CC BY
149
Владимир Падутов,
заведующий лабораторией генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси, член-корреспондент
В основе лесной биотехнологии лежат, с одной стороны, достижения академической науки -физико-химической биологии, биохимии и физиологии растений, генетики, микробиологии, а с другой - наработки лесной отраслевой науки [1]. Главная цель - обеспечение плантационного лесоразведения необходимым объемом селекционного посадочного материала. Традиционные методы создания новых форм лесных видов имеют существенный недостаток - низкую эффективность, несовместимую с потребностями плантационного лесоводства. Деревья имеют длительный жизненный цикл, что усложняет и задерживает процесс селекции, требуется много десятилетий для создания высокопродуктивных линий с ценными признаками, которые стабильно наследуются. Чтобы ускорить этот процесс, используются различные методы гибридизации для получения новых форм растений. Однако их главный недостаток заключается в том, что в первом поколении наблюдается дефицит продукции (отсутствие возможности
количеством получаемых семян обеспечить насыщаемость рынка), а во втором - расщепление признаков. Многие виды древесных растений имеют низкий коэффициент вегетативного размножения, что затрудняет или делает невозможным получение посадочного материала из ценных гибридов в промышленном масштабе вегетативным способом.
Основными задачами биотехнологии в лесном хозяйстве, как и в области сельского, являются:
■ ускорение селекционного процесса (на этапах отбора, скрещивания, гибридологического анализа) и повышение его эффективности;
■ создание новых генетически измененных форм методом генной (генетической) инженерии, включая трансгенез и генетическое редактирование;
■ массовое получение лесного посадочного материала хозяйственно ценных форм древесных видов, отличающихся повышенной продуктивностью по определенным признакам, методом клонального микроразмножения (микроклональ-ного размножения).
Аннотация. Описаны основные этапы биотехнологических работ в лесном хозяйстве. Указаны цель и задачи лесной биотехнологии. Проведено сравнение с сельскохозяйственной биотехнологией, показаны их сходство и различия. Ключевые слова: биотехнология, лесные древесные виды, культуры in vitro.
Внедрение достижений в области биотехнологии в лесное хозяйство стало возможным благодаря разработке методов получения культур in vitro селекционных форм древесных растений с последующим клональным размножением. Это позволяет не только производить любое необходимое количество посадочного материала, но и делать его однотипным, что помогает повысить продуктивность специализированных плантаций [2, 3].
Возможности биотехнологических методов в процессе селекции лесных культур могут быть реализованы различными способами благодаря соматической гибридизации, сомаклональной изменчивости, индуцированному
мутагенезу или генной инженерии. Особый интерес как инновационные направления представляют соматическая гибридизация (метод создания гибридов неполовым путем в результате слияния изолированных протопластов, полученных из соматических, а не половых, клеток), клеточная селекция (когда за счет индуцированного мутагенеза получается конгломерат клеток с различающимися геномами, при этом каждая клетка в дальнейшем культивируется отдельно до образования полноценного микрорастения) и генная инженерия, поскольку они позволяют быстро получать новые формы древесных растений, часто с комбинациями хозяйственно-ценных признаков нескрещивающихся между собой видов. Помимо закладки плантаций из высокопродуктивных клонов еще одной важной причиной создания культур in vitro лесных насаждений является необходимость сохранения ценных видов или форм в случае угрозы их исчезновения.
Особенность лесной биотехнологии заключается в том, что говорить о ценности какой-либо формы древесного вида можно только после 30-40-летнего возраста. Однако при введении в культуру клеток и тканей (культуру in vitro) деревьев, которые достигли
физиологической зрелости, возникают сложно решаемые проблемы. Использование семян и молодых сеянцев в качестве источника экс-плантов (группы клеток, отделенных от материнского организма) облегчает процесс клонального микроразмножения, однако в этом случае невозможно заранее судить о ценности клона. Другая трудность связана с физиологическим старением культуры in vitro, что в конечном итоге приводит к ее потере [4]. Существует несколько подходов к решению этих вопросов: использование ювениль-ных частей растения (стволовых и корневых побегов); омоложение с помощью прививок [4, 5]; длительное поддержание ювениль-ного возраста путем криоконсер-вации, в то время как в полевых условиях проводится селекционная оценка исходного материала, после которой ценные генотипы могут быть массово размножены [6]; использование таких факторов, как осмотический, температурный или гормональный стресс, которые стимулируют микроразмножение [7].
