CC BY
129
Графики зависимости скорости сдвига от напряжения сдвига представлены на рис. 1 (нумерация кривых соответствует образцам).
Анализируя значения индексов структурирования, установили, что у образца с массовыми долями стабилизатора 1,5%, жира 5% и СОМО 9% тиксотропные свойства выражены наиболее четко.
V,ф' '..паход .'-.•г’":-. - НПО1 ►»> ’.-‘П
Й«г:ра»-Єіії*1 ЬГ_И.т.. . і
Рис. 1
І. >
га
г.ч~ :
яго .і. .
. X* І ш< I ..■■ .
::Д:. .л.::*?. . • ►
.........сММгп| і$»ці,4Їл: ■
121X»,------
• ’ квоов
£ ыя&1% с * \
• | <Г*05 * V *4
: «к*.
еЗі ' ***&■ - = у
------»- . И-.- -
Рис. 2
: :::
г " ч • // 'л к С •-*. . V.1 ■ г 1г і ■ ■ ■ ■
Еще одной важной реологической характеристикой структурированных продуктов является функциональ-
ная зависимость между скоростью сдвига и вязкостью. Графики этих функций представлены на рис. 2.
Органолептические показатели (вкус, запах, внешний вид и консистенция ) входят в число показателей качества продукта, определяющих его приемлемость у потребителя. Так, увеличение доли стабилизатора выше рационального значения придает продукту мучнистую консистенцию, в некоторых образцах наблюдалось расслоение структуры.
Применение методов математического моделирования в настоящей работе позволило существенно сократить время ее проведения, свести к минимуму влияние случайных погрешностей на конечные результаты. Построенное семейство графиков, описываемое уравнением, позволяет разрабатывать оптимальные рецептуры, основываясь не только на эмпирическом, опыте специалистов, но и на полученных конкретных результатах исследований. ■■■■; '■
Совокупность примененных методов математического моделирования представляет собой эффективный способ формализации процесса структурообразо-вания как в термизированном йогуртном продукте, так и в других молочных продуктах, содержащих стабили-зирующие системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шевченко А.Г., Дунченко Н.И., Леонова Е.Н., Токаев Э.С. Влияние стабилизирующих систем на струкгуросбразование молочных десертов // Молочная пром-сть. - 1997. - № 8.
2. Кафаров В.В., Глебов М,Б. Математическое моделирование основных процессов химических производств: Учеб. пособие для вузов. -М.: Высш. школа, 1991.
3. Дьяконов В. МАТЬАВ: Учебный курс. - СПб; Питер, 2001.
Поступила 28.03.02 г. ~'1-: ; к-*'
577.15.07:664.002
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНАЗ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ПИЩЕВОЙ ТЕХНОЛОГИИ
В.Г. ЛОБАНОВ, М.В. КСЕІП
Кубанский государственный технологический университет
Проблема получения высокоактивных препаратов протеиназ актуальна для многих отраслей пищевой промышленности. В связи с этим постоянное внимание уделяется совершенствованию методов выделения
ферментов и оценке их активности. При извлечении ферментов из растительных, животных или микробных клеток общее требование - они должны быть переведены в водные растворы. Сухие ткани размалывают до порошкообразного состояния, влажные - тщательно измельчают или гомогенизируют; микробные клетки разрушают размалыванием с абразивами, ультразву-
№2-3,2002
яз КОСТЬЮ. .2. . iax, внеш-газателей лемость у атора вы-у мучни-наблюда-
(елирова-но сокра-' влияние гаты. По-руравне-рецепту-м опыте «резуль-
:матичс-|фектив-юбразо-'кте, так табили-
I., Тока-
)азование
юделиро-.пособие
с Питер,
>64.002
(3,
:чении 1Кроб-.передают
‘ельно
летки
эазву-
ком или подвергая лизису. Измельченный материал затем обрабатывают водой или буферными растворами, нерастворимый осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием. Чтобы облегчить фильтрование неочищенных ферментных экстрактов, применяют диатомовую воду [1-3]. ‘
Главное направление исследований - создание новых или совершенствование старых методов выделения и очистки протеолитических ферментов, а также разработка методов, позволяющих быстро и точно определять активность получаемых ферментов [4-8].
В процессе хранения ферментных препаратов может потребоваться присутствие стабилизаторов для предотвращения микробного заражения или потери ферментативной активности [1]. Предложен метод стабилизации протеолитической активности сырого па-паина в процессе его высушивания и хранения. С этой целью в образцы фермента добавляли 1% тетратионата Na, защитную активность которого сравнивали с защитной активностью метабисульфита Na при высушивании латекса папайи. Обнаружено, что в образцах с тетратионатом Na протеолитическая активность па-паина снижалась на 20%, а в образцах с метабисульфитом Na потери активности достигали 45% [9].
