CC BY
28
Аннотация. В статье описаны классические методы работы по депонированию национальной базовой коллекции сортов картофеля в культуре in vitro. Указаны преимущества новой схемы отбора, а также описан процесс подготовительных работ, предшествующих переводу в культуру ткани и способы депонирования базисной коллекции.
Ключевые слова: семенной картофель, меристема, экспланты, растения in vitro, клон.
Владимир Анципович,
заведующий лабораторией микроклонального размножения картофеля НПЦ НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству
■ Ж артофель - одна из важ-I Ж нейших сельскохозяйственных и продоволь-
■ ственных культур. Его I % потребляют более I % 3 млрд человек и выращивают в 150 странах. В относительно короткие сроки с единицы площади он дает больше продуктов питания, чем любая другая сельскохозяйственная культура, и способен решать проблемы не только мирового производства продуктов питания, но и биоэнергетики [1].
Из-за своих биологических особенностей картофель в наибольшей степени подвержен вирусным и вироидным заболеваниям. Мировые потери от них составляют 90 млн т, урожайность снижается на 40-50%, а утрата клубней при хранении может достигать 15-20%. Определяется это видом возбудителя, его штаммом,
степенью устойчивости сорта, условиями выращивания и погодой. Легкие формы вирусных заболеваний снижают урожай в среднем на 10-20%, тяжелые - на 70-85%, а в некоторых случаях - до 100%. Содержание крахмала в пораженных клубнях по сравнению со здоровыми обычно снижается на 0,8-4,6%. В них уменьшается количество сырого протеина и витаминов С, Bi, В2.
Одной из основ для создания корнеплодов, обладающих комплексной устойчивостью к максимально возможному числу вирусов, является мировая коллекция диких и культурных видов, сортов, селекционных клонов и гибридов картофеля Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова. Однако и сама коллекция в значительной степени подвержена вирусному вырождению. Задача сохранения и изучения генофонда для обеспечения селекционеров разнообразным исходным материалом становится трудновыполнимой из-за различных морфо-физио-логических отклонений, затрудняющих таксономическую идентификацию растений. В дальнейшем происходит явное вырождение и возникает угроза полной утраты образцов [2].
Поскольку эффективных мер борьбы с вирусами пока не найдено, основным направлением получения высококачественного семенного материала является его оздоровление в процессе микро-клонального размножения с помощью современных биотехнологических методов.
Метод культуры изолированных тканей подразумевает выращивание изолированных клеток на искусственных питательных средах (in vitro) в стерильных
условиях. В основе лежит уникальное свойство растительных клеток - тотипотентность - их способность при определенных условиях вторично дифференцироваться и под влиянием внешних условий выбирать тот или иной путь морфогенеза, в ходе которого заново возникают ткани и органы. Полученное в результате растение in vitro носит название растения-регенеранта [3].
Получение исходного материала для выращивания безвирусного семенного картофеля
Схема оздоровления сортов картофеля для перевода в культуру in vitro и создания из них базисных коллекций с последующим микроклональным размножением - это составная часть системы первичного семеноводства картофеля, включающая следующие этапы:
■ полевой отбор высокопродуктивных клонов картофеля, полностью соответствующих морфологическим показателям сорта, а также визуально здоровых от вирусных, бактериальных болезней и вирои-да веретеновидности клубней картофеля;
■ хранение клонов с последующей закладкой клубней на проращивание;
■ выделение индексов с посадкой их в кассеты на перлит для получения растений;
■ иммунно-ферментный анализ (ИФА) на листовых пробах, взятых у растений-индексов, с последующей браковкой больного материала [4, 5];
■ проведение завершающего цикла диагностики - тестирование методом высокомолекулярной полимеразной цепной
реакции на листовых пробах, здоровых после первого этапа проверки растений-индексов с последующей браковкой [5];
■ перевод здорового материала в культуру in vitro, получение исходных материнских растений (линий);
■ создание коллекций из здоровых линий сортов и поддержание их в культуре ткани [6, 7];
■ плановая диагностика коллекций новых и популярных сортов методом ИФА до этапа ускоренного микроклонального размножения;
■ ускоренное размножение новых и популярных сортов в объемах, предусмотренных схемой семеноводства;
■ производство рассады из растений in vitro на субстрате «Биона» с целью адаптации к условиям in vivo;
■ посадка в теплицы рассады для производства первого клубневого поколения и плановая диагностика материала в фазу бутонизации - цветения. Применение данной схемы позволяет получать безвирусный семенной материал картофеля (первое клубневое поколение) через 2 года от момента отбора клонов.
Выделяют принципиально различные типы клонального микроразмножения - активацию уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля) и индукцию возникновения почек или эмриои-дов de novo [8].