Технологии размножения в культурах in vitro подразделяются на 3 большие группы: размножение пазушными и верхушечными побегами (прямой морфогенез), непрямой морфогенез и соматический эмбриогенез (рис. 1).
Рис. 1. Технологии размножения в культурах in vitro:
A. Прямой морфогенез Б. Непрямой морфогенез
B. Соматический эмбриогенез
Первая группа основана на размножении с использованием меристем, уже заложенных в самом растении, тогда как непрямой морфогенез и соматический эмбриогенез основаны на формировании органов или эмбриона вновь (de novo).
Получение растений посредством прямого морфогенеза аналогично вегетативному размножению путем укоренения черенков, при котором побеги отделяют от взрослого дерева, и они регенерируют корни в специально подобранных условиях. Различия заключаются в том, что в случае прямого морфогенеза весь процесс протекает в асептических условиях, а последующие манипуляции в условиях in vitro направлены на стимулирование развития пазушных и верхушечных побегов, которые можно выделить и укоренить для получения посадочного материала или же высадить для дальнейшей мультипликации. Таким образом, в отличие от традиционных методов размножения, которое ограничивается укоренением одного черенка, прямой морфогенез позволяет из одного побега получить большое количество растений, а с учетом возможности длительного поддержания существования культур - практически неограниченное.
Основное преимущество технологий, связанных со стимуляцией уже существующих меристем, состоит в том, что растения в культуре in vitro развиваются из уже заложенных у родительского дерева почек или образовательной ткани. В этом случае проявление сомаклональной изменчивости (спонтанного мутагенеза) маловероятно, и генотип микрорастений будет соответствовать
материнскому. Следует отметить, что описанный метод размножения наиболее эффективен для создания культуры in vitro на основе материала средне- или старовозрастных деревьев [8].
В то время как технология прямого морфогенеза является основной для in vitro лиственных видов, для хвойных растений существует только несколько примеров ее успешного применения. У сосен это связано с трудностью стимулирования развития пазушных почек, находящихся у основания мутовки [9]. Редкое исключение -Pinus radiata, для которой была разработана технология размножения пазушными побегами, позволившая получить и высадить в полевые условия тысячи микро-клонально размноженных саженцев с середины 80-х гг. прошлого столетия [4]. Один из недостатков технологии прямого морфогенеза - необходимость оптимизации большого количества этапов технологического процесса (инициация, удлинение и отделение побегов, укоренение и адаптация к почвенным условиям и др.) и в большинстве случаев невозможность их автоматизации.
Непрямой морфогенез - это получение de novo органов растений (почек, побегов и корней) из выделенных тканей или каллуса. Образовавшиеся в этом случае адвентивные почки, как и в случае метода пазушных побегов, удлиняются в побеги, которые изолируются и укореняются по отдельности.
