CC BY
76
УДК 577.151.02
Изучение возможности применения комплекса энзиматических систем при переработке концентрата сывороточных
белков
Шевякова Ксения Александровна, аспирант
e-mail: ks_shevjakova@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное общеобразовательное учреждение высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)»
Курбанова Марина Геннадьевна, доктор технических наук, доцент, профессор
e-mail: kurbanova-mg@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение выс-
I у- V/ U U
шего образования «Кемеровский государственный сельскохозяйственный инсти-
Аннотация. В современных условиях возрастает роль технологий, ориентированных на применение белоксодержащих добавок, в частности гидролизатов сывороточных белков. Это связано с повышенным расходованием аминокислот на энергетические и пластические потребности, а также с высокой биологической активностью ряда аминокислот, которые стимулируют анаболизм, иммунную систему, обмен веществ. В работе рассмотрен процесс ферментативного гидролиза сывороточных белков протеолитическими препаратами. При применении энзиматических систем, в ходе проведенных исследований отмечено увеличение массовой доли свободных коротких пептидов и аминокислот.
Ключевые слова: сывороточный белок, протеолитические ферменты, гидро-лизаты, пептиды, аминокислоты.
Введение. В настоящее время во всех развитых странах мира имеются крупные специализированные фирмы занимающиеся выпуском продуктов функционального назначения. Многие научные коллективы продолжают углубленные исследования по созданию новых и усовершенствованию существующих продуктов для питания детей, подростков, пожилых людей, спортсменов и других групп населения [7].
Новые формы белковой пищи - это продукты питания, получаемые на основе различных фракций белка продовольственного сырья с применением научно-обоснованных способов переработки и имеющие определенный химический состав, структуру и свойства [9]. Высокая пищевая и биологическая ценность гидролиза-тов молочных белков, их функциональные свойства и возможность использования в составе различных пищевых продуктов обусловливают актуальность создания новых технологий их переработки [8, 12].
Тенденция сегодняшнего времени показывает существенные отклонения в структуре питания современного человека как в количественном, так и в качественном отношении. Качественный аспект проблемы связан с недостатком в рационе полноценного белка [11]. Перспективный путь решения проблемы дефицита белка - производство пищевых продуктов, обогащенных белоксодержащими компонентами, позволяющих не только удовлетворить энергетические и питательные потребности человека, но также оказывать многостороннее действие на его организм [13].
В связи с этим внимание ученых приковано к изучению свойств сывороточных белков, представляющих собой группу различных фракций глобулярных белков, отличающихся друг от друга по структуре [5]. Благодаря уникальным функциям сывороточных белков и их превосходству по аминокислотному составу перед другими белковыми соединениями животного и растительного происхождения, они представляют собой большой практический интерес [3].
С внедрением безотходных технологий и необходимостью обеспечения безвредности производств популярны способы деструкции пищевых отходов молочной промышленности с помощью специфических ферментов протеолитической природы [2, 6]. Применение протеолитических ферментных препаратов позволяет получить высокобелковые продукты, максимально сохраняющие полный набор аминокислот, путем гидролиза концентратов сывороточных белков, полученных различными способами. Для пищевых целей немаловажными являются органолеп-тические свойства получаемых продуктов, но основным требованием при использовании белковых гидролизатов в различных областях является сбалансированность по аминокислотному составу [4].
Для гидролиза концентратов сывороточных белков используется широкий спектр эндо- и экзопротеаз, среди которых можно выделить ферменты микробного (алкалаза, нейтраза, термолизин и др.), животного (пепсин, трипсин, химотрипсин и др.) и растительного (папаин, бромелаин, фицини др.) происхождения [1, 10].
Несмотря на существующий ассортиментный перечень, вопрос подбора комплекса ферментных препаратов, позволяющих получить гидролизаты с высокой степенью гидролиза, и параметров процесса гидролиза остается актуальным и посей день.
Объекты и методы исследований. Основным объектом исследования являлись образцы концентрата сывороточных белков по ГОСТ Р 53456-2009, полученные с помощью ультрафильтрации, с массовой долей белка 55%. Для проведения гидролиза сывороточных белков в качестве ферментного комплекса были выбраны
энзимы с экзо- и эндопротеолитической активностью .
Ферментативное расщепление сывороточных белков осуществляли при температуре реакционной среды 45±2 0С, и рН 6,5±0,1 и постоянном помешивании. Данные параметры реакционной среды являются оптимальными для используемого комплекса ферментов, рекомендованные фирмой изготовителя. Гидролиз проводили в течение 24±0,5 ч, при соотношении концентрации комплекса ферментных препаратов к концентрации белка субстрата 1:100. Во избежание развития микрофлоры и появления неприятного запаха в колбы до начала процесса вводили 0,5%-ный толуол, который в заключительной стадии процесса - инактивации (температура 92±2 0С, продолжительность 5±0,5 мин) ферментного комплекса полностью испарялся.
