostupa:
http://www.un.org/ru/documents/decl_conv/conventions/biodiv.shtml, svobodnyj.
7. Krasnaja kniga Krasnodarskogo kraja. Tom Rastenij a i griby. — Krasnodar: ООО «Dizajn Bjuro № 1», 2007. —489 s.
8. Krasnaja kniga Rossijskoj Federacii (rastenija i griby) / Ministerstvo prirodnyh resursov i jekologii RF; Federal'naja sluzhba po nadzoru v sfere prirodopol'zovanija; RAN; Rossijskoe botanicheskoe
obshhestvo; MGU im. M. V. Lomonosova; Gl. red.koll.: Ju. P. Trutnev i dr.; Sost. R. V. Kamelin i dr.— M.: Tovarishhestvo nauchnyh izdanij KMK, 2008.— 885 s.
9. Kunah, V.A. Izmenchivost' rastitel'nogo genoma v processe dedifferencirovki i kallusoobrazovanija in vitro // Fiziologija rastenij. — M.: Nauka, 1999. — № 6. — S. 919-929.
10. Novikova T.I., Nabieva A.Ju., Polubojarova T.V. Sohranenie redkih i poleznyh rastenij v kollekcii in vitro Central'nogo sibirskogo botanicheskogo sada //Vestnik VOGiS.— 2008, Tom 12, № 4. —S. 564-571.
ll.Otchjot «Kompleksnoe jekologicheskoe obsledovanie osobo ohranjaemyh prirodnyh territory regional'nogo znachenija v celjah snjatija s nih statusa osobo ohranjaemoj prirodnoj territorii v svjazi s utratoj imi svoej cennosti...» 2013 g. [Jelektronnyj resurs]: Rezhim dostupa: http://ewnc.org/files/oopt-kk/sochi-oopt.pdf, svobodnyj.
12. Samarina L.S. Sohranenie in vitro ischezajushhego psammofita chemomorskogo poberezh'ja Rossii Pancratium maritimum. / L.S Samarina, T.M. Kolomiec, N.A. Slepchenko// Subtropicheskoe i dekorativnoe sadovodstvo: sb. nauch. tr. / GNU VNIICiSK Rossel'hozakademii.
— 2012. Vyp. 47 — S.172-177.
13. Sel'skohozjajstvennaja biotehnologija: Ucheb. / V.S. Sheveluha, E.A. Kalashnikova, S.V. Degtjarev i dr.: Pod red. V.S. Sheveluhi. —M.: Vyssh. shk.,1998. —415 str.
14. Tibilov A.A. Metodicheskie rekomendacii po klonal'nomu mikrorazmnozheniju shafrana prekrasnogo v kul'ture in vitro. — M: Rossel'hozakademija, 2003, 9 s.
15. Barnicoat H., Cripps R., Kendon J., Sarasan V. Conservation in vitro of rare and threatened ferns -case studies of biodiversity hotspot and island species/ In Vitro Cell Dev Biol-Plant, —2011. № 47. — P.37-45.
16. Coates D. J., Dixon K. W. Current perspectives in plant conservation biology./ Australian Journal
of Botany №55(3) P.187—193 http://dx.doi.org/10.1071/BT07037 Published online: 18 May
2007.
17. DIVERSITAS, Mission and History. [Jelektronnyj resurs]: Mission and History; DIVERSITAS.—
2011. Rezhim dostupa: http://www.diversitas-intemational.org/about/mission-and-history,
svobodnyj.
18. Edison S., Unnikrishnan M., Vimala B., Santha V.. Biodiversity of Tropical Tuber Crops in India. NBA Scientific Bulletin № 7, National Biodiversity Authority, Chennai, Tami INadu, India, 2006, P.60.
19. Lloyd, G., McCown B.H. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Combined Proceedings. International Plant Propagators Society, USA — 1980. № 30. —P. 421-427.
20. Marriott, P., Sarasan, V. Novel micropropagation and weaning methods for the integrated conservation of a critically endangered tree species, Medusagyne oppositifolia. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, — 2010. №46. — P. 516-523.
21. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiologia Plantarum, — 1962. № 15. —P. 473-497.
22. Reed B., Sarasan M., Kane V. Biodiversity conservation and conservation biotechnology tools // In Vitro Cell Dev Biol-Plant, — 2011. № 47. — P. 1-4.
23. Sarasan, V. Importance of in vitro technology to future conservation programmes worldwide // Kew Bulletin, — 2010. № 65, —P. 549-554.
24. Sarasan V., Kite G., Sileshi C. Applications of phytochemical and in vitro techniques for reducing over-harvesting of medicinal and pesticidal plants and generating income for the rural poor // Plant Cell Rep., — 2011. №30.—P. 1163-1172.
25. Sokolov V.E., Striganova B.R., Reshetnikov Y.S. e.a. Russian National Biodiversity Conservation Programme // Biology International, — 1994. № 28. — P. 29-32
26. Van-Hoof P. Methods de culture in vitro de meristemes pour l’obtention d’ oeillets non virosses //
Научный журнал КубГАУ, №94(10), 2013 года Parasitica. — 1971. №.2. —Р. 27-35