С помощью этого типа регенерации можно получить большее количество растений за один и тот же период времени. Однако данный метод очень трудоемкий и длительный. Следует отметить, что при непрямом морфогенезе,
особенно при наличии каллус-ной стадии, вероятность сомаклональной изменчивости у регенерируемых растений может заметно возрасти. Само это явление вызывает неоднозначное отношение. С одной стороны, сомакло-нальная изменчивость - интересное и перспективное направление в селекции, поскольку расширяет базу для отбора хозяйственно ценных генотипов и создания сортов. С другой - для сохранения и промышленного использования специальных клонов сома-клональная изменчивость, несомненно, негативный процесс, так как посадочный материал перестает быть генетически однотипным. В любом случае установление данного показателя представляет собой важную составную часть биотехнологии. Прежде всего, оно основано на достоверных различиях в ПЦР-спектрах исследуемых образцов. При этом основным типом изменений выступает де-летирование (удаление) той или иной фракции амплифицируемо-го продукта. Однако следует отметить, что большинство локусов образцов с сомаклональной изменчивостью идентичны с генотипом родительского растения, что иногда требует больших временных затрат на проведение такого теста на генетическую однотипность. Эту проблему легко решает технология полногеномного секвенирования, однако при этом возникают новые - значительное увеличение стоимости анализа и наличие соответствующей приборной базы.
Соматический эмбриогенез -это образование структур de novo, сходных с зиготическими зародышами (эмбрионами), из организованных тканей или каллусов. Они имеют биполярную структуру
(обладают корневым и стеблевым полюсами) и не имеют сосудистой связи с исходной тканью, также могут быть получены прямым или непрямым эмбриогенезом. При первом эмбриоиды образуются в основном за счет размножения экспланта - зиготического зародыша [10], при втором - из эмбри-огенной каллусной ткани.
Соматический эмбриогенез можно считать очень перспективной технологией для массового производства микроклонально размноженных саженцев с целью создания лесных культур [11]. Преимуществом этого метода является то, что процесс может быть относительно легко автоматизирован, и это, во-первых, снижает его стоимость, во-вторых, устраняет все ограничения на ежегодное обеспечение лесовосстанов-ления любым количеством посадочного материала для видов, характеризующихся периодичностью семе- или плодоношения. К тому же соматические эмбрионы, подобно зиготическим зародышам, имеют зачаточные корень, побег и листья. Однако есть и недостатки, основной из которых - формирование относительно небольшого процента эмбрионов в полноценные растения [12]. Следует также отметить, что часто в качестве источника эксплантов используются семена или сеянцы, потенциал которых с лесохозяй-ственной точки зрения еще не реализован и, следовательно, не может быть оценен. В этом случае их сложно считать селекционным материалом, поскольку известны признаки только одного родительского организма - материнского.
Важным моментом создания и поддержания коллекции in vitro, особенно в случае двух последних методов, является генетическое
соответствие клонального материала исходным растениям. Кроме определения генетической однотипности молекулярная паспортизация (дактилоскопия) образцов проводится также с целью предотвращения ошибок при сборе экспериментального материала эксплантов, введении в культуру или субкультивировании (неправильное обозначение клонов, замещение другими клонами, утрата идентификационных номеров и др.). Помимо этого генетическая паспортизация также позволяет решать ряд дополнительных вопросов, связанных с защитой прав собственности на селекционные и биотехнологические достижения, сохранностью и продажей сортов, контролем безопасности растительного материала и т.д.
В целом лесная биотехнология очень схожа с сельскохозяйственной, однако между ними существуют различия. Так, в лесной биотехнологии методы, направленные на получение сортов путем гибридизации (слияние протопластов, спасение зародышей гибридных семян и др.), используются относительно редко. Это связано с тем, что для большинства лесных древесных растений большую сложность составляет оценка основной характеристики регенерантов - их продуктивности. Ее не рекомендуется оценивать до 30-40 лет в связи с нелинейной зависимостью запаса древесины от возраста растения.
Другое отличие состоит в том, что в сельском хозяйстве методы биотехнологии применяются в основном для размножения растений определенного сорта. При этом большинство представлено генетически близкими особями, дающими однородный семенной
материал, устойчиво наследуя все признаки, полученные при селекции. По этой причине в качестве исходного материала для получения микроклональных культур можно использовать исключительно ювенильные ткани, которые относительно легко вводятся in vitro.