Успешное применение культуры верхушечной меристемы с целью элиминации вируса на декоративных растениях позволило распространить данный метод на сельскохозяйственные культуры (впервые применил французский ученый Морель
на картофеле в 1955 г.) [9]. В научном мире меристема считается наиболее надежным способом освобождения сильно зараженных сортов картофеля от вирусов.
Меристема - конус активно делящихся клеток, расположенных на кончике побегов или корней. Для оздоровления используют их шириной 0,1 мм и длиной 0,250,3 мм. Метод основан на неравномерном распределении вируса в растении, из-за чего наименьшая концентрация наблюдается в зоне апикальной меристемы. Объясняют это несколькими теориями:
■ медленное распределение вирусов в активно делящихся клетках;
■ подавление размножения вирусов высокой концентрацией ауксинов;
■ влияние компонентов питательной среды.
Успех оздоровления от вирусов зависит от размера меристемы, возбудителя, физических и химических факторов, сорта.
С другой стороны, на процент приживаемости меристем влияют длина и положение меристемы, питательная среда, сорт, препаративная техника, время года.
Питательные среды для выращивания растений из меристем и черенков
В качестве основных ингредиентов питательных сред используют макро- и микросоли, витамины, органические вещества, регуляторы роста. Их минеральный состав должен обеспечить сбалансированное и достаточное питание меристем и растений in vitro. Среда должна быть достаточно буферной, иначе при культивировании она будет подкисляться [10].
Из макросолей в качестве источников азота добавляют соли: нитрат аммония NH4NO3, кальция - Ca(NO3)2, калия - KNO3, KH2PO4, магния - MgSO4, железа - FеSO4. Из микроэлементов, необходимых для регенерации меристем в растения, используют B, Mn, Zn, I, Mo, Cu, Co.
Среди компонентов питательной среды обязательными являются регуляторы роста (ауксины, гиббереллины и цитокинины) как природного, так и синтетического характера.
В 1956 г. американские ученые Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна как правило Скуга - Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или количество первых незначительно больше вторых, то образуется каллус; если ауксины значительно превалируют, то формируются корни; если их значительно меньше, чем цитокининов, то образуются почки, побеги.
Наиболее приемлемой для культивирования меристем картофеля является среда с минеральной основой Мурасиге -Скуга (М-С).
В НПЦ НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощевод-ству в культуре in vitro для начального роста меристем применяют питательную среду М-С, разработанную в Институте картофелеводства НААН Украины, для пересадки и укоренения проростков из меристем - модификацию среды Мурасиге - Скуга Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства им. А. Г. Лорха, а для микрочеренкования - собственную
модификацию этой же среды. Каждая из них подобрана применительно к определенному этапу морфогенеза.
В отечественном НПЦ питательные среды готовят только на основе агара. Сотрудниками проводились исследования по его замене на дешевые аналоги природного происхождения - перлит и агроперлит [11], но широкого практического применения они так и не получили. Твердые питательные среды агар-агар, бакто-агар, агар Дифко, агар микробиологический, агар пищевой (ГОСТ 16280-2002) обладают бесспорным преимуществом, так как их приготовление происходит значительно быстрее, а в застывшем виде они надежно фиксируют расположение черенка.
При приготовлении среды для лучшего растворения навеску агара предварительно замачивают в небольшом количестве дистиллированной воды. Обычно используют 6-7 г агара на 1 л раствора, так как дальнейшее увеличение концентрации уплотняет среду и затрудняет поступление питательных веществ в ткани. Его вливают, помешивая, в колбу или в кастрюлю с дистиллированной водой, подогретой до 50-70 °С, а затем нагревают для получения однородного коллоидного раствора. Помимо огнеупорных колб для приготовления питательной среды можно использовать эмалированные кастрюли. Сняв с огня, в емкость с агаром добавляют предварительно приготовленный раствор, содержащий минеральные соли, витамины, сахарозу, регуляторы роста и другие составляющие. Затем среду доводят до нужного объема, доливая воду.
На рост меристем и дальнейшее микроклональное размножение растений-регенерантов влияет кислотность среды, определяющая степень доступности для растений питательных веществ. Кислые или щелочные среды препятствуют поступлению некоторых элементов, например фосфора и железа, делая их относительно нерастворимыми, ограничивая тем самым рост растений. В то же время при высокой кислотности другие элементы переходят в растворенное состояние и становятся токсичными для эксплантов. Обязательным этапом перед разливом свежеприготовленной питательной среды по пробиркам является измерение рН. Оптимальна для культуры картофеля питательная среда с кислотностью рН 5,7-5,8. При отклонениях pH необходимо довести его до оптимума путем добавления 0,1 Н KOH или 0,1 Н HCl. Таким образом, кислотность питательной среды совпадает с кислотностью почвы, на которой произрастает картофель в естественных условиях.