Степень гидролиза определяли как отношение аминного азота к общему азоту, выраженное в процентах.
Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов в получаемых ги-дролизатах оценивали с помощью белкового электрофореза методом Лэмли в по-лиакриламидном геле (ПААГ).
Определение аминокислот проводили с помощью автоматического анализатора аминокислот Aracus PMA GmbH, утвержденного директивами 98/64/ЕС и 2000/45/ЕС.
Результаты и их обсуждение. Углубленное изучение физико-химических и биокаталитических свойств препаратов протеолитической природы указывает на перспективность при воздействии на белковые субстраты животного происхождения. Однако, учитывая гетерогенность и сложность строения животных белков, следует провести исследование действия ферментного препарата на реальный концентрат сывороточных белков.
Степень расщепления белка в гидролизате определяется посредством показателя «степень гидролиза», которая показывает, какая часть пептидных связей белка расщеплена. Количество расщепленных белковых субстратов прямо пропорционально продолжительности ферментативного процесса. Поэтому на данном этапе исследования осуществляли анализ процесса гидролиза пептидных связей молекул сывороточных белков при воздействии комплекса ферментных препаратов.
Применение комплекса состоящего из экзо- и эндопептидаз является щадящим и рациональным способом гидролиза белков по сравнению с кислотным или щелочным гидролизом.
В качестве эндопептидазы использовали бромелайн (КФ 3.4.22.32(33)), эк-зопептидаз - карбоксипептидазу А (КФ 3.4.17.1) и лейцинаминопептидазу (КФ 3.4.1.1) при равноколичественном соотношении 1:1:1, с целью создания условий для равномерного получения пептидных продуктов реакции и их распределения [8]. Гидролиз вели при температуре 45±2 0С в течение (4 - 24) ± 0,05 ч.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32(33)) - протеолитический растительный фермент, смесь протеаз, полученная из растений семейства бромелиевые, в том числе из ананаса, расщепляющих белки. Бромелайн представляет собой смесь высокомолекулярных гликопротеинов, в активном центре которых находится аминокислота цистеин. Молекула исходного бромелайна содержит 242 аминокислотных остатка. По действию сходен с пепсином и трипсином, растворим в воде. Бромелайн активен как в кислой, так и в щелочной среде: рН оптимум для цельного экстракта бромелайна - 4,5-9,8; рН оптимум для фракций, составляющих более 50% экстракта, - 4,5-5,5; рН оптимум для наиболее активной фракции бромелайна - около 7,0.
Температурный оптимум - 30-35 0С, инактивация фермента происходит при 65 0С.
В качестве экзопептидаз использовали карбоксипептидазу А и аминопептида-зы. Карбоксипептидаза А (КФ 3.4.17.1) представляет собой белок, состоящий из 307 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 344000 кДа. Карбоксипептидаза А отщепляет все С-аминокислотные остатки от пептидов, за исключением лизина, аргинина, пролина и гидроксипролина, катализируя в основном ароматические и алифатические аминокислоты.
В качестве аминопептидаз использовали лейцинаминопептидазу. Лейцина-минопептидаза (КФ 3.4.1.1) не обладает строгой субстратной специфичностью и гидролизует пептидные связи, образованные любой ^концевой аминокислотой. Оба фермента осуществляют ступенчатое отщепление аминокислот от Оконца полипептидной цепи. Из литературных данных известно, что оптимальными параметрами работы карбоксипептидазы А и аминопептидаз являются температура 50 ± 2 0С и рН 7,5 ± 0,05.
При постановке ряда экспериментов был проведен ферментный гидролиз концентрата сывороточных белков со следующими параметрами: активная кислотность рН 6,5±0,2, при усредненной температуре для данного комплекса 45±2 0С, фермент-субстратном соотношении 1:100.
Результаты исследования предоставлены в таблице 1.