Поскольку в лесном хозяйстве практически отсутствуют сорта, за исключением нескольких модельных лесных видов, то работы по размножению целесообразно проводить для отдельных наиболее ценных растений, которые были отобраны в зрелом состоянии по фенотипическим признакам (рис. 2) в возрасте около 40 лет и старше (чаще всего 80-100 лет). Физиологические особенности тканей, получаемых от таких организмов, создают ряд трудностей, которые не встречаются или не имеют особого значения в биотехнологии сельхозкультур.
При работе с древесными растениями можно использовать ювенильную ткань, однако в лесной биотехнологии, по сравнению с сельскохозяйственной, подобный подход имеет несколько иные цели. В этом случае биотехнологические методы используются для сохранения генофонда какого-либо ценного или уникального древостоя (когда важно иметь не какой-то один определенный генотип, а максимально возможное количество разнообразных), увеличения количества растений, полученных в ограниченном количестве в случае проведения контролируемых скрещиваний, самоопыления или по другим причинам. Например, наличие многолетней цикличности в плодоношении характерно для ряда лесных древесных видов (дуб че-решчатый). Как правило, в таких
случаях период между двумя семенными годами, когда есть большой урожай семян или плодов, составляет 2-5 лет. Учитывая, что желуди теряют всхожесть после
Рис. 2. Отбор экспериментального материала для лесной биотехнологии
нескольких лет хранения, возникает необходимость иметь источник посадочного материала, не связанный с периодичностью плодоношения.
Для отработки методов с конкретным древесным видом используют в качестве модели юве-нильные растения. Однако следует отметить, что при работе с ними каждый из клонов будет отличаться по генотипу и, следовательно, по-разному реагировать на определенные условия культивирования.
Первый этап работы с культурами тканей включает не только выбор растения-донора, но также изолирование и стерилизацию
экспланта, создание условий для его роста на питательной среде. На этом этапе необходимо получить культуру, свободную от са-протрофных или патогенных микроорганизмов, добиться выживания экспланта и устойчивого образования и роста новых побегов in vitro. Успех этого этапа зависит от большого количества факторов - генотипа и состояния родительского растения, особенностей тканей и органов, способа создания стерильной культуры, условий культивирования.
Работа с материалом многолетних по возрасту деревьев приурочена ко времени года и связана с особенностями их жизненного цикла. Введение в культуру большинства древесных видов умеренного пояса облегчается при взятии материала во время периода покоя или сразу после его окончания. При этом в холодное время года растительный экс-плант в меньшей степени загрязнен микрофлорой, что упрощает процедуру его поверхностной стерилизации.
При работе с лесными древесными видами существуют также отличия, связанные с методикой получения асептических культур. В дополнение к поверхностной стерилизации в биотехнологии сельскохозяйственных растений применяется ряд методов для освобождения меристематических культур от внутренних, в том числе вирусных, инфекций. Эти методы основаны на использовании особых приемов культивирования (апексов меристем, термо- и химиотерапии антибактериальными и противовирусными соединениями). Методики, связанные с освобождением растительных тканей от вирусов, широко используемые в сельскохозяйственной
биотехнологии, не прижились в лесной, так как получение безвирусного посадочного материала не актуально для лесного хозяйства. Эти различия связаны с тем, что наиболее важной целью при работе с окультуренными растениями является повышение их продуктивности на протяжении одного вегетационного периода или нескольких первых лет после посадки в полевые условия. Поскольку названные промежутки времени относительно невелики и повторное заражение растений вирусными инфекциями происходит постепенно, то применение оздоровленного посадочного материала будет характеризоваться высокой экономической эффективностью в течение нескольких лет. В лесном хозяйстве оборот рубки составляет 60-80 лет. Естественно, за столь длительный срок предотвратить повторное заражение древесных растений невозможно никакими мерами. Таким образом, оздоровление посадочного материала лесообра-зующих видов - второстепенная
Рис. 3. Условия произрастания лесных культур
задача, выполняемая пассивно путем уничтожения зараженных особей при введении в культуру растений с наибольшей продуктивностью и устойчивостью к стрессам окружающей среды, включая патогенные микроорганизмы. В то же время разработка методов поверхностной стерилизации эксплантов, взятых из деревьев среднего и старшего возраста, имеет особое значение.