Горячую среду разливают по стерильным пробиркам, закрывают ватно-марлевыми пробками и ставят в металлические штативы. В таком виде ее помещают в автоклав для стерилизации при температуре 120 °С и давлении 1 атм в течение 20-25 мин.
Вычленение и культивирование меристем и эксплантов
Все работы проводятся в стерильных условиях микробиологического бокса или в ламинарных, которые находятся в специальном помещении с бактерицидными лампами. Меристему вычленяют из зеленых или этиолированных ростков клубней.
Сделать это из зеленых ростков технически проще, в них она хорошо различима и более устойчива к повреждению. Однако установлено, что эффективность оздоровления выше при использовании хрупких этиолированных ростков, так как концентрация вирусов в них ниже, а здоровая зона, свободная от вирусов, больше, чем в зеленых.
В НПЦ НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощевод-ству, согласно принятой схеме отбора только здоровых клонов, для перевода в культуру in vitro используют апикальный участок ростка, так называемый эксплант, состоящий из паренхимы, проводящей ткани и камбия, размеры которого колеблются от 1,5 до 3,0 мм. Такая работа значительно облегчает процесс вычленения и повышает приживаемость. Вычленение и культивирование эксплантов проводят так же, как и меристем.
Ростки, снятые с поверхности клубня, частично освобождают от покровных листочков, а оставшуюся часть подвергают стерилизации. Необходимое условие для этого - обеспечение достаточной степени чистоты объекта и сохранность его жизнеспособности. В качестве стерилизующих растворов используют спирт, растворы гипохлорита кальция, гипохлорита натрия в концентрациях 1-6%, раствор диацида 0,1% или раствора сулемы 0,1%. В НПЦ применяют 30%-й раствор «Белизна». Длительность стерилизации 3-4 мин, после чего проводят постстерилизацию, то есть тщательное отмывание ростка от стерилизующего раствора. Как правило, промывают 3-4 раза в автоклавированой дистиллированной воде комнатной
температуры. Дезинфицированные ростки помещают на поверхность чашки Петри и под микроскопом, поочередно используя отдельные инструменты для удаления лишних покровных листочков, выделяют эксплант. Инструменты стерилизуют после каждой операции, погружая в спирт, с последующим обжигом. Отделенный эксплант на кончике ланцета переносят в пробирку с питательной средой, стараясь не углублять в среду, иначе подавляется его способность к росту. Очень важно аккуратно и точно провести вычленение и быстро поместить выделенный кусочек ткани на питательную среду, обеспечивая плотное прилегание среза. Пробирку закрывают ват-но-марлевой пробкой над пламенем спиртовки и подписывают (указыают название сорта и порядковый номер, аналогичный номеру клона, который использовали для вычленения экспланта).
Штативы с пробирками переносят в культуральную комнату с постоянным световым и температурным режимом на специальные стеллажи, где проходит рост и развитие экспланта в микрорастение. Оптимальная температура для регенерации составляет 2325 °С, влажность - не менее 70%, интенсивность света - 4 тыс. люкс, при 16-часовом фотопериоде.
Как правило, в течение месяца после высадки на питательную среду наблюдают увеличение размеров и интенсивное позеленение экспланта. Затем его рост может приостановиться вследствие изменения концентрации компонентов и рН среды, а также ее подсыхания. У основания проростка может образоваться каллус-ная ткань, лишенная проводящей системы, которая препятствует
дальнейшему развитию. Поэтому по мере роста регенеранты необходимо периодически пересаживать на свежие питательные среды, которые содержат все необходимые компоненты для стимуляции ризогенеза и роста стебля.
Время от посадки меристем или экспланта до регенерации растения с 5-6 листочками составляет 30-45 дней, но в зависимости от сорта некоторые меристемы или экспланты могут оставаться живыми и регенерировать в растения в течение 2-8 месяцев.