Таблица 1. Степень гидролиза концентрата сывороточных белков ферментным комплексом, состоящим из
эндо-и экзопептидаз
Показатель Продолжительность гидролиза, ч
4±0,05 8±0,05 16±0,05 24±0,05
Степень гидролиза, % 18,54±0,8 34,59±1,7 58,84±1,9 76,19±2,1
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что в период времени от 4 до 24 ч наблюдается выраженное возрастание степени гидролиза в белковой системе. По истечении 24 ч достигнута наибольшая степень гидролиза полипептидной цепи концентрата сывороточных белков при использовании ферментативного комплекса, с одновременным накоплением свободных аминокислот и пептидов и составила 76,19±2,1 %, при продолжительности гидролиза 16 ч расщепление белковых соединений концентрата сывороточных белков произошло на 58,84±1,9 %, что можно учитывать при получении коротких пептидов. По истечении более 24 ч значительных изменений не происходило, гидролиз практически прекращался при данных условиях. В результате анализа представленных данных можно сделать вывод о том, что продолжительность как фактор процесса позволяет не только вовлекать в процесс новые молекулы белка с тем же распределением пептидных продуктов реакции, но и влиять на увеличение массовой доли свободных аминокислот в гидролизатах, получаемых за счет действия энзиматических систем, в состав которых входят эндо- и экзопептидазы.
Кроме этого установлено, что с изменением продолжительности ферментного гидролиза происходит изменение молекулярно-массового распределение белков и пептидов, а также повышение массовой доли свободных аминокислот в образующемся гидролизате (таблица 2).
Таблица 2. Молекулярно-массовое распределение белковых соединений в результате обработки энзимати-ческими системами при различной продолжительности процесса
Молекулярная масса, кДа
?олее 30
Продолжительность гидролиза
МасСовая доля фракций, %
5 56±0 28 _ 1-?1±0-06
16±0,05
24±0,05
1енее5
Данные молекулярно-массового распределения свидетельствуют, что при проведении процесса ферментного расщепления белковой молекулы в течение 4 и 8 ч происходит накопление белков и пептидов с молекулярной массой от 5 до 30 кДа, при этом в основном от 5 кДа и менее. При увеличении продолжительности гидролиза наблюдалось интенсивное накопление преимущественно низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. Данный факт не противоречит литературным данным и декларируемым свойствам исследуемых ферментных препаратов, входящих в состав энзиматических систем.
Основными структурными элементами белков являются аминокислоты. В оценке специфичности разрыва пептидных связей весьма важна оценка качественного набора аминокислот в гидролизатах субстрата. В таблице 3 представлена динамика накопления свободных аминокислот в процессе гидролиза энзиматическим комплексом при различной продолжительности.
Таблица 3. Динамика накопления свободных аминокислот в результате гидролиза при различной продолжительности процесса
минокислоты
I Пр
одолжительность гидролиза, ч
разец белка 4±0,05 8±0,05 16±0,05 24±0,05
1 2 3 4 5 6
I Незаменимые аминокислоты
Валин 5,63±0,33 1,23±0,06 2,29±0,11 4,27±0,21 5,26±0,26
Изолейцин 6.21±0.26 0,96±0,05 1,80±0,09 3,32±0,17 4,46±0,23
Лейцин 12,3, ±0,46 1,69±0,08 3,16±0,16 6,82±0,34 9,39±0,47
Лизин 9,12±0,33 1,21±0,06 2,25±0,11 4,72±0,24 6,10±0,31
Метионин 2,29±0,13 0,48±0,02 0,90±0,04 1,19±0,06 2,28±0,11
Треонин 5,25±0,20 0,75±0,04 1,40±0,07 1,89±0,09 2,49±0,15
Триптофан 1,32±0,07 0,25±0,01 0,46±0,02 0,66±0,03 0,95±0,05
Фенилаланин 4,58±0,23 0,85±0,04 1,58±0,08 2,61±0,13 3,25±0,16
1 Заменимые аминокислоты
Аланин 2,78±0,14 0,51±0,03 0,96±0,05 1,96±0,10 2,37±0,12
Аргинин 4,09±0,20 0,76±0,04 1,41±0,07 2,21±0,11 3,01±0,15
Аспарагиновая кислота 5,39±0,32 1,20±0,06 2,24±0,11 4,91±0,25 5,19±0,26
Гистидин 2,22±0,11 0,41±0,02 0,77±0,04 0,93±0,05 1,10±0,06
Глицин 2,09±0,13 0,50±0,02 0,93±0,05 1,12±0,06 1,72±0,09
Глутаминовая кислота 16,18±0,96 3,37 ±0,18 6,63±0,33 11,02±0,55 14,43±0,72
Пролин 9,45±0,47 1,75±0,09 3,27±0,16 4,02±0,20 5,65±0,28
Серин 6,81±0,34 1,26±0,06 2,36±0,12 3,95±0,19 4,15±0,20
Тирозин 3,86±0,29 1,09±0,05 2,03±0,10 2,96±0,15 2,99±0,15
Цистеин 0,43±0,02 0,09±0,01 0,15±0,01 0,28±0,01 0,60±0,03
Всего 100±5,0 18,36±1,8 35,16 ±1,7 58,44±1,9 75,39±1,8
Из данных, представленных в таблице, видно, что обработка концентрата сывороточных белков энзиматическим комплексом способствует накоплению массовой доли свободных аминокислот. Исследованиями аминокислотного состава выявлено 18 аминокислот, в том числе и незаменимые аминокислоты, которые определяют ценность полученного гидролизата. При этом динамика накопления незаменимых аминокислот в образцах различна. Так отмечалось максимальное содержание лей-
цина, валина и лизина их содержание составило 9,49±0,47 %, 5,26±0,26 % и 6,20±0,31 % соответственно, после 24 ч гидролиза. Также в образцах отмечено наличие изолейцина, метионина, треонина, триптофана, фенилаланина. В составе заменимых аминокислот преобладает глутаминовая кислота. Содержание ее колеблется от 3,55±0,18 % до 14,43±0,72 % в зависимости от продолжительности проведения гидролиза. Наименьшее накопление наблюдается аминокислоты цисте-ина, количество которой варьировалось в образцах 0,09±0,01 % до 0,60±0,03%.