Второй важный этап - это размножение, то есть субкультивирование асептических культур с постоянным увеличением количества микрорастений. Основная его цель - поддержание перевиваемых асептических культур и наработка растений для дальнейшей их адаптации к почвенным нестерильным условиям. Мультипликация в микроклональном размножении сходна для большинства культивируемых in vitro растений разных систематических групп, поэтому на данном этапе обычно используются относительно однотипные условия и схемы культивирования. Во время инициации физиологические процессы растений адаптируются к условиям in vitro и в некоторой степени происходит отбор вариантов микрорастений, способных
устойчиво существовать в асептической культуре.
В ходе микроклонального размножения древесных видов иногда возникает необходимость замедлить развитие некоторых образцов. Холодовое хранение при низких положительных температурах важно по двум основным причинам. Во-первых, работа с культурами тканей старовозрастных деревьев имеет специфические особенности, приводящие к большой продолжительности процесса инициации асептической культуры, которую в свою очередь необходимо сохранять в течение длительного времени. Во-вторых, в процессе промышленного производства посадочного материала микроклональ-ные растения необходимо накапливать к началу полевого сезона для создания лесных культур в весенние месяцы, то есть общая посадка растений производится одновременно и в больших объемах, при этом их физиологическое состояние и размеры должны быть сходными между собой.
Адаптация растений является конечной стадией микроклонального размножения. Этот период (ex vitro) представляет собой время, за которое регенеранты, выращенные in vitro, должны физиологически перестроиться для роста в естественных условиях. За время приспособления у микрорастений происходит смена типа питания с миксотрофного (вследствие наличия углеводов в питательных средах) на характерный для большинства растительных организмов автотрофный, повышается интенсивность фотосинтеза, нормализуется водный обмен. Глубокие физиологические изменения в организме растения могут приводить к его гибели при
неподходящих режимах выращивания, что снижает эффективность всего процесса микрокло-нального размножения.
При работе с лесными древесными видами адаптация к почвенным условиям имеет свои особенности. В то время как для микро-клональных растений плодовых культур в полевых условиях выполняются агротехнические работы (подготовка почвы, внесение удобрений, обработка пестицидами и др.), в лесном хозяйстве все названное сведено к минимуму. Лесные культуры из саженцев создаются чаще всего на бедных подзолистых почвах без применения удобрений, уход за лесопосадками сводится в основном к их дополнению при низком уровне сохранности и удалению нежелательной растительности (рис. 3). Таким образом, задача адаптации состоит в том, чтобы подготовить саженцы к экстремальным после in vitro условиям путем получения растений с хорошо развитыми подземной и надземной частями.
Получение качественного посадочного материала лесных древесных видов требует их доращи-вания в условиях открытого или закрытого грунта в лесных питомниках (рис. 4), поскольку лесные культуры, созданные непосредственно из лабораторно выращенных саженцев, не прошедших определенного закаливания, имеют низкую степень сохранности.
Отличия лесной и сельскохозяйственной биотехнологии (такие как длительное культивирование, использование эксплантов старовозрастных деревьев и др.) требуют особого внимания к эффективным методам контроля и оценки состояния культур in vitro. К основным критериям анализа ми-кроклональных растений, кроме
оценки однотипности культивируемого клона, относится фитопа-тологический мониторинг. Прежде всего это связано с потенциальной угрозой потери коллекции хозяйственно ценных генотипов, исходные деревья которых могут уже не сохраниться в естественных условиях. Принимая во внимание тот факт, что плюсовые и элитные деревья являются, как правило, старовозрастными и получить для них асептические культуры затруднительно, микроклональные растения данных деревьев представляют собой особую биологическую и селекционную ценность. Проведение их фитопатологического анализа целесообразно как при создании первичных асептических культур (оценка эффективности стерилизации эксплантов), так и на следующих стадиях для диагностики инфекции в маточной и рабочей коллекциях (с целью предотвращения заражения фитопатогена-ми в ходе субкультивирования). Особое значение для культур in vitro имеет диагностика трудно культивируемых, некультивиру-емых и персистирующих форм
микроорганизмов, включая эн-дофитные грибы и бактерии. Они могут долгое время существовать в латентном состоянии и распространяться с размножаемым материалом, и в дальнейшем активизировать свои патогенетические свойства, что приведет к развитию инфекции и гибели коллекции.