С целью повышения активности протеолитических ферментов нередко проводится их иммобилизация на различных носителях. Была проведена иммобилизация трипсина, папаина и термолизина на пористом стекле с контрольным размером пор и связыванием с глутаро-вым альдегидом и BrCN соответственно. Иммобилизованные препараты протеаз обладали высокой стабильностью при хранении [10].
Предложены методики определения активности протеиназ с использованием в качестве субстрата йодированного сывороточного бычьего альбумина [11] и денатурированного гемоглобина, позволившие сократить продолжительность инкубации.
Разработан новый быстрый, чувствительный и простой биолюминисцентный метод определения бактериальных протеаз в молочных продуктах. Он основан на реакции биолюминисценции, модифицированной выдерживанием протеаз из психотрофных микроорганизмов в присутствии люциферазы. Белок люцифера-зы расщепляется любой протеазой. Активность про-теазы измеряют по снижению светоотдачи после добавления остальных компонентов реакции - люцефи-рина и АТФ [12].
При исследовании влияния внешнего постоянного и пульсирующего магнитного поля на протеолитиче-скую активность пепсина и ренина (сычужного фермента) было установлено, что протеолитическая активность ферментов увеличивается [13].
Метод анализа каталитически активных протеиназ, который основан на последовательном взаимодействии фермента с ингибитором, иммобилизованным на полистироле, и с антителами, мечеными высокоактивным ферментом, предложен [14]. Выбраны оптимальные условия анализа щелочных протеаз из Bacillus
subtilis с использованием пероксидазы в качестве метки и двух протеиновых серинпротеазных ингибиторов, выделенных из утиных яиц и кукурузных семян. Метод позволяет определить активность протеиназ в течение 1,5 ч при концентрациях до 1 нг/мл со средними погрешностями менее 5%.
Был проведен сравнительный анализ специфичности гидролиза 2%-го раствора казеина коровьего молока протеазой (А) из Bacillus subtilis и бромелином (В) из ананаса. При гидролизе казеинов этими ферментами получали гидролизаты с различным пептидным составом. Протеаза А давала различные гидрофобные низкомолекулярные (<10 кДа) пептиды, что обусловлено ее большей активностью. Воздействие протеазы В приводило к получению гидрофобных гидролизатов, содержавших повышенное количество высокомолекулярных пептидов (>10 кДа). Гидролизаты также оказались пригодными для включения в различные пищевые продукты [15]. .
При изучении гидролиза белков молочной сыворотки препаратами трипсина было установлено, что общая активность ферментного препарата в процессе реакции сначала возрастает, а затем, перейдя через максимум, снижается, что свидетельствует об образовании на первом этапе гидролиза промежуточных соединений, более активных, чем исходный препарат. Наряду с термическими эффектами и уровнем pH на скорость и максимально достижимую скорость гидролиза оказывало влияние также соотношение концентраций белка, ферментов и ионов Са2+ [15].
Сравнительные исследования гидролиза папаином и трипсином белков зерна кукурузы, сои, зеленого горошка и семян фасоли 11 сортов обнаружили сходный характер гидролиза этих белков, что объясняется авторами близкой структурой запасных семян указанных бобовых [16-20].
Как известно, для протеолитических ферментов понятия узкой и широкой специфичности становятся весьма относительными. Все они гидролизуют пептидные связи, хотя ни один из них не гидролизует все пептидные связи белковой молекулы, поэтому глубина гидролиза каждого индивидуального белка различна [1]. Это наглядно показали исследования гидролиза запасных белков арахиса пепсином, трипсином и химот-рипсином. Степень гидролиза пепсином снижалась в порядке: конарахин 1 > общий белок арахиса > арахин > конарахин 2. Для химотрипсина установлена другая последовательность: конарахин 2 > общий белок > конарахин 1 > арахин. Установлено, что добавление к белковым фракциям афлатоксина В снижает степень гидролиза белков [21].
Таким образом, проблема получения очищенных препаратов протеолитических ферментов и дальнейшего введения их в пищевые высокобелковые продукты с целью частичного гидролиза белков для повышения усвояемости организмом человека стоит достаточно остро и требует незамедлительного решения.
ЛИТЕРАТУРА ^ .(V .
1. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая пром-сть, 1971.-416 с.
2. Бейли Дж, Методы химии белков. - М.: Мир, 1965. -346 с.
3. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. - М.: ИЛ, 1950. - 346 е.
4. Полный химический синтез Д-протеазы с хиральной специфичностью обратной природной. - Пер. Sintesi chimiea totale di una D-proteasi con speciticita chirale reeiproca aguella naturale // Chim Oggi. - 1992. - 10. -№ 8-9. - P. 66.
5. Ферментные субстраты. VII. Синтез 4-метил-7-кумари-ламидов аминокислот /' З.Ф. Тетере, И.А. С гракова, Д.Р. Зицанс и др. .// Изв. АН ЛатвСФ. Сер. Химия. - 1987. - № 6,- С. 728-730.