Полученное растение с 5-6 листочками черенкуют и черенки высаживают в пробирки на питательную среду для микрочеренкования. Исходный образец с несколькими листочками (от 4-5 до 7-8, в зависимости от морфо-типа конкретного сорта) извлекают из пробирки и разрезают на чашке Петри на черенки, включающие часть стебля с одним листочком. Нижняя часть под листочком должна быть значительно длиннее верхней для лучшей фиксации. Черенок пинцетом погружают в пробирку на глубину междоузлия. Количество среды, достаточной для регенерации черенка в растение, должно быть в пределах 20% от общего объема пробирки. Растения из черенков, как и вычлененные экспланты, выращивают в специально оборудованных для этих целей помещениях (культу-ральных комнатах) с постоянным световым и влаго-темпера-турным режимами. В случае, если необходимо размножить сорт в кратчайшие сроки, в пробирке оставляют базальную часть стебля с корневой системой для повторного отращивания. Отросток делят на 2-3 черенка, причем каждый должен содержать несколько
междоузлий для лучшей адаптации и роста на питательной среде. Такую практику рекомендуется применять в экстренных случаях, так как растение, выросшее повторно на остатках среды, будет ослабленным. После помещения черенков в пробирки со свежей питательной средой необходимого объема развитие и рост выравнивается. Метод ускоренного размножения с помощью микрочеренкования полностью исключает заражение и позволяет за короткий срок получить большие объемы, так как последующие деления можно проводить через каждые 3-4 недели.
Перевод в культуру ткани сортов картофеля и получение в процессе регенерации исходных материнских растений или линий - довольно трудоемкий процесс. Он сопровождается строгим контролем на наличие скрытой вирусной инфекции произведенного материала и служит
одной цели - созданию коллекций in vitro по каждому включенному в процесс сорту, которые необходимы для микроклонального производства.
Базисная коллекция картофеля (для семеноводства) находится в специальном помещении с постоянной температурой 18-20 °С, освещенностью 3000-4000 лк при 16-часовом световом фотопериоде. Сорта, не востребованные рынком, содержатся отдельно и используются для научных исследований.
Помимо новых линий, ежегодно появляются вновь созданные селекционерами института сорта. Они идут на дальнейшее микро-клональное производство и популяризацию в республике, а также для отдела семеноводства НПЦ НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству. Базисная коллекция состоит из 61 сорта и содержит 501 линию, с 2018 г. признана национальным достоянием Республики Беларусь.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Амелюшкина Т. А., Семешкина, П. С. Защита и карантин растений. - М.,2011. №3
2. Рогозина Е. В Дикие клубненосные виды рода Solanum L. и перспективы их использования в селекции картофеля на устойчивость к патогенам: а вторефер. дис. на соискание учёной степени д-ра биол. наук. - СПб., 2012.
3. Широков А. И. Основы биотехнологии растений: учеб.-метод. пособие / А. И. Широков, Л. А. Крюков. - Н. Новгород, 2012.
4. Radkovich E. V. Selertion potato clones free of phytopatogens by Elisa and PCR methods for Introduction to the culture In vitro / Е. V. Radkovich, G. N. Guscha, I. V. Filonova, E. A. Gernak, A. I. Adamova // Bioresourcеs and viruses. Abstracts. VII international conferency - Kyiv. 2013. Р. 85.
5. Инструкция по выявлению вирусной и бактериальной инфекции в скрытой форме в картофеле методами иммуноферментного анализа, иммунофлуоресцентного анализа и полимеразной цепной реакции / Главная государственная инспекция по семеноводству, карантину и защите растений. - Минск, 2014.
6. Адамова А. И. Усовершенствование системы отбора исходного материала для сортообновления базисной коллекции сортов картофеля в условиях in vitro / А. И. Адамова, Е. В. Радкович, Г. Н. Гуща // Картофелеводство: сб. науч. тр. - Минск, 2011. Т. 19. С. 190-199.
7. Радкович Е. В. Применение разных схем отбора свободного от фитопатогенов родоначального материала картофеля / Е. В. Радкович, С. А. Турко, А. И. Адамова, Г. Н. Гуща // Земледелие и защита растений. 2013. №3. С. 64-67.
8. Бабикова А. В. Растение как объект биотехнологии / А. В. Бабикова, Т. Ю. Горпенченко, Ю. Н. Журавлев // Комаровские чтения. 2007. Вып. LV. С. 184-211.
9. Использование тканевых культур в теоретической и практической селекции картофеля / Б. Петт [и др.]; Академия сельскохозяйственных наук ГДР. - Берлин, 1986.
10. Безвирусное семеноводство картофеля (рекомендации) / Л. Н. Трофимец и [и др.]; сост. Л. Н. Трофимец. - М., 1990.
11. Коновалова Г. И. Оптимизация питательных сред для клонального микроразмножения картофеля в культуре in vitro // Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков: М-лы науч.-практ. конф. - Минск, 2005. С. 20-26.
12. Винклер Г. Н. Применение черенкования при выращивании безвирусных растений картофеля методом культуры меристемы / Г. Н. Винклер, Р. Г. Бутенко // Физиология растений: науч. тр. Т. 17, №4. - М.,1970. С. 851-853.
Г-л! S//» http://innosfera.by/2019/06/potato