Наиболее эффективным способом оценки и степени однотипности клона и уровня заражения фи-топатогенами, является использование молекулярно-генетических технологий. Их преимущества связаны с возможностью проведения анализа вне зависимости от типа и возраста ткани, высокой сохранностью образцов ДНК в течение длительного времени, отсутствием ограничений в числе генетических маркеров, высокой чувствительностью и воспроизводимостью методов, быстротой выполнения анализов и относительной дешевизной. Кроме того, использование автоматизированных и роботизированных процессов снижает влияние человеческого фактора и субъективизма в интерпретации результатов исследований..
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Концевая И. И., Падутов В. Е., Шестибратов К. А. Перспективы использования биотехнологии в лесном хозяйстве // Лесное и охотничье хозяйство. 2007. №7. С. 26-28.
2. Jones O. P., Welander M.,Waller B. J. et al. Micropropagation of adult birch trees: production and field performance // Tree Physiology. 1996. Vol. 16. P. 521-525.
3. Frampton L.J., Amerson H. V., Leach G. N. Tissue culture method affects ex vitro growth and development of loblolly pine // New Forests. 1998. Vol. 16. P. 125-138.
4. Cell and Tissue culture in forestry / ed. by Bonga J. M., Durzan D. J. - Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, the Netherlands, 1987. Vol. 3.
5. Han K.H., Shin D. I., KeathleyD. E. Tissue culture responses of explants taken from branch sources with different degrees of juvenility in mature black locust (Robinia pseudoacacia) trees // Tree Physiology. 1997. Vol. 17. P. 671-675.
6. Panis B., Lambardi M. Status of cryopreservation technologies in plants (crops and forest trees) // The role of biotechnology. - Villa Gualino, Turin, Italy 5-7 March, 2005. - Mode of access: http://www.fao.org/biotech/docs/panis.pdf. - Data of access: 15.07.2010.
7. Aderkas P. von, Bonga J. M. Influencing micropropagation and somatic embryogenesis in mature trees by manipulation of phase change, stress and culture environment // Tree Physiol. 2000. Vol. 20. P. 921-928.
8. Thorpe T. A., Harry I. S., Kumar P. P. Application of micro-propagation to forestry // Micropropagation, Technology and Application / ed. by Deberg P. C., Zimmerman R. H. - Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1991. P. 311-336.
9. Boulay M. In vitro propagation oftree species // Plant Tissue and Cell Culture / ed. by Green C. E., Somers D. A., Hackett W. P. et al. - New York, 1987. P. 367-382.
10. Sharp W. R., Sondahl M. R., Caldas L. S. et al. The physiology of in vitro asexual embryogenesis // Horticultural Reviews, vol. 2/ edited by Janick J. - AVI Publishing Co., Westport, CT, 1980. P. 268-310.
11. Gupta P. K., Timmis R., Mascarenhas A. F. Field performance of micropropagated forestry species // In Vitro Cell Dev. Biol. 1991. Vol. 27. P. 159-164.
12. Webster F. B., Roberts D. R., McInnis S.M. et al. Propagation of interior spruce by somatic embryogenesis // Canadian Journal of Forest Research. 1990. Vol. 20. P. 1759-1765.
rjJSE^ http://innosfera.by/2019/06/biotechnology