6. Влияние дегидратации на специфичность каталитически активного химотрипсина / Ю.А. Хургин, Т.Л. Перепечкина // Изв. РАН. Сер. Химия.- 1993.-№8.-С. 1503-1504.
7. Определение активности протеиназ в зерне и муке-Пер. Bestimmung der Proteinase-Activiat in Getreide und Mehl / Taufel Alfred, Emmer Ihdrid // Lebensmittelindustrie. - 1988. - 35,- № 1-S. 31-33.
8. Экстракция и определение протеолитических активностей в солоде из сорго,- Пер. Extraction and assay of proteolytic activities in sorghum malt / Evans D.J., Taylor J.R. N. // J. Inst. Brew. -1990,- 96.-№ 4.-P. 201-207.
9. Применение тетратионата для предотвращения снижения протеолитической активности папаина и латекса папайи. - Пер. Tetrathionate Protects Proteolytic Activity of simulated papaya latex and crude papain/Arteaga G.E., Nakai S. Hi. Food Sci. —1990. -55,-№6. -P. 1728-1731.
10. Иммобилизация протеазы на пористых шариках хитоза-на. - Пер. Protease immobiliration onto porous chitosan beans / Hayashi Toshio, Ikada Yoshito // J. Appl. Polym. Sci. - 1991. -42. -№ 1. -P. 85-92.
11. Разработка методики определения протеолитической активности, основанной на лечении нерадиоактивным йодом. - Пер. Development of a non-radioactive iodine label-based, method for the determination of proteolitic activity / Keating P., Anderson F., Donnelly G., О’Kennedy R. // Analyst. - 1991. -116 .-№2. - P. 165-166.
12. Новый метод определения протеаз из психотрофных микроорганизмов,- Пер. New assay for psychrofroph proteases / Powe
Michail, Pearce Jack, Crone Lisbeth//Dairy Ind. Int. - 1990—1991. — 55.— №12.-P. 35,37.
13. Грищенкова А.Б., Бовыкина B.C., Сажинов Ю.Г.
Влияние магнитного поля на протеолитическую активность ренина и пепсина // Современные технологии сыроделия и безотходной переработки молока: Материалы Всесоюз. науч.-техн. конф., Ереван, 14-16 ноября, 1988. - Ереван, 1989.-С. 129-130.
14. Ферментный иммунный анализ каталитически активных протеаз. - Пер. An enzyme Emmunoassay of cafalicaly active profeases / Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Valueva T.A., Mosolov V.V. // Anol. Left.-1992.-25.-№12.-P. 2199-2208.
15. Влияние дезактивирования трипсина на гидролиз белков молочной сыворотки. - Пер. Einflub der Trypsin-Desaktivierung auf die Hydrolyse von Molkeproteins / Margot A., Richoz C., Flaschel E., Renken A. // Chem.-Ing.-Techn. - 1992. - 64. - № 6. - P. 551-553.
16. Изучение свойств белковых фракций из соевых бобов и гороха. - Пер. Characterization of soy-and pea protein fractions / HorvathE., Ormai-CserhalmiZs. // Actaalim. - 1988. - 17,- №4,-P. 376.
17. Перевариваемость in vitro белков зрелых бобов (Phaseolus vulgaris L.). Роль термостабильных ингибиторов протеаз. - Пер. In vitro digestibolity of dry bean (Phaseolus vulgaris L.) proteins: The role of heat-stable protease inhibitors / Deshpande S.S., Nielsen S.S. //J. Food Sci.- 1987,- 52.-№5.-P. 1330-1334.
18. Ферментативный гидролиз in vitro фазеолина - основного запасного белка бобов. - Пер. Phaseolus vulgaris L. in vitro enzymatic hydrolysis ofPhaseolin, the hajor storage protein of Phaseolus vulgaris L. / Deshpande S.S., Nielsen S.S. - Ibid. - P. 1326-1329.
19. Ферментативный гидролиз белков кукурузы. - Пер. Enzymatic hydrolysis of maize protein / Behnke U., Jurisova E., Beleyova E., Burianek J., Haas I. // Acta alim. - 1988. - 17,-№ 4. - P. 374.
20. Исследование гидролиза папаином некоторых белков / Tran Dinh Toai, Do Ngos Lanh, Nguyen Thu Hoai // Tap chi hoa hoc J. Chem. - 1994. - 32. - № 4. - P. 33-36.
21. Влияние протеаз на арахин, конарахин I и конарахин II из арахиса (Arachis Hypogala L.) - Пер. Effect of proteases on arachin, conarachin I, and conarachin II from peanut (Arachis hypogala L.) / Monteiro P. Vincent, Prakash V. // J. Arg. and food Chem. -1994. - 42. -№2.-P. 268-273.
Кафедра биохимии и технической микробиологии
Поступила 26.11.01 г.