Выводы. Использование ферментных технологий во многом определяет успех развития большого числа современных отраслей экономики, в том числе и пищевой промышленности. Создание и внедрение инновационных технологий позволяет в значительной степени расширить сферу применения ферментных препаратов. Ферментативный гидролиз концентрата сывороточных белков приобретает важное значение в связи с возможностью создания на его основе различных белковых добавок и гидролизатов пищевого значения. При ферментативном гидролизе максимально сохраняется питательная ценность получаемых продуктов, значительно повышаются их растворимость и усвояемость.
Как свидетельствуют полученные данные, применение ферментативного гидролиза комплексом энзимов оказывает значительное влияние на изменение молекулярно-массового распределение белков и пептидов, а также способствует повышению массовой доли свободных коротких пептидов и аминокислот в полученных гидролизатах.
Список литературных источников:
1. Алибеков, Р.С. Молочная сыворотка и концентрат сывороточных белков / Р.С. Алибеков, К.А. Турлыбекова // Известия Кыргызского государственного технического университета им. И. Раззакова. - 2016. - Т. 37. - С. 208-212.
2. Антипова, Л.В. Инновационное применение ферментных препаратов для переработки животноводческого сырья / Л.В. Антипова, М.В. Горбунков // Инновационное развитие техники пищевых технологий: материалы международной научно-технической конференции. - 2015. - С. 55-61.
3. Банникова, А.В. Молочные продукты, обогащенные сывороточными белками технологические аспекты создания / А.В. Банникова, И.А. Евдокимов // Молочная промышленность. - 2015. - № 1.- С. 64-66.
4. Волкова, Т.А. Роль растворимых концентратов сывороточных белков в создании продуктов здорового питания / Т.А. Волкова // Международная научно-практическая конференция, посвященная памяти Василия Матвеевича Горбатова. - 2014. - № 1. - С. 41-42.
5. Вторичное сырье молочной отрасли: современное состояние и перспективы использования / М.Б. Ребезов, О.В. Зинина, Г.Н. Нурымхан, А.Н. Нургазезо-ва, Ф.Х. Смольникова // АПК России. - 2016. - Т. 75. - № 1. - С. 150-155.
6. Ельчанинов, В.В. Некоторые технологические аспекты получения сывороточных белков коровьего молока / В.В. Ельчанинов // Молочная промышленность. - 2015. - № 12. - С. 46-49.
7. Зилова, И.С. Белковые компоненты в специализированных пищевых продуктах для питания спортсменов / И.С. Зилова // Вопросы питания. - 2014. Т. 83. - № 83. - С. 133.
8. Курбанова М.Г. Исследование закономерностей получения кислотных гидролизатов казеина / М.Г. Курбанова, С.М. Масленникова, О.Н. Бондарчук
// Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2013. -№12. (110). - С. 32-38.
9. Направленный ферментолиз белков молочной сыворотки / Берёзкина К.А., Агаркова Е.Ю., Будрик В.Г., Харитонов В.Д., Королёва О.В., Николаев И.В., Просеков А.Ю., Коржов Р.П. // Переработка молока. - 2014. - №7(178). - С. 20-22.
10. Особенности ферментативного гидролиза молочного белкового концентрата эндо и экзопептидазами / О.В. Бессонова, О.О. Бабич, Г.В. Борисова, И.Е. Драгунов // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2013. - № 1. - С. 33-35.
11. Просеков, А.Ю. Исследование состава и свойств белков животного происхождения биологических объектов и молочных продуктов многокомпонентного состава / А.Ю. Просеков, А.В. Позднякова // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. - 2014. - № 8. - С. 101-107
12. Храмцов, А.Г. Белковые продукты из молочной сыворотки / А.Г. Храм-цов // Переработка молока. - 2011. - № 1.- С. 18-21.
13. Храмцов, А.Г. Инновации в переработке и использовании молочной сыворотки / А.Г. Храмцов // Переработка молока. - 2014. - № 2 (173). - С. 68-69.
References:
1. Alibekov, R. S. Whey and whey protein concentrate. Izvestiya Kyrgyzskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo universiteta im. I.Razzakova [News of the Kyrgyz State Technical University named after I. Razzakov], 2016, no. 37, pp. 208-212. (in Russian)
2. Antipova, L. V. Innovative application enzyme preparations for processing animal raw materials. Trudy mezhdunarodnoj nauchno-tekhnicheskoj konferencii "Innovacionnoe razvitie tekhniki pishchevyh tekhnologij". [Proc. of the international scientific-technical conference "Innovative development of technology food technology"]. 2015, pp. 55-61.
3. Bannikova, A. V. Dairy products enriched with whey proteins technological aspects of creating. Molochnaya promyshlennost'. [Dairy industry], 2015, no. 1, pp. 64-66. (in Russian)
4. Volkova, T. A. The role of soluble whey protein concentrates in creating healthy food. Mezhdunarodnaya nauchno-prakticheskaya konferenciya, posvyashchennaya pamyati Vasiliya Matveevicha Gorbatova. [International scientific-practical conference dedicated to the memory of Vasily Matveevich Gorbatov], 2014, no. 1, pp. 41-42. (in Russian)
5. Secondary raw materials the dairy industry: current status and prospects. APK Rossii. [Agrarian and industrial complex of Russia], 2016, T. 75, no. 1, pp. 150155. (in Russian)
6. El'chaninov, V. V., Some technological aspects of obtaining whey proteins of cow's milk. Molochnaya promyshlennost'. [Dairy industry], 2015, no. 12, pp. 46-49. (in Russian)
7. Zilov, I. S. Protein components in specialized food products for sportsmen nutrition. Voprosy pitaniya. [Questions of nutrition], 2014, T. 83, no.83, P. 133. (in Russian)
8. The study of the regularities of obtaining the acid hydrolysates of casein. Vestnik
Altajskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. [Bulletin of Altai State Agrarian University], 2013, no. 12 (110), pp. 32-38. (in Russian)
9. Directed enzymatic hydrolysis of whey proteins. Pererabotka moloka. [Processing of milk], 2014, no. 7(178), pp. 20-22. (in Russian)
10. Features of the enzymatic hydrolysis of milk protein concentrate endo and ectopeptidases. Hranenie i pererabotka sel'hozsyr'ya. [Storage and processing of agricultural products], 2013, no. 1, pp. 33-35. (in Russian)
11. Prosekov, A. Y. Study of the composition and properties of proteins of animal origin of biological objects, and dairy products multicomponent composition. Vestnik Krasnoyarskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. [Bulletin of Krasnoyarsk State Agrarian University], 2014, no. 8, pp. 101-107 (in Russian)
12. Khramtsov, A. G. Protein products from whey. Pererabotka moloka. [Processing of milk], 2011, no. 1, pp. 18-21. (in Russian)
13. Khramtsov, A. G. Innovations in processing and use of whey. Pererabotka moloka. [Processing of milk], 2014, no. 2 (173), pp. 68-69. (in Russian)
Study of the possibility of using a complex of enzymatic systems for the processing of whey protein concentrate
Shevyakova Ksenia Alexandrovna, graduate student
e-mail: ks_shevjakova@mail.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
Kurbanova Marina Gennadjevna, Doctor of Science (Engineering), Professor, Head of Department of Technology of storage and processing of agricultural products,
e-mail: kurbanova-mg@mail.ru
Federal State Budget Educational Institution for Higher Professional Education Kemerovo State Agricultural Institute
Abstract. In modern conditions the role of technologies focused on the use of protein-containing additives, in particular hydrolysates of whey proteins, is growing. This is due to increased consumption of amino acids for energy and plastic needs, as well as high biological activity of several amino acids that stimulate anabolism, immune system, metabolism. The article considers the process of enzymatic hydrolysis of whey proteins with proteolytic preparations. In the application of enzymatic systems, in the course of studies was noted an increase in the mass fraction of free short peptides and amino acids.
Keywords: whey protein, proteolytic enzymes, hydrolysates, peptides, amino acids.
